專利名稱：用于果汁中耐熱菌雙抗體夾心elisa檢測試劑盒的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品微生物檢測領(lǐng)域，具體涉及到果汁中耐熱菌雙抗體夾心ELISA快速檢測所用的試劑盒的制備方法或應(yīng)用。
背景技術(shù)：
耐熱菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)在高溫或不利環(huán)境中可以形成芽孢，具有很強(qiáng)的耐熱性，能夠耐受果汁加工中的巴氏殺菌過程以芽孢的形式存在于果汁中，是引起濃縮蘋果汁變質(zhì)的主要微生物之一，耐熱菌超標(biāo)也是蘋果汁生產(chǎn)企業(yè)最急需解決的問題。
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目前，生產(chǎn)企業(yè)多采用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法檢測耐熱菌，平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法主要包括美國KFL方法(美國庫克實(shí)驗(yàn)室法)和澳大利亞Berri公司方法。KFL方法主要是采用濾膜過濾，將耐熱菌截留在濾膜上，再將濾膜置于培養(yǎng)基上培養(yǎng)計(jì)數(shù)，此法檢測周期一般為4 5天，在實(shí)際生產(chǎn)中無法滿足耐熱菌的實(shí)時檢測。也有用PCR法，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測耐熱菌，其具有快速、特異的優(yōu)點(diǎn)，但該方法對設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室條件及環(huán)境要求高，實(shí)驗(yàn)操作步驟較繁鎖，且假陽性較難控制，限制了 PCR檢測法的推廣應(yīng)用。為此發(fā)明人所在的課題組曾提出了耐熱菌的ELISA快速檢測方法，已申請了中國專利，專利申請?zhí)柗謩e為200910022897. 7和201010249781. X，該方法具有特異性高，操作簡便，重復(fù)性好等特點(diǎn)，檢測限可滿足蘋果濃縮汁中耐熱菌不超過I個/ IOmL的國際標(biāo)準(zhǔn)，操作過程可在20小時內(nèi)完成，達(dá)到快速檢測的效果。但是這種方法在實(shí)施耐熱菌的ELISA檢測時，首先要制備抗體，包被酶標(biāo)板，檢測時間較長?？贵w和酶標(biāo)板制備對檢測結(jié)果的可靠性很關(guān)鍵，也是實(shí)現(xiàn)ELISA檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如能將抗體和酶標(biāo)板提前制備成試劑盒，成為進(jìn)一步研究的重要課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的耐熱菌的ELISA檢測方法所存在的不足，提供了一種能抗體和酶標(biāo)板提前制備成試劑盒，操作簡單，能夠?qū)崿F(xiàn)ELISA檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化的用于果汁中耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的制備方法。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題在于提供利用上述的制備方法所制備的用于果汁中耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的新的檢測方法。本發(fā)明解決技術(shù)問題的技術(shù)方案是用于果汁中耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的制備方法包括以下步驟(I)耐熱菌兔源多克隆抗體包被酶標(biāo)板用濃度為0. 05mol / L、pH值為9. 6的碳酸緩沖液將耐熱菌兔源多克隆抗體溶液稀釋至濃度為4. 8 5. 2 ii g / mL,加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔加100 u L,置于恒溫培養(yǎng)箱37°C孵育I. 9 2. I小時，將吐溫-20與濃度為0. Olmol / L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液按照體積比為I : 1900 2200混合配制成洗液，用洗液沖洗酶標(biāo)板2 3分鐘，重復(fù)沖洗3 5次，拍干酶標(biāo)板；(2)封閉酶標(biāo)板向步驟(I)拍干的酶標(biāo)板的每個孔內(nèi)加入IOOy L的封閉液，置于恒溫箱中37°C保溫封閉90 150分鐘，取出，用步驟(I)配制的洗液沖洗酶標(biāo)板2 3分鐘，重復(fù)沖洗3 5次，拍干，得到封閉的酶標(biāo)板；(3)試劑盒包裝
將封閉的酶標(biāo)板用鋁箔袋真空包裝，得到耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒；上述的封閉液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% 5%的明膠溶液或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% 5%的牛血清蛋白溶液或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1% 0. 5%的脫脂奶溶液。上述封閉液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3. 8% 4. 2%的明膠溶液。