專利名稱：糖尿病腎病早期診斷的尿液代謝標(biāo)志物測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖尿病腎病臨床診斷標(biāo)志物的測定方法，具體涉及采用氣相色譜質(zhì)譜及液相色譜質(zhì)譜方法檢測人尿樣中內(nèi)源性小分子，采用相對定量或絕對定量方法測定糖尿病、糖尿病腎病病人尿液中內(nèi)源性小分子，與正常人尿液內(nèi)小分子含量范圍進(jìn)行比較，作為評判依據(jù)。
背景技術(shù)：
長期以來，臨床糖尿病腎病的診斷指標(biāo)及方法主要包括尿白蛋白、血肌酐測定，這些指標(biāo)在早期變化不明顯，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。而腎組織活體雖然較為準(zhǔn)確，但對人體傷害大，不能作為糖尿病腎病的常規(guī)篩查方法。具體不足主要體現(xiàn)在 I.早期變化不明顯臨床規(guī)定尿白蛋白含量在20mg/L_200mg/L范圍內(nèi)，即屬于微量白蛋白尿，超過200mg/L即屬于腎臟重度損傷。大量研究表明，許多糖尿病腎病患者早期尿中白蛋白含量并未超標(biāo)，當(dāng)尿微量白蛋白超標(biāo)時，患者腎臟纖維化已達(dá)到不可逆程度，從而錯過治療的最佳時段。2.假陽性采用20mg/L做為臨界值時，許多尿白蛋白陰性的健康人也會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。這些假陽性結(jié)果往往是由于測試者體內(nèi)缺水，尿液濃縮導(dǎo)致的，使得糖尿病腎病的患病率被高估。3.傷害性由于微量白蛋白尿評判的不確定性，臨床上經(jīng)常將腎活檢與之相結(jié)合。但活檢對機(jī)體傷害性大，費(fèi)用昂貴，病人順應(yīng)性差，不利于臨床篩選?？傊?，目前用于糖尿病腎病診斷的臨床指標(biāo)局限性大，缺乏一種安全可靠快速的測定方法，往往使糖尿病腎病病人錯過治療的最佳時期，造成疾病發(fā)展不可逆轉(zhuǎn)的嚴(yán)重后果O機(jī)體內(nèi)源性小分子物質(zhì)組是生命活動的基礎(chǔ)，機(jī)體的功能狀態(tài)必然反映在體內(nèi)代謝組(內(nèi)源性小分子化合物總稱)上。研究表明，在疾病狀態(tài)下機(jī)體代謝功能和很多小分子化合物水平明顯異常。代謝組學(xué)可以對體內(nèi)所有小分子代謝物進(jìn)行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關(guān)系。利用合適的代謝組學(xué)檢測工具，可以檢測生物樣本中數(shù)百甚至上千個分子量小于1000的各類小分子化合物。其中GC/T0FMS對很多化合物檢測靈敏度高達(dá)10_12mol (絕對檢測限)，相對靈敏度達(dá)10_9mol/mL，而HPLC/T0FMS的檢測靈敏度則可達(dá)到10_14mol。應(yīng)用GC/T0FMS和HPLC/T0FMS，可以檢測包括氨基酸、糖醇類化合物、月旨肪酸類、脂類、小分子有機(jī)酸類、核苷和嘌呤化合物、氨類化合物、神經(jīng)遞質(zhì)等各類內(nèi)源性小分子代謝物。這類小分子物質(zhì)是機(jī)體進(jìn)行能量合成代謝分解的基礎(chǔ)，當(dāng)機(jī)體環(huán)境發(fā)生變化時，這些小分子代謝物的含量也隨之改變。因此，檢測的體內(nèi)小分子的變化可以綜合體現(xiàn)疾病早期體內(nèi)微環(huán)境的變化。目前，沒有利用代謝組學(xué)檢測手段檢測尿液中分子預(yù)測早期糖尿病腎病發(fā)生的報道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是利用代謝組學(xué)的高通量檢測及數(shù)據(jù)處理方法，鑒定并定量分析尿液中小分子化合物，用于糖尿病腎病早期診斷。