專(zhuān)利名稱(chēng)：豬圓環(huán)病毒2型elisa抗原檢測(cè)試劑盒及其制備方法和其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)試劑盒，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒及其制備方法和其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)是引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原。除了引發(fā) PMWS外，PCV2還與仔豬先天性震顫、豬皮炎腎炎綜合征、豬呼吸道綜合征(PDNS)、母豬繁殖障礙等疾病相關(guān)。自1996年在加拿大首次發(fā)現(xiàn)PMWS以來(lái)，PCV2感染引起的相關(guān)疾病已經(jīng)在全世界廣泛存在。截止目前，我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)受到PCV2感染的危害日益突出。因此，研制PCV2 抗原檢測(cè)試劑盒的臨床需求日益迫切。
目前，國(guó)內(nèi)外采用的PCV2檢測(cè)方法主要包括病毒分離培養(yǎng)、間接免疫熒光、免疫酶單層實(shí)驗(yàn)(MPA)、原位雜交(ISH)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等。盡管這些方法可以檢測(cè) PCV2，但存在使用不便，操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，不易普及等缺陷。
CN102183650A公開(kāi)了一種豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，該試劑盒采用雙單抗結(jié)合技術(shù)檢測(cè)PCV2抗體。
CN1584597A公開(kāi)了一種豬圓環(huán)病毒2型抗原或抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，其中，所述的抗原檢測(cè)試劑盒使用雙單抗夾心法，包被的抗體為原核表達(dá)的蛋白制備所得，并僅能依靠檢測(cè)孔的深淺來(lái)判斷強(qiáng)陽(yáng)性、陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性等定性檢測(cè)結(jié)果。該文獻(xiàn)公開(kāi)的試劑盒至今還沒(méi)有市場(chǎng)化，分析原因可能是試劑盒的特異性或敏感性不能滿(mǎn)足市場(chǎng)檢測(cè)的需要。 為此，急需研究一種能夠高效、定量檢測(cè)PCV2的方法。
CN201110440750. 7公開(kāi)了一種豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗及其制備方法和其應(yīng)用，該申請(qǐng)公開(kāi)的內(nèi)容全文作為本申請(qǐng)的參考。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒含有包被抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗體的酶標(biāo)板、封閉液、樣品稀釋液、抗原標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的抗PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體的二抗、濃縮洗滌液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和終止液，其中，所述抗原標(biāo)準(zhǔn)品為純化的重組桿狀病毒表達(dá)的形成病毒樣顆粒 (VLPs)的豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap蛋白)，所述酶底物A溶液為3，3’-5，5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液，所述的酶底物B溶液為含有雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的包被抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗體的酶標(biāo)板孔包被的抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗體為由純化的重組桿狀病毒表達(dá)的形成病毒樣顆粒(VLPs)的豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap蛋白)作為抗原免疫實(shí)驗(yàn)兔后純化血清所得，所 述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗體的包被量為O.1 μ g-5 μ g/孔，包被稀釋液為O. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液，其中，所述碳酸鹽緩沖液的pH9. 6。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述碳酸鹽緩沖液的組成為，每升碳酸鹽緩沖溶液中含有1. 59g Na2CO3 和 2. 93g NaHCO3。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述封閉液選自質(zhì)量濃度為1-10%的BSA、質(zhì)量濃度為 1-10%的脫脂牛奶的任一種或其組合。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述樣品稀釋液由質(zhì)量濃度為O. 1-10%牛血清白蛋白 (BSA)和含有O. 01-0. 05%NaN3的磷酸鹽緩沖液(PBS)組成，其中，所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為 O. 01mol/L, ρΗ7· 2-7. 4。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述濃縮洗滌液為含有O. 5v/v%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液，其中，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為O. lmol/L, pH7. 