利用上述制備的試劑盒進(jìn)行果汁中的耐熱菌的雙抗體夾心ELISA檢測方法，包括以下步驟(I)將經(jīng)過滅菌處理的果汁樣品作為陰性樣品與待測果汁樣品按照每孔IOOy L的量分別加入上述制備的試劑盒的酶標(biāo)板孔中，置于恒溫箱中37°C保溫50 150分鐘后取出，將吐溫-20與濃度為0. Olmol / L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液按照體積比為I :1900 2200混合配制成洗液，用洗液沖洗酶標(biāo)板2 3分鐘，重復(fù)沖洗3 5次，拍干酶標(biāo)板；(2)將濃度為0. Olmol / L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為0. 3mg / mL的耐熱菌鼠源多克隆抗體溶液按照體積比為I :190 220混合，加入步驟(I)的拍干后的酶標(biāo)板中，每孔IOOii L，置于恒溫箱中37°C孵育50 150分鐘后取出，用步驟(I)中配制的洗液沖洗酶標(biāo)板2 3分鐘，重復(fù)沖洗3 5次，拍干酶標(biāo)板；(3)將濃度為0. 01mol/L、pH值為7. 6的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為0. 8mg/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠抗體溶液按照體積比為I :2500 11000混合，加入步驟(2)拍干的酶標(biāo)板板孔中，每孔IOOy L，將其置于恒溫箱中37°C孵育50 120分鐘后取出，用步驟(I)配制的洗液沖洗酶標(biāo)板2 3分鐘，重復(fù)沖洗3 5次，拍干酶標(biāo)板；(4)向步驟(3)的拍干后的酶標(biāo)板板孔內(nèi)加入底物工作液，每孔IOOii L，在恒溫箱中37°C避光反應(yīng)15 20分鐘，加入50 u L濃度為2mol / L的硫酸溶液終止反應(yīng)；(5)用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定步驟(4)反應(yīng)終止酶標(biāo)板的分光光度值，與步驟(I)的陰性樣品的cut off值進(jìn)行比較，確定待測果汁樣品中耐熱菌的存在，樣品分光光度值大于cut off值，為陽性，表明樣品中存在耐熱菌，樣品分光光度值小于cut off值，為陰性，表明樣品中無耐熱菌，cut off值按下式計(jì)算Cutoff = X+2xSD式中文表示陰性樣品OD45tl的平均值，SD表示陰性樣品OD45tl的標(biāo)準(zhǔn)差，OD45tl是波長為450nm下的分光光度值。上述步驟(2)中將濃度為0. Olmol / L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為0. 3mg / mL的耐熱菌鼠源多克隆抗體溶液按照較佳體積比為I :195 210混合,加入步驟
(I)的拍干后的酶標(biāo)板中。上述步驟(3)中將濃度為0. Olmol / L、pH值為7. 6的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為0. 8mg/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠抗體溶液按照較佳體積比為I :3000 6000混合，加入步驟(2)拍干的酶標(biāo)板板孔中。上述步驟(4)中的底物工作液的配制方法為取濃度為0. 2mol / L的磷酸鹽緩沖溶液和濃度為0. Imol / L的檸檬酸溶液與二蒸水混合，二蒸水與磷酸鹽緩沖溶液、檸檬酸溶液的體積比為I :0. 514 :0. 486，配制成底物緩沖液；再將固液比為0. OOlg / mL的3，3-,5, 5’-四甲基聯(lián)苯胺乙醇溶液與底物緩沖液以體積比為I :1混合，配制成混合溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2溶液，混合溶液與H2O2溶液的體積比為I :0. 002，搖勻，即配制成底物工作液。上述的兔源多克隆抗體制備采用王峰，李建科等人報道的《蘋果濃縮汁中嗜酸耐 熱菌多克隆抗體的制備及純化》(食品與發(fā)酵工業(yè)，2009年第35卷第4期，33-36頁)的方法。上述的鼠源多克隆抗體采用名稱為《耐熱菌鼠源多克隆抗體制備》，專利申請?zhí)枮?01110427711. 3的中國專利所公開的制備方法制備。本發(fā)明預(yù)先將兔源多克隆抗體包被在酶標(biāo)板上再加入封閉液封閉后用鋁箔袋真空包裝，制備成一個標(biāo)準(zhǔn)試劑盒，將抗體和酶標(biāo)板提前制備好，制備方法簡單，能夠?qū)崿F(xiàn)ELISA快速檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化，大大縮短檢測時間，使得ELISA檢測更加方便、可靠，減少了操作步驟，實(shí)現(xiàn)了關(guān)鍵環(huán)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)化，提高了檢測結(jié)果的可靠性。檢測時將該試劑盒中加入樣品中捕集的耐熱菌抗原，再加入耐熱菌鼠源多克隆抗體，形成抗體-抗原-抗體的雙抗體復(fù)合物，與酶標(biāo)抗體、底物工作液，使雙抗體復(fù)合物上的酶催化底物，再通過酶標(biāo)儀測定其分光光度值與陰性對照樣品的cut off值比較，從而判定其為陰性或陽性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)一種耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測方法，檢測時間短，檢測結(jié)果穩(wěn)定，大大提高了檢測效率。