為解決上述問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案，步驟包括樣品采集和處理采集臨床病人尿液和健康人尿液；按照I : 3 (尿液-甲醇)加入甲醇沉淀蛋白和提取，離心后取上清液處理后進(jìn)樣測定。樣品分析與測定用于氣相色譜-質(zhì)譜檢測的樣品先進(jìn)行干燥，隨后衍生化處理后進(jìn)樣測定。用于液相色譜-質(zhì)譜檢測的樣品可直接取離心后上清液處理后進(jìn)樣測定。數(shù)據(jù)處理與處理與代謝標(biāo)志物鑒定對檢測樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)并鑒定在正常組與疾病組之間有顯著差異的化合物，采用上述方法進(jìn)行定量檢測。本發(fā)明的有益效果 I.通過檢測糖尿病腎病早期診斷標(biāo)志物可及時發(fā)現(xiàn)糖尿病人腎臟功能的早期異常，爭取最佳治療時機(jī)，防止糖尿病腎病出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的變化。2.與臨床現(xiàn)有診斷方法相比，本方法測定尿中與代謝相關(guān)的分子，測定更加靈敏、特異性強(qiáng)，操作方便、對病人傷害性小，便于實(shí)施。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過下面的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的解釋，但并不意味著本發(fā)明僅限于此。糖尿病腎病早期診斷的尿液代謝標(biāo)志物測定方法I.實(shí)驗(yàn)方案和樣品采集30名健康人和90名糖尿病腎病患者(分早期、中期、晚期三個階段)分別測定其24小時尿微量白蛋白排泄量，糖化血紅蛋白值，血膽固醇，甘油三酯，高密度脂蛋白，低密度脂蛋白等生化指標(biāo)(表I)，按臨床標(biāo)準(zhǔn)將患者劃分為糖尿病腎病早期、糖尿病腎病中期、糖尿病腎病晚期三個階段。對照組和患者在禁食12小時后采血1ml，并收集其12小時尿液標(biāo)本。血液在37°C水浴靜置lh，3500rpm離心后收集上層血清，-80°C保存。尿液加入疊氮化鈉抑菌后，3500rpm離心后收集上清液，-80°C保存。2.樣品處理冷凍尿液在37°C水浴解凍20min，渦旋振蕩后，取30 μ I尿液加入30 μ I尿素酶溶液(295U/ml)，渦旋振蕩3min，37°C水浴溫孵lh，再加入180 μ I含有穩(wěn)定同位素13C標(biāo)記肉寇酸與氚標(biāo)記肌醇(D6)的甲醇溶液(2. 5μ g/ml)渦旋振蕩3min，4°C冰箱靜置I小時，1960(^和41離心101^11，取6(^1上清液于6(小瓶中，減壓揮干。向GC小瓶中加入30 μ I甲氧胺吡啶溶液(10mg/ml)，渦旋振蕩3min，室溫下靜置16h進(jìn)行肟化。加入30 μ I三甲基硅烷基三氟乙酰MSTFA (含I % TMCS作為催化劑)，渦旋振蕩lmin，室溫靜置Ih進(jìn)行衍生化反應(yīng)，最后再加入30 μ I外標(biāo)甲基肉寇酸酯的庚烷溶液(30 μ g/ml)，混合后GC-MS檢測。另取50 μ I尿樣加入含有穩(wěn)定同位素13C的內(nèi)標(biāo)肉寇酸的甲醇溶液(2. 5μ g/ml，200 μ I)甲醇溶液，渦旋振蕩3min，12000g和4°C離心15min，取200μ I上清液過O. 22 μ m的有機(jī)微孔濾膜后轉(zhuǎn)入進(jìn)樣品，進(jìn)行HPLC-MS檢測。3. GC/TOF-MS 測定儀器氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(GC/TOF-MS)檢測系統(tǒng)(GC =Angilent6890N氣相色譜儀，配備Angilent7683B自動進(jìn)樣器和G2614A型100位樣品進(jìn)樣盤；TOF_MS =PegasusIII，Leco, USA)。色譜條件色譜柱是DB-5石英毛細(xì)管柱(lOmXO. 