2-7. 4。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的酶底物A溶液為10mg/ml的3，3’ _5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液；所述的酶底物B溶液為含有O. 012% (質(zhì)量濃度)雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液，其中，乙酸鈉緩沖溶液的濃度為10mg/ml，pH5. O。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述終止液為lmol/L H2SO4溶液。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述樣品稀釋液的配制為配制PH7.2-7.4、濃度為O. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液，再加入BSA和NaN3,使其濃度分別為O. 1_10%BSA和 0. 01-0. 05%NaN3,即得。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述濃縮洗滌液的配制為在0. lmol/L PBS溶液中加入吐溫-20 (Tween-20)，使得吐溫-20的濃度為0. 5v/v%。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的酶底物A溶液為10mg/ml的3，3’ _5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液，其配制為稱(chēng)取IOOmg TMB，將其加入到IOml 二甲基亞砜(DMSO)中，完全溶解后，即得。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的酶底物B溶液為0. 012%雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液，其中，乙酸鈉緩沖溶液的濃度為10mg/ml，pH5. 0，其配制為稱(chēng)取IOg乙酸鈉，溶于IL純化水，用乙酸調(diào)PH5. O,再加入400 μ I濃度為30%Η202，即得。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述顯色液用酶底物B溶液100倍稀釋酶底物A溶液制得。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的試劑盒中還含有抗原標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照液，其中抗原標(biāo)準(zhǔn)品的配制為用樣品稀釋液稀釋重組PCV2-Cap蛋白，將其配制至lug/ml而得；所述的陰性對(duì)照液用樣品稀釋液100倍稀釋不含PCV2抗原的豬陰性血清配制而成。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述重組PCV2_Cap蛋白的制備方法包括如下步驟
(I)獲得本發(fā)明所述的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual_20RF2 ；
(2)同源重組，產(chǎn)生重組桿狀病毒DNA ；
(3)包裝，產(chǎn)生表達(dá)PCV2衣殼蛋白的重組桿狀病毒；
(4)獲得本發(fā)明制備的重組桿狀病毒；
(5)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，接種步驟(4)的重組桿狀病毒；
(6)滅活病毒；
(7)分離純化重組PCV2Cap蛋白。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體是分別在PFastBacDual轉(zhuǎn)移載體的PlO啟動(dòng)子和Ppolh啟動(dòng)子(多角體蛋白啟動(dòng)子)之后各插入一個(gè)拷貝的PCV2Cap蛋白編碼基因0RF2。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的PCV2Cap蛋白編碼基因0RF2是完整的、 未經(jīng)修飾的PCV2b 0RF2。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的PCV2Cap蛋白編碼基因0RF2的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述PCV2Cap蛋白編碼基因0RF2分別通過(guò) BamHI/Hind III 和 Kpn I/Xho I 雙酶切插入 pFastBac Dual 轉(zhuǎn)移載體中。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體為 pFastBacDual_20RF2。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的同源重組是將步驟(I)所述的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化進(jìn)含穿梭載體Bacmid的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DHlOBac中，產(chǎn)生重組桿狀病毒DNA。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的包裝是將步驟(2)產(chǎn)生的重組桿狀病毒 DNA感染sf9細(xì)胞，包裝出重組桿狀病毒。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述重組桿狀病毒為rBac_20RF2。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的步驟(5)包括利用生物反應(yīng)器無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)sf9細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，按感染復(fù)數(shù)(MOI)為O. 001-10的量接種步驟(4)所述的重組桿狀病毒后，繼續(xù)培養(yǎng)，使PCV2Cap蛋白在sf9細(xì)胞中高效表達(dá)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述生物反應(yīng)器的培養(yǎng)參數(shù)設(shè)定為pH 6. 