圖I為陰性樣品的OD45tl值統(tǒng)計(jì)圖表。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例I以耐熱囷兔源多克隆抗體為檢測抗體制備用于果汁中耐熱囷雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒，其制備方法如下(I)耐熱菌兔源多克隆抗體包被酶標(biāo)板用濃度為0. 05mol / L、pH值為9. 6的碳酸緩沖液將濃度為10 U g/mL的耐熱菌兔源多克隆抗體溶液稀釋至濃度為g/mL，加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔加IOOy L，置于恒溫培養(yǎng)箱37°C孵育2小時，取ImL吐溫-20溶解于2L濃度為0. Olmol / L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，配制成體積比為I :2000的洗液，用洗液沖洗酶標(biāo)板2. 5分鐘，重復(fù)沖洗4次，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干酶標(biāo)板。(2)封閉酶標(biāo)板向步驟(I)拍干的酶標(biāo)板的每個孔內(nèi)加入100 U L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的明膠溶液作為封閉液，將酶標(biāo)板置于恒溫箱中37°C保溫封閉120分鐘，取出，用步驟I中配制的洗液沖洗酶標(biāo)板2. 5分鐘，重復(fù)沖洗4次，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，得到封閉的酶標(biāo)板。(3)試劑盒包裝將步驟(2)制備好的封閉的酶標(biāo)板用鋁箔袋真空包裝，得到用于果汁中耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒。本實(shí)施例的試劑盒可以置于冰箱中3°C 5°C保存，有效期為半年。用上述方法制備的試劑盒進(jìn)行果汁中耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒來檢測果汁中的耐熱菌，其檢測方法如下(I)將經(jīng)過滅菌處理的果汁樣品作為陰性樣品與待測果汁樣品按照每孔IOOy L的量分別加入上述制備的試劑盒的酶標(biāo)板孔中，置于恒溫箱中37°C保溫60分鐘后取出，將ImL吐溫-20與2L濃度為0. Olmol / L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液按照體積比為I : 2000混合配制成洗液，用配制的洗液沖洗酶標(biāo)板2. 5分鐘，重復(fù)沖洗4次，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干酶標(biāo)板。上述的待測果汁樣品是經(jīng)過集菌處理的，具體是以無菌操作，取IOml濃縮清汁置于15ml滅菌的試管中，再移取IOml濃縮清汁置于另一個帶有溫度計(jì)的15mL的試管中，作為溫度控制用，蓋上樣品試管的蓋子，將上述樣品試管和溫度控制試管放在水浴鍋中，當(dāng)溫度達(dá)到80±1°C，開始計(jì)時，維持13分鐘，冷卻至室溫，用IOOml的滅菌蒸餾水將熱處理過的樣品轉(zhuǎn)入滅菌容器中，搖勻。將稀釋后的樣品溶液用0. 45um的濾膜真空過濾，將濾膜放置于盛有IOOmL的402培養(yǎng)基的三角瓶中，蓋上瓶塞，放入恒溫?fù)u床中45°C，190r/min,孵育13小時為集菌后的果汁。本實(shí)施例是將集菌處理后的果汁作為被檢樣品。(2)將濃度為0. 01mol/L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為0. 3mg / mL的耐熱菌鼠源多克隆抗體溶液按照體積比為I :200混合，加入步驟(I)的拍干后的酶標(biāo)板孔中，每孔IOOii L，置于恒溫箱中37°C孵育60分鐘后取出，用步驟(I)中配制的洗液沖洗酶標(biāo)板2. 5分鐘，重復(fù)沖洗4次，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干酶標(biāo)板。(3)將濃度為0. Olmol / L、pH值為7. 6的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為0. 8mg / mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠抗體溶液以體積比為I :4000混合，加入步驟(2)拍干的酶標(biāo)板孔中，每孔IOOy L，將其置于恒溫箱中37°C孵育90分鐘后取出，用步驟(I)配制的洗液沖洗酶標(biāo)板2. 5分鐘，重復(fù)沖洗4次，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干酶標(biāo)板。(4)向步驟(3)拍干的酶標(biāo)板孔內(nèi)加入底物工作液，每孔IOOii L，在恒溫箱中37°C避光反應(yīng)18分鐘，加入50 u L物質(zhì)的量濃度為2mol / L的硫酸溶液終止反應(yīng)；上述底物工作液的配制方法為稱取7. 16g Na2HPO4W蒸餾水定容至lOOmL，配制成物質(zhì)的量濃度為0.2mol /L的磷酸鹽緩沖溶液；稱取2. Ig檸檬酸加蒸餾水定容至IOOmL,配制成物質(zhì)的量濃度為0. Imol / L的檸檬酸溶液；取25. 7mL物質(zhì)的量濃度為0. 2mol / L的磷酸鹽緩沖溶液和24. 3mL物質(zhì)的量濃度為0. Imol / L的檸檬酸溶液，加二次蒸餾水定容至IOOmL,即二蒸水與磷酸鹽緩沖溶液、檸檬酸溶液的體積比為I :0. 514 :0. 486，搖勻，配制成底物緩沖液；將0. Ig 3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺用IOOmL無水乙醇溶解，加入IOOmL底物緩沖液中，SP3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺乙醇溶液與底物緩沖液以體積比為I :1混合，再加入400 y L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2溶液，即混合溶液與H2O2溶液的體積比為I :0. 002，搖勻，配制成底物工作液，底物工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。