18_ i. d. , J&ff Scientific,USA)，進(jìn)樣量1 μ 1，采用不分流進(jìn)樣模式；載氣氦氣；恒流速度lml/min ;程序升溫模式70°C保持2. Omin，然后以35°C /min線性勻速線性升溫至305°C，保持2. Omin。質(zhì)譜條件進(jìn)樣口溫度250°C ;清洗時間和流速lmin，20ml/min ;傳輸管溫度2500C ;離子源溫度200°C ;離子源電壓和電流_70eV，3. OmA ；MS采用全掃描方式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，MS采用全掃描方式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集；掃描范圍m/z50-800 ;掃描速度20spectra/s ；檢測電壓為-1690v。4. HPLC/TOF-MS 測定儀器高液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(HPLC/TOF-MS)檢測系統(tǒng)(HPLC 島津 Prominence UFLCXR 液相色譜儀；T0F-MS :AB SCIEX TripleT0F 5600System)。色譜條件色譜柱是C-18正相色譜柱(2. l*100mm，I. 7 μ m)，進(jìn)樣量5 μ I ;恒流速度500ul/min ;流動相A.水相(0. 1%甲酸水)，8.有機(jī)相(0. I %甲酸乙腈)；梯度洗脫條件0-3minl0% B ；3-10minl0% -55% B ；10-55min55% -95% B ；55-65min95% -55%。質(zhì)譜條件電噴霧離子化源(ESI)，正負(fù)離子分別檢測。離子源溫度500°C;掃描方式全掃描；掃描離子范圍m/z :100-1500 ;正負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓分別為120V，-120V ;錐孔電壓正負(fù)離子模式分別為30V，-30V。5.化合物鑒定與數(shù)據(jù)分析在上述檢測條件下可獲得樣品的GC-T0F/MS及HPLC-T0F/MS的總離子流圖。利用現(xiàn)有化合物譜庫如NIST、Wiley、MetabolitePilot 對樣品中的化合物進(jìn)行鑒定，獲取各鑒定化合物色譜峰峰面積，由內(nèi)標(biāo)計算各化合物在樣品中相對含量，或由相同同位素內(nèi)標(biāo)計算所得化合物的絕對含量。對各個化合物在各組(對照組、糖尿病腎病早期、糖尿病腎病中期、糖尿病腎病晚期)中相對含量進(jìn)行統(tǒng)計分析，確定在正常組與糖尿病腎病早期有顯著性差異的化合物，選擇2組間統(tǒng)計差異最大、相對誤差最小的化合物，是用于診斷早期糖尿病腎病的代謝標(biāo)志物。6.糖尿病腎病早期診斷方法本研究主要依據(jù)尿液中分子含量出現(xiàn)的顯著異常變化，確定糖尿病腎病早期診斷標(biāo)志物。采用適當(dāng)方法檢測后，采用與內(nèi)標(biāo)化合物峰面積比較方法得到各診斷標(biāo)志物相對含量，比較正常組與糖尿病腎病早期組之間差異的顯著性。GC-MS測定發(fā)現(xiàn)早期糖尿病腎病尿液中?；撬帷⒏拾彼?、庚酸、羥基乙酸顯著低于對照組，而肌醇、3-羥基丁酸顯著高于對照組(表2)。比較時可將正常組數(shù)值(內(nèi)標(biāo)校正)作為基準(zhǔn)對照，平均值設(shè)定為1，分別計算對照組、糖尿病腎病早、中、晚期各組的相對值與70%、90%置信區(qū)間，作為診斷糖尿病腎病的標(biāo)準(zhǔn)。在進(jìn)行糖尿病腎病診斷時，可由正常組樣品測定結(jié)果得到各個診斷標(biāo)志物相對含量的正常范圍，超出正常范圍、落入糖尿病腎病相對含量范圍的可以初步診斷為早期糖尿病腎病。還可以通過比較多個診斷標(biāo)志物含量，對早期糖尿病腎病進(jìn)行綜合評判。另外，也可以選擇在早期糖尿病腎病組病人尿液中相對含量出現(xiàn)相反變化趨勢的分子，計算其比值(如肌醇/庚酸、肌醇/羥基乙酸、肌醇/?；撬?，與正常人群該比值進(jìn)行比較進(jìn)行診斷。