0-6. 5，溫度25-30°C，溶氧30_80%，攪拌速度50_250rpm，優(yōu)選所述生物反應(yīng)器的培養(yǎng)參數(shù)設(shè)定為PH 6. 2，溫度27°C，溶氧50%，攪拌速度100_180rpm。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述步驟(5)包括將細(xì)胞經(jīng)過(guò)5L-50L培養(yǎng)體積逐級(jí)放大培養(yǎng)后，于50L生物反應(yīng)器培養(yǎng)并接種所述重組桿狀病毒；或者，將細(xì)胞經(jīng)過(guò) 5L-50L-500L培養(yǎng)體積逐級(jí)放大培養(yǎng)后，于500L生物反應(yīng)器培養(yǎng)并接種所述重組桿狀病毒。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述步驟(5)的培養(yǎng)方法選自批式培養(yǎng)方法、分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法、半連續(xù)灌注培養(yǎng)方法或連續(xù)灌注培養(yǎng)方法的任一種或其組合，優(yōu)選為分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述步驟(6)包括向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入滅活劑二乙烯亞胺(BEI)滅活所述的重組桿狀病毒，并可選的，在滅活結(jié)束后使用硫代硫酸鈉中和過(guò)量的BEI。
在本 發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案中，所述步驟(7)包括收集步驟(6)滅活后的細(xì)胞培養(yǎng)物，通過(guò)離心或中空纖維過(guò)濾除去細(xì)胞碎片，得到含有PCV2Cap蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清， 再通過(guò)超速離心和CsCl密度梯度離心，獲得純化的形成病毒樣顆粒的Cap蛋白。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，包括下述步驟
I)將待檢試樣用樣品稀釋液1:100稀釋?zhuān)瑢⑵浼尤刖鶆虬豢筆CV2_Cap蛋白的多克隆抗體的酶標(biāo)板孔中，每孔加100μ 1，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，其中，陽(yáng)性對(duì)照組加入1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列稀釋的抗原標(biāo)準(zhǔn)品各100 μ 1，陰性對(duì)照組加入100 μ I陰性對(duì)照液，空白對(duì)照組加入100 μ I樣品稀釋液，每個(gè)試樣和對(duì)照平行加樣2-6個(gè)孔；
2)加樣完成后，將酶標(biāo)板置37°C孵育I小時(shí)后，洗滌液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗滌液由濃縮洗滌液加水稀釋10倍制得；
3)每孔加入100 μ IHRP標(biāo)記的抗PCV2_Cap蛋白的單克隆抗體的二抗，37°C孵育I 小時(shí)，洗滌液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗滌液由濃縮洗滌液加水稀釋10倍制得；
4)每孔加入100 μ I顯色液，避光顯色5-10分鐘后，每孔再加入50 μ I終止液，其中，所述的顯色液由酶底物B溶液100倍稀釋酶底物A溶液制得；
5)將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，在450nm測(cè)定其光吸收值0D45(lnm；
6)結(jié)果計(jì)算與判定
其中，定性結(jié)果的判定Cut off (CO值)=陰性對(duì)照光吸收值OD45tlnmX 2.1倍，樣品值=樣品光吸收值0D45tol/C0值，其中，樣品值>1為陽(yáng)性；樣品值彡I為陰性；或者，
定量結(jié)果的判定以2為底OD值的對(duì)數(shù)為X軸，以2為底標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)為Y 軸，利用“EXCEL”軟件獲得線性曲線及方程式，將以2為底樣品OD值的對(duì)數(shù)帶入曲線方程式計(jì)算出樣品的濃度。
本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)豬群PCV2抗原或PCV2疫苗產(chǎn)品的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的PCV2抗原選自豬群PCV2感染、PCV2疫苗抗原的任一種。
本發(fā)明的抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗體的制備方法，包括下述步驟
1)將前述純化的PCV2_Cap蛋白常規(guī)免疫實(shí)驗(yàn)兔，當(dāng)兔血清ELISA效價(jià)達(dá)到1:1000 以上時(shí),采集兔血清；
2)將步驟I)制得的兔血清經(jīng)硫酸銨沉淀，純化，制得純化的抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗體；
3)在步驟2)制得的抗PCV2_Cap蛋白的多克隆抗體中加入0. 1-10%牛血清白蛋白、0. 1-10%酪蛋白和50%的中性甘油，測(cè)定工作濃度后，-20°c保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗PCV2_Cap蛋白的單克隆抗體的二抗可以商購(gòu)，或按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法制備，如參照文獻(xiàn)(曹雪濤，精編免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M]. 北京科學(xué)出版社，2009;酶標(biāo)記抗體一 HRP標(biāo)記抗體原理及方法，戊二醛二步法和過(guò)碘酸鈉法，[EB/0L]http://www. seekbio. com/biotech/Immunity/2007/2007831543528. html2007-8-3.)公開(kāi)的方法制備。作為示例，本發(fā)明的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗 PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體的二抗的制備方法，包括下述步驟