(5)用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定步驟(4)反應(yīng)終止的酶標(biāo)板的分光光度值，即測出酶標(biāo)板待測樣品孔的OD45tl值和酶標(biāo)板陰性樣品孔的OD45tl值，依據(jù)cut off值的計(jì)算公式Cutoff= X+2xSD其中文表示陰性樣品OD450的平均值，SD表示陰性樣品OD450的標(biāo)準(zhǔn)差，OD450是波長為450nm下的分光光度值。將待測樣品的0D450值與陰性對照樣品的cut off值進(jìn)行比較，當(dāng)樣品分光光度值大于cut off值，為陽性，表明樣品中存在耐熱菌；當(dāng)樣品分光光度值小于cut off值，為陰性，表明樣品中無耐熱菌。
實(shí)施例2以耐熱囷兔源多克隆抗體為檢測抗體制備用于果汁中耐熱囷雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒，其制備方法如下(I)耐熱菌兔源多克隆抗體包被酶標(biāo)板用濃度為0. 05mol / L、pH值為9. 6的碳酸緩沖液將濃度為10 U g/mL的耐熱菌兔源多克隆抗體溶液稀釋至濃度為4. g/mL，加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔加IOOy L，置于恒溫培養(yǎng)箱37°C孵育I. 9小時，將吐溫-20與濃度為0. Olmol / L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液按照體積比為I :1900混合搖勻，配制成洗液，用洗液沖洗酶標(biāo)板3分鐘，重復(fù)沖洗3次，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干酶標(biāo)板。(2)封閉酶標(biāo)板向步驟(I)拍干的酶標(biāo)板的每個孔內(nèi)加入100 U L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3. 8%的明膠溶液作為封閉液，將酶標(biāo)板置于恒溫箱中37°C保溫封閉90分鐘，取出，用步驟(I)中配制的洗液沖洗酶標(biāo)板3分鐘，重復(fù)沖洗3次，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，得到封閉的酶標(biāo)板。(3)試劑盒包裝與實(shí)施例I相同，得到耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒。用上述制備的用于果汁中耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒來檢測果汁中的耐熱菌，其檢測方法如下(I)將經(jīng)過滅菌處理的果汁樣品作為陰性樣品與待測果汁樣品按照每孔IOOy L的量分別加入上述制備好的試劑盒的酶標(biāo)板孔中，將其同時置于恒溫箱中37°C保溫50分鐘后取出，將吐溫-20與濃度為0. Olmol / L，pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液以體積比為I :1900混合搖勻，配制成洗液，用配制的洗液沖洗酶標(biāo)板3分鐘，重復(fù)沖洗3次，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干酶標(biāo)板，其它的操作與實(shí)施例I相同。(2)將濃度為0. Olmol / L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為0. 3mg / mL的耐熱菌鼠源多克隆抗體溶液按照體積比為I :195混合，加入步驟I的拍干后的酶標(biāo)板孔中，每孔IOOii L，置于恒溫箱中37°C孵育50分鐘后取出，用步驟(I)中配制的洗液沖洗酶標(biāo)板3分鐘，重復(fù)沖洗3次，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干酶標(biāo)板。(3)將濃度為0. Olmol / L、pH值為7. 6的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為0. 8mg / mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠抗體溶液按照體積比為I :3000混合，加入步驟(2)拍干的酶標(biāo)板孔中，每孔100 u L，將其置于恒溫箱中37 V孵育50分鐘后取出，用步驟(I)配制的洗液沖洗酶標(biāo)板3分鐘，重復(fù)沖洗3次，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干酶標(biāo)板。
(4)向步驟(3)拍干的酶標(biāo)板孔內(nèi)加入底物工作液，每孔IOOii L，在恒溫箱中37°C避光反應(yīng)15分鐘，加入50 u L濃度為2mol / L的硫酸溶液終止反應(yīng)；其它的步驟與實(shí)施例I相同。步驟5 :與實(shí)施例I相同。實(shí)施例3以耐熱菌兔源多克隆抗體為檢測抗體制備用于果汁中耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒，其制備方法如下(I)耐熱菌兔源多克隆抗體包被酶標(biāo)板用濃度為0. 05mol / L、pH值為9. 6的碳酸緩沖液將濃度為10 u g/mL的耐熱菌兔源多克隆抗體溶液稀釋至濃度為5. g/mL，加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔加IOOy L，置于恒溫培養(yǎng)箱37°C孵育2. I小時，將吐溫-20與濃度為0. Olmol / L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液按照體積比為I :2200混合配制成洗液，用該洗液沖洗酶標(biāo)板2分鐘，重復(fù)沖洗5次，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干酶標(biāo)板。