LC-MS測定發(fā)現(xiàn)早期糖尿病腎病尿液中磷脂酰膽堿(14 0/2 0)、磷脂酰膽堿(15 0/0 O)、磷脂酰膽堿(0-18 0/0-2 I)、磷脂酰膽堿(P-19 1/0 O)、磷脂酰膽堿(P-19 1/0 I)、磷脂酰甘油(16 1/16 I)、磷脂酰甘油(18 0/0 O)、磷脂酰甘油(12 0/13 O)、溶血性磷脂酰膽堿(22 2)、溶血性磷脂酰膽堿(P-16 O)、溶血性磷脂酰乙胺醇(O 0/20 2)、C18-0H硫苷脂、C19-0H硫苷脂、C24 I硫苷脂等均顯著高于對照組(表3)。將正常組數(shù)值(內(nèi)標(biāo)校正)作為基準(zhǔn)對照，平均值設(shè)定為1，分別計算對照組、糖尿病腎病早、中、晚期各組的相對值與70%、90%置信區(qū)間，作為評診斷糖尿病腎病的標(biāo)準(zhǔn)。6. 3與蛋白尿指標(biāo)變化顯著相關(guān)的分子對所檢測內(nèi)源性分子與常規(guī)臨床檢測的尿微量白蛋白(AER)指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。如表4所示，發(fā)現(xiàn)GC-MS、LC-MS檢測化合物中，糖尿病腎病病人尿液中半胱氨酸、2-羥基戊二酸、甘油-2-磷酸、5-羥色氨、正纈氨酸、苯丙氨酸、甘油酸、核糖、肌苷與AER有明顯的正相關(guān)關(guān)系(P <0.05);而0_半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯、酪氨酸、纈氨酸、5，5_ 二甲基 乙內(nèi)酰脲與AER負(fù)相關(guān)關(guān)系(P <0.05)。這些小分子與現(xiàn)用臨床常規(guī)指標(biāo)相關(guān)性較強(qiáng)，可能是糖尿病腎病診斷的替代監(jiān)控標(biāo)志物。
權(quán)利要求
1.通過測定尿液中代謝標(biāo)志物用于糖尿病腎病早期臨床診斷的方法，其特征包括以下幾個方面 a)采用人尿液作為樣本進(jìn)行檢測； b)采用甲醇等溶劑對尿中小分子進(jìn)行提??； c)采用三甲基硅烷基三氟乙酰MSTFA的方法對尿樣進(jìn)行衍生化； d)采用氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(GC/TOF-MS)、超高液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(UPLC/TOF-MS)進(jìn)行樣本分析； e)應(yīng)用SMCAP-Il軟件和偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)建立數(shù)學(xué)模型； f)從多維空間數(shù)學(xué)模型中提取參數(shù)，計算正常組和病理組之間相對距離。
g)利用儀器所檢測的信號強(qiáng)度進(jìn)行相對定量，或者利用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行絕對定量。
2.除權(quán)利要求I中尿樣作為生物樣本外,生物樣本還可來源于人的其它體液、組織、細(xì)胞等，具體包括全血、血漿、血清、紅細(xì)胞、尿液、腦脊液、唾液、淚液、汗液、組織勻漿、細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)液。
3.權(quán)利I中得到的數(shù)據(jù)除可用于糖尿病腎病的診斷外，還包括用于診斷其它涉及腎臟損傷的疾病，如急性腎炎、尿毒癥、慢性腎衰竭等相關(guān)疾病。
4.除權(quán)利要求I中甲醇沉淀蛋白的方法處理生物樣本外，還包括不經(jīng)過前處理的方法，或過濾/超濾的方法，或固相萃取方法，或經(jīng)過高速離心和超速離心沉淀；或者生物樣本采樣其它蛋白沉淀方法，如加入有機(jī)溶劑(如乙醇、丙酮、乙腈、異丙醇)、各種酸堿鹽沉淀、微波、加熱沉淀的方法；或經(jīng)過有機(jī)溶劑進(jìn)行液-液提取，有機(jī)溶劑包括乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、苯、正己烷、環(huán)己烷、乙腈等處理的方法。