1)將前述純化的PCV2_Cap蛋白常規(guī)免疫Balb/c小鼠，當(dāng)小鼠血清ELISA效價(jià)達(dá)到1:10000以上時(shí)，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)以5X107 =IXlO7的比例進(jìn)行融合；用 HAT選擇性培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞；用ELISA方法和間接免疫熒光(IFA)方法進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選；將篩選到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞經(jīng)三次有限稀釋得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及抗PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體；
2)將步驟1)制得的抗PCV2_Cap蛋白的單克隆抗體經(jīng)硫酸銨沉淀，純化，制得純化的抗PCV2_Cap蛋白的單克隆抗體；
3)用改良的過(guò)碘酸鈉氧化法對(duì)步驟2)制得的純化的抗PCV2_Cap蛋白的單克隆 抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記，制得辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體的二 抗；
4)在辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗PCV2_Cap蛋白的單克隆抗體的二抗中加入 O. 1-10%牛血清白蛋白、O. 1-10%酪蛋白和50%的中性甘油，測(cè)定工作濃度后，-20°C保存 備用。
本發(fā)明的濃縮洗滌液為10倍洗滌液，檢測(cè)時(shí)需加水稀釋10倍，制得洗滌液。
本發(fā)明的顯色液用酶底物B溶液100倍稀釋酶底物A溶液制得，其中，酶底物A溶 液為10mg/ml的3，3’ -5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液；酶底物B溶液為O. 012% (質(zhì)量濃 度)雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液，其中，乙酸鈉緩沖溶液的濃度為10mg/ml，pH5. O。
本發(fā)明所述的抗原標(biāo)準(zhǔn)品的配制為用樣品稀釋液稀釋重組PCV2_Cap蛋白至Iug/ ml制成。
本發(fā)明所述的陰性對(duì)照液用樣品稀釋液100倍稀釋不含PCV2抗原的豬陰性血清 配制而成。
本發(fā)明所述的空白對(duì)照液為樣品稀釋液。
除非另有說(shuō)明，本發(fā)明涉及液體與液體之間的百分比時(shí)，所述的百分比為體積/ 體積百分比；本發(fā)明涉及液體與固體之間的百分比時(shí)，所述百分比為體積/重量百分比；本 發(fā)明涉及固體與液體之間的百分比時(shí)，所述百分比為重量/體積百分比；其余為重量/重量 百分比。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的試劑盒具有下述有益技術(shù)效果
1、經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明采用了中國(guó)流行的PCV2b亞型的編碼Cap蛋白的基因序列， 針對(duì)性地用于檢測(cè)和預(yù)防中國(guó)流行的豬圓環(huán)病毒??；
2、本發(fā)明所述重組桿狀病毒含有雙啟動(dòng)子(多角體蛋白啟動(dòng)子和PlO啟動(dòng)子)，可 表達(dá)雙拷貝的Cap蛋白編碼基因，顯著提高了蛋白的表達(dá)效率；并且，插入的外源基因所表 達(dá)的Cap蛋白不含多余序列，能有效形成病毒樣顆粒(VLPs)，保持了病毒抗原的空間構(gòu)象 結(jié)構(gòu)，提高了表達(dá)蛋白的免疫原性，且生產(chǎn)的抗原含量高；
3、本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒2型(PCV2 )ELISA抗原檢測(cè)試劑盒采用由形成病毒樣顆粒 (VLPs)的PCV2-Cap蛋白研制的多克隆抗體制備反應(yīng)板，抗PCV2_Cap蛋白的單抗進(jìn)行HRP 酶標(biāo)記后制備二抗，進(jìn)而組成用雙抗夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型抗原的 試劑盒。本發(fā)明的試劑盒除具有ELISA試劑盒的優(yōu)點(diǎn)外，還克服了抗原空間構(gòu)象問(wèn)題所致 的特異性低和二抗問(wèn)題所致的靈敏度低等缺陷，顯著提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度。
4、本發(fā)明的試劑盒里還配備了抗原標(biāo)準(zhǔn)品，可以檢測(cè)到樣品中PCV2_Cap蛋白的 準(zhǔn)確含量，特別適合用于PCV2基因亞單位疫苗的定量檢測(cè)，最高檢測(cè)到抗原標(biāo)準(zhǔn)品的濃度 為 4ng/ml。
5、本發(fā)明試劑盒可以定性何定量檢測(cè)PCV2，其檢測(cè)特異性達(dá)100%，靈敏度高達(dá) 4ng/ml，可用于豬群PCV2抗原檢測(cè)和PCV2疫苗產(chǎn)品的定量檢測(cè)。


圖1本發(fā)明的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建流程圖。
圖2本發(fā)明的重組桿狀病毒構(gòu)建流程圖。
圖3單拷貝、雙拷貝重組bacmid PCR鑒定圖。其中，圖3A是雙拷貝重組bacmid 鑒定結(jié)果圖，I是陰性對(duì)照，2和3是marker，4是PUC M13F/R引物。圖3B是單拷貝重組 bacmid鑒定結(jié)果圖，I是陰性對(duì)照，2和3是marker，4是PUC M13F/R引物。
圖4本發(fā)明表達(dá)的Cap蛋白形成病毒樣顆粒(VLPs)電鏡圖片。
圖5本發(fā)明試劑盒的制備工藝流程圖。
圖6實(shí)施例3制得的PCV2_Cap蛋白SDS-PAGE分析圖，其中，M是Marker，I是純 化的PCV2-Cap蛋白。