(2)封閉酶標(biāo)板向步驟(I)拍干的酶標(biāo)板的每個孔內(nèi)加入100 U L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4. 2%的明膠溶液作為封閉液，將酶標(biāo)板置于恒溫箱中37°C保溫封閉150分鐘，取出，用步驟(I)中配制的洗液沖洗酶標(biāo)板2分鐘，重復(fù)沖洗5次，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，得到封閉的酶標(biāo)板。(3)試劑盒包裝與實(shí)施例I相同，得到耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒。用上述制備的用于果汁中耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒來檢測果汁中的耐熱菌，其檢測方法如下 (I)將經(jīng)過滅菌處理的果汁樣品作為陰性樣品與待測果汁樣品按照每孔IOOy L的量分別加入上述制備好的試劑盒的酶標(biāo)板孔中，將其同時置于恒溫箱中37°C保溫150分鐘后取出，將吐溫-20與濃度為0. Olmol / L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液按照體積比為I 2200混合配制成洗液，用該洗液沖洗酶標(biāo)板2分鐘，重復(fù)沖洗5次，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干酶標(biāo)板。其它的操作與實(shí)施例I相同。(2)將濃度為0. Olmol / L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為0. 3mg / mL的耐熱菌鼠源多克隆抗體溶液按照體積比為I :210混合，加入步驟(I)的拍干后的酶標(biāo)板孔中，每孔IOOii L，置于恒溫箱中37°C孵育150分鐘后取出，用步驟(I)中配制的洗液沖洗酶標(biāo)板2分鐘，重復(fù)沖洗5次，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干酶標(biāo)板。(3)將濃度為0. 01mol/L pH值為7. 6的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為0. 8mg/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠抗體溶液按照體積比值為I :6000混合，加入步驟(2)拍干的酶標(biāo)板孔中，每孔100 yL，將其置于恒溫箱中37°C孵育120分鐘后取出，用步驟(I)配制的洗液沖洗酶標(biāo)板2分鐘，重復(fù)沖洗5次，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干酶標(biāo)板。(4)向步驟(3)拍干的酶標(biāo)板孔內(nèi)加入底物工作液，每孔IOOii L，在恒溫箱中37°C避光反應(yīng)20分鐘，加入50 u L物質(zhì)的量濃度為2mol / L的硫酸溶液終止反應(yīng)；其它的操作與實(shí)施例I相同。 步驟5 :與實(shí)施例I相同。 實(shí)施例4
在上述實(shí)施例I 3的用于果汁中耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的制備方法中，在步驟(2)中的封閉液還可以用1%的明膠溶液或者是1%的牛血清蛋白溶液或者是0. 1%的脫脂奶溶液來替換。其它的步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。實(shí)施例5在上述實(shí)施例I 3的用于果汁中耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的制備方法中，在步驟(2)中的封閉液還可以用5%的明膠溶液或者是5%的牛血清蛋白溶液或者是0. 5%的脫脂奶溶液來替換。其它的步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。實(shí)施例6在上述的實(shí)施例I 5的果汁中的耐熱菌的雙抗體夾心ELISA檢測方法中，在步 驟(2)中將濃度為0. Olmol / L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為0. 3mg / mL的耐熱菌鼠源多克隆抗體溶液按照體積比為I :190混合，加入步驟(I)的拍干后的酶標(biāo)板孔中，每孔IOOii L，本步驟其它的操作與相應(yīng)的實(shí)施例相同。在步驟(3)中將濃度為0. Olmol /L pH值為7. 6的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為0. 8mg/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠抗體溶液按照體積比值為I :2500混合，加入步驟(2)拍干的酶標(biāo)板孔中，每孔100 y L，本步驟中其它的操作與相應(yīng)的實(shí)施例相同。其它的步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同，確定待測果汁樣品中耐熱菌的存在。實(shí)施例I在上述的實(shí)施例I 5的果汁中的耐熱菌的雙抗體夾心ELISA檢測方法中，在步驟(2)中將濃度為0. Olmol / L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為0. 3mg / mL的耐熱菌鼠源多克隆抗體溶液按照體積比為I :220混合，加入步驟(I)的拍干后的酶標(biāo)板孔中，每孔IOOii L，本步驟其它的操作與相應(yīng)的實(shí)施例相同。在步驟(3)中將濃度為0. Olmol /L pH值為7. 6的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為0. 