5.除權(quán)利要求I中采用氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(GC/TOF-MS)、超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(UPLC/TOF-MS)進(jìn)行樣本分析外，還包括其它任何基于紫外檢測、熒光檢測、紅外檢測、氧化還原反應(yīng)、免疫應(yīng)答、電流變化等各種檢測技術(shù)(如HPLC)、質(zhì)譜測定技術(shù)(如LC-MS, LC-MS-MS, GC-MS, GC-MS-MS, CE-MS, CE-MS-MS)、核磁共振測定技術(shù)和其它代謝組學(xué)測定技術(shù)的分析方法，以及依據(jù)上述技術(shù)開發(fā)的單獨(dú)的或者聯(lián)用方法及試劑盒。
6.權(quán)利要求I中所得到的數(shù)據(jù)可以是絕對定量數(shù)據(jù)，也可以為相對定量數(shù)據(jù)、半定量數(shù)據(jù)，如峰面積、峰高，或采用數(shù)學(xué)方法對檢測分子進(jìn)行不同數(shù)學(xué)方式計算得到的數(shù)據(jù)，通過與健康人群的正常數(shù)值/置信區(qū)間以及糖尿病腎病早、中、晚期病人異常值/置信區(qū)間進(jìn)行比較，從而對病人是否出現(xiàn)糖尿病腎病進(jìn)行診斷。
7.除權(quán)利要求I中應(yīng)用SMCAP-Il軟件和偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)建立數(shù)學(xué)模型的方法外，還包括其它代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件，如SPSS、Matlab, SIMCA-P等各類版本；包括選擇除偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)外的其它方法，如正交偏最小二乘法(OPLS)、正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)、主成分分析(PCA)、非線性映射(Nonlinemapping, NLM)、聚類分析(HCA)等方法建立數(shù)學(xué)模型。
8.權(quán)利要求I中的數(shù)學(xué)模型可以為任意維空間模型，這里的多維空間可以是I、2、3維，也可以是4、5、6甚至更多維空間。其空間距離的計算可以采用各種數(shù)學(xué)方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了“糖尿病腎病早期診斷的尿液代謝標(biāo)志物測定方法”的方法。主要是利用基于氣相質(zhì)譜、液相質(zhì)譜等分析技術(shù)和方法，定量測定糖尿病、糖尿病腎病病人尿液中內(nèi)源性小分子化合物，通過計算和比較病理組與正常組內(nèi)源性小分子化合物相對濃度差異，用于臨床糖尿病腎病的早期診斷。與現(xiàn)有的其它臨床診斷指標(biāo)相比，該方法適應(yīng)面廣、靈敏、取樣簡便、操作簡單、對機(jī)體無傷害。更適用于糖尿病腎病早期階段某些生理生化指標(biāo)尚不明確時糖尿病腎病的篩查，避免患者不能及時診斷而錯過治療的最佳時期。
文檔編號G01N30/88GK102901790SQ20121035313
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者劉志紅, 王廣基, 阿基業(yè), 李夢婕, 王旭方, 劉林生, 秦衛(wèi)松, 曹蓓, 葛永純, 石建 申請人:中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院, 中國藥科大學(xué)