8mg/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠抗體溶液按照體積比值為I :11000混合，加入步驟(2)拍干的酶標(biāo)板孔中，每孔IOOii L，本步驟中其它的操作與相應(yīng)的實(shí)施例相同。其它的步驟與相應(yīng)的實(shí)施例相同。為了確定本發(fā)明檢測步驟中的各最佳條件，發(fā)明人進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)室研究試驗(yàn)，每種實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為三次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，各種試驗(yàn)情況如下試驗(yàn)材料與試劑濃縮蘋果汁pH值3. 5 4. 5，可溶性固形物含量為71 ±1° Brix，由陜西阿果安娜果汁股份有限公司提供；HRP酶標(biāo)山羊抗大鼠抗體Jackson ImmunoResearch進(jìn)口分裝；TMB (3，3’5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)=OURchem ;弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司；SDS-PAGE低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Fermentas進(jìn)口分裝；考馬斯亮藍(lán)R250 :USB進(jìn)口分裝；溴酹藍(lán)Sigma進(jìn)口分裝；TEMED (四甲基乙二胺):Sigma進(jìn)口分裝；過硫酸銨(AP) :Amresco進(jìn)口分裝；SDS (十二烷基硫酸鈉)=Sigma進(jìn)口分裝；甲叉雙丙烯酰胺AmreSC0進(jìn)口分裝；丙烯酰胺Amresco進(jìn)口分裝；巰基乙醇Amresco進(jìn)口分裝；明膠Sigma進(jìn)口分裝；牛血清白蛋白AmresC0進(jìn)口分裝；脫脂奶完達(dá)山牌脫脂奶粉。其它試劑均為分析純。供試菌種耐熱菌標(biāo)準(zhǔn)菌株Alicyclobacillusacidoterrestris DSMZ 3922,購自德國微生物菌種保藏中心，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。大腸桿菌(Escherichia coli ATCC8739)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis ATCC6633)、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus ATCC11778)、黑曲霉(Aspergillus niger ATCC 16404)及金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus ATCC6538)由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。實(shí)驗(yàn)動物SD大鼠10只，成年雄性；大耳白兔，體重2. 5±0. 25kg，購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。試驗(yàn)儀器可見分光光度計(jì)UNIC0 WFJ2000型，上海龍尼柯儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)U-3010，日本HITACHI公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱GSP-9080_MBE型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；臺式離心機(jī)TGL-16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠；超凈操作臺SW-CJ-1F，蘇凈集團(tuán)安泰公司；電熱恒溫水槽HHW-21⑶-600型，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；精密微量移液器德國 Eppendorf (10 IOOii L，0. I IOii L，30 300 iiL) ;XW_80A ·漩渦混合儀海門市其林貝爾儀器制造有限公司；超聲波清洗機(jī)KQ3200B型，昆山市超聲儀器有限公司；酶標(biāo)儀伯樂680型，美國伯樂公司；D25mm透析袋北京鼎國生物技術(shù)有限公司；Hitrap Protain G 親和層析柱，Hitrap Protain A 親和層析柱GE Healthcare ;恒流泵上海滬西分析儀器廠有限公司；電泳儀北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；垂直平板凝膠電泳槽北京六一儀器廠；微孔板振蕩器杭州奧盛儀器有限公司。I、耐熱菌兔源多克隆抗體包被酶標(biāo)板( I)確定抗體包被緩沖液分別以物質(zhì)的量濃度為0. 05mol / L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液、物質(zhì)的量濃度為0. Olmol / L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液、物質(zhì)的量濃度為0. 05mol / LpH值為8. 5的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖溶液作為耐熱菌兔源多克隆抗體包被緩沖液。檢測抗原為耐熱菌，濃度分別為I X IO8個/ mL、1父106個/ mL、1父104個/ mL，即分別為強(qiáng)陽性組、中陽性組、弱陽性組；同時設(shè)陰性對照，陰性對照分別用物質(zhì)的量濃度為0. 05mol / LpH值為9. 6的碳酸緩沖溶液、物質(zhì)的量濃度為0. Olmol / L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液、物質(zhì)的量濃度為0. 05mol / L pH值為8. 5的Tris-HCl緩沖溶液，置于37°C孵育2小時，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的物質(zhì)的量濃度為0. Olmol / L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干。按照本發(fā)明的技術(shù)方案的檢測方法進(jìn)行操作，測定OD■值，實(shí)驗(yàn)及計(jì)算結(jié)果見表I。表I不同包被緩沖液的檢測結(jié)果
OD450 值
包彼 派----
強(qiáng)陽性組中陽性組弱陽性組 cut off值
0.05mol/LpH 為 9.6 碳酸緩沖溶液 0.804 0.118 0.066 0.0420.01mol/LpH 為 7.4 磷酸鹽緩沖溶液 0.092 0.033 0.024 0.0370.05mol/L pH 為 8.5 Tris-HCl 緩沖溶液 0.062 0.037 0.022 0.036注cut off值為測定結(jié)果判斷基線值，( 450值> cut off值為陽性，0D450值< cutoff值為陰性。
由表I可見，在強(qiáng)陽性組中，以物質(zhì)的量濃度為0. 05mol / L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液或物質(zhì)的量濃度為0. Olmol / L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液或物質(zhì)的量濃度為0. 05mol / L pH值為8. 5的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液作為耐熱菌兔源多克隆抗體包被液，OD45tl值均大于cut off值，其中，以物質(zhì)的量濃度為0.05mol / L pH值為9. 6的碳酸緩沖液作為包被液時，OD■值最大。在中陽性和弱陽性組中，以物質(zhì)的量濃度為0. 05mol /L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液為包被液，OD450值均大于cut off值。本發(fā)明選擇最佳包被液為物質(zhì)的量濃度為0. 05mol / L pH值為9.6的碳酸緩沖液。(2)確定抗體包被濃度采用方陣滴定法確定耐熱菌兔源多克隆抗體包被濃度。將耐熱菌兔源多克隆抗體稀釋至濃度為IOii g / mL,采用2倍倍比稀釋，濃度分別為IOii g / mL、5ii g /mL>2. 5 u g / mL>I. 25 u gmL>0. 625 u g / mL>0. 3125 u g / mL>0. 15625 u g / mL、
0. 078125 u g / mL,以上述抗體濃度分別包被96孔酶標(biāo)板各列，每種濃度包被一列。最后一列為空白對照。明膠封閉后，加入濃度為IO8個/ mL，5X107f/ mL，107個/ mL，5X106個/ mL，106個/ mL，5X105f/ mL，IO5個/ mL的耐熱菌菌懸液抗原，每種稀釋倍數(shù)加一行，最后一行為空白對照，按照本發(fā)明專利技術(shù)方案中檢測方法進(jìn)行檢測，比較不同抗體濃度和不同抗原濃度下的OD45tl值，同時參照空白對照組的OD■值，選擇空白值最小，而陽性值最大的孔為耐熱菌兔源多克隆抗體最佳包被濃度。實(shí)驗(yàn)及計(jì)算結(jié)果見表2。表2方陣滴定法確定抗體包被濃度
權(quán)利要求
1.一種用于果汁中耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (O耐熱菌兔源多克隆抗體包被酶標(biāo)板 用濃度為O. 05mol / L、pH值為9. 6的碳酸緩沖液將耐熱菌兔源多克隆抗體溶液稀釋至濃度為4. 8 5. 2 μ g / mL,加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔加100 μ L,置于恒溫培養(yǎng)箱37°C孵育I.9 2. I小時，將吐溫-20與濃度為O. Olmol / L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液按照體積比為I :1900 2200混合配制成洗液，用洗液沖洗酶標(biāo)板2 3分鐘，重復(fù)沖洗3 5次，拍干酶標(biāo)板； (2)封閉酶標(biāo)板 向步驟(I)拍干的酶標(biāo)板的每個孔內(nèi)加入100μ L的封閉液，置于恒溫箱中37°C保溫 封閉90 150分鐘，取出，用步驟(I)配制的洗液沖洗酶標(biāo)板2 3分鐘，重復(fù)沖洗3 5次，拍干，得到封閉的酶標(biāo)板； (3)試劑盒包裝 將封閉的酶標(biāo)板用鋁箔袋真空包裝，得到耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒； 上述的封閉液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% 5%的明膠溶液或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% 5%的牛血清蛋白溶液或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 1% O. 5%的脫脂奶溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于果汁中耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的制備方法，其特征在于所述封閉液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3. 8% 4. 2%的明膠溶液。
3.一種利用權(quán)利要求I制備的試劑盒進(jìn)行果汁中的耐熱菌的雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于包括以下步驟 (1)將經(jīng)過滅菌處理的果汁樣品作為陰性樣品與待測果汁樣品按照每孔100μL的量分別加入上述制備的試劑盒的酶標(biāo)板孔中，置于恒溫箱中37°C保溫50 150分鐘后取出，將吐溫-20與濃度為O. Olmol / L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液按照體積比為I :1900 2200混合配制成洗液，用洗液沖洗酶標(biāo)板2 3分鐘，重復(fù)沖洗3 5次，拍干酶標(biāo)板； (2)將濃度為O.Olmol / L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為O. 3mg / mL的耐熱菌鼠源多克隆抗體溶液按照體積比為I :190 220混合，加入步驟(I)的拍干后的酶標(biāo)板中，每孔100 μ L，置于恒溫箱中37°C孵育50 150分鐘后取出，用步驟(I)中配制的洗液沖洗酶標(biāo)板2 3分鐘，重復(fù)沖洗3 5次，拍干酶標(biāo)板； (3)將濃度為O.01mol/L、pH值為7. 6的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為O. 8mg/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠抗體溶液按照體積比為I :2500 11000混合，加入步驟(2)拍干的酶標(biāo)板板孔中，每孔100 μ L，將其置于恒溫箱中37°C孵育50 120分鐘后取出，用步驟(O配制的洗液沖洗酶標(biāo)板2 3分鐘，重復(fù)沖洗3 5次，拍干酶標(biāo)板； (4)向步驟(3)的拍干后的酶標(biāo)板板孔內(nèi)加入底物工作液，每孔IOOyL,在恒溫箱中37°C避光反應(yīng)15 20分鐘，加入50 μ L濃度為2mol / L的硫酸溶液終止反應(yīng)； (5)用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定步驟(4)反應(yīng)終止酶標(biāo)板的分光光度值，與步驟(I)的陰性樣品的cut off值進(jìn)行比較，確定待測果汁樣品中耐熱菌的存在，樣品分光光度值大于cut off值，為陽性，表明樣品中存在耐熱菌，樣品分光光度值小于cut off值，為陰性，表明樣品中無耐熱菌，cut off值按下式計(jì)算 Cutoff= X-2xSD式中又表示陰性樣品OD45tl的平均值，SD表示陰性樣品OD45tl的標(biāo)準(zhǔn)差，OD450是波長為450nm下的分光光度值。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的果汁中的耐熱菌的雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于所述步驟(2)中將濃度為O. Olmol / L、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為O. 3mg / mL的耐熱菌鼠源多克隆抗體溶液按照體積比為I :195 210混合，加入步驟(I)的拍干后的酶標(biāo)板中。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的果汁中的耐熱菌的雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于所述步驟(3)中將濃度為O. Olmol / L、pH值為7. 6的磷酸鹽緩沖溶液與濃度為O. 8mg/mL的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠抗體溶液按照體積比為I :3000 6000混合，加入步驟(2 )拍干的酶標(biāo)板板孔中。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的果汁中的耐熱菌的雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于所述步驟(4)中的底物工作液的配制方法為取濃度為O. 2mol / L的磷酸鹽緩沖溶液和濃度為O.Imol / L的檸檬酸溶液與二蒸水混合，二蒸水與磷酸鹽緩沖溶液、檸檬酸溶液的體積比為I :0.514 :0. 486，配制成底物緩沖液；再將固液比為O. OOlg / mL的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺乙醇溶液與底物緩沖液以體積比為I :I混合，配制成混合溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2溶液，混合溶液與H2O2溶液的體積比為I :0. 002，搖勻，即配制成底物工作液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于果汁中耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的制備方法及應(yīng)用，其是預(yù)先將兔源多克隆抗體包被在酶標(biāo)板上再加入封閉液封閉后用鋁箔袋真空包裝，制備成一個標(biāo)準(zhǔn)試劑盒，能夠?qū)崿F(xiàn)ELISA快速檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化，檢測時將該試劑盒中加入樣品中捕集的耐熱菌抗原，再加入耐熱菌鼠源多克隆抗體，形成抗體-抗原-抗體的雙抗體復(fù)合物，與酶標(biāo)抗體、底物工作液，使雙抗體復(fù)合物上的酶催化底物，再通過酶標(biāo)儀測定其分光光度值與陰性對照樣品的cut off值比較，從而判定其為陰性或陽性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)一種耐熱菌雙抗體夾心ELISA檢測方法，檢測時間短，檢測結(jié)果穩(wěn)定，大大提高了檢測效率。
文檔編號G01N33/543GK102854308SQ20121035296
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者李建科, 夏凱, 黃瑞蕊 申請人:陜西師范大學(xué)