圖7實(shí)施例8中由標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施方式
以下將結(jié)合實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方 案，并非限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)。
實(shí)施例1 重組桿狀病毒的構(gòu)建
使用Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建重組桿狀病毒，根據(jù)GENBANK公布的基因序列(NCBI登 陸號(hào)EU340257.1)設(shè)計(jì)以下引物
PlTCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG
P2 GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC
P3 TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG
P4 GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC
以PCV2b株病毒0RF2序列為模板(該模板根據(jù)已公布的PCV2b 0RF2序列登陸號(hào) EU340257.1合成獲得)，PI, P2擴(kuò)增PCV20RF2基因，并將該基因克隆入pMD_19T載體中，獲 得重組載體PMD-19T-0RF2-1，以PCV2b株病毒0RF2序列為模板，P3，P4擴(kuò)增PCV20RF2基 因，并將該基因克隆入PMD-19T載體中，獲得重組載體pMD-19T-0RF2-2。
通過(guò)BamH I和Hind III雙酶切pMD_19T-0RF2_l，將0RF2基因克隆入轉(zhuǎn)移 載體pFastBac Dual中，構(gòu)建載體pFastBac Dual_0RF2 ；通過(guò)Kpn I和Xho I雙酶切 PMD-19T-0RF2-2,將0RF2基因克隆入轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual_0RF2中，構(gòu)建包含雙拷 貝0RF2基因的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual_20RF2，將該重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DHlOBac，獲得插入雙拷貝0RF2基因的重組質(zhì)粒bacmid-20RF2 (PUC M13 F/R引物鑒定 bacmid結(jié)果見(jiàn)圖3A)，將該重組質(zhì)粒bacmid_20RF2轉(zhuǎn)染入昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9中，獲得重組桿狀 病毒rBac-20RF2 (0RF2序列如SEQ ID NO 1所述)，擴(kuò)增重組桿狀病毒rBac_20RF2作為 種毒備用。將重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual_0RF2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac，獲得插入單拷貝 0RF2基因的重組質(zhì)粒bacmid-0RF2，將該重組質(zhì)粒bacmid_0RF2轉(zhuǎn)染入昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9中，獲 得重組桿狀病毒rBac-0RF2(0RF2序列如SEQ ID NO :1所述)，擴(kuò)增重組桿狀病毒rBac_0RF2 備用(PUC M13F/R引物鑒定bacmid結(jié)果見(jiàn)圖3B)。
實(shí)施例2 昆蟲(chóng)細(xì)胞的生物反應(yīng)器無(wú)血清懸浮培養(yǎng)及Cap蛋白的表達(dá)定量
在IOOOml搖瓶中無(wú)菌培養(yǎng)Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞3_4天，待濃度長(zhǎng)到3_5X 106cells/ml， 活力大于95%時(shí)，將細(xì)胞接種到5L的生物反應(yīng)器中，接種濃度為3-8X105cells/ml。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到3-5X106cells/ml時(shí)，將細(xì)胞接種到50L生物反應(yīng)器中，待細(xì)胞長(zhǎng)至濃度為 3-5X106cells/ml，接種至Ij 500L生物反應(yīng)器中，待細(xì)胞濃度達(dá)到2-8X 106cells/ml時(shí)，接種重組病毒rBac-20RF2或rBac_0RF2，感染復(fù)數(shù)(Μ0Ι)為O. 001-10，反應(yīng)器培養(yǎng)條件為pH 6. 0-6. 5、溫度25-27°C、溶氧30_80%、攪拌速度100_180rpm?？紤]到細(xì)胞培養(yǎng)的最適條件， 優(yōu)選的PH 6. 2、細(xì)胞培養(yǎng)階段溫度設(shè)定27°C、溶氧50%、攪拌速度100_180rpm。在感染之后繼續(xù)培養(yǎng)5-9天后，加入終濃度為5mmol/L的BEI，37°C作用24h后，加lmol/L Na2S2O3至終濃度5mmol/L終止滅活。通過(guò)離心或中空纖維過(guò)濾的方法收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清，置2-8°C保存疫苗原液。
制備的疫苗抗原中所含的Cap蛋白通過(guò)ELISA定量檢測(cè)。用包被緩沖液稀釋純化的捕獲抗體兔抗PCV2-Cap蛋白多抗至合適濃度，每孔100μ 1，4°C過(guò)夜，PBST洗滌三次， 1%BSA封閉I小時(shí)。加入不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品(通過(guò)CsCl密度梯度離心純化的形成病毒樣顆粒VLPs的Cap蛋白)和梯度稀釋待檢樣品，37°C孵育I小時(shí)，PBST洗三次。每孔加入檢測(cè)抗體-抗PCV2Cap蛋白的單克隆抗體，37°C孵育I小時(shí)，PBST洗三次。每孔加入二抗-HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C孵育I小時(shí)，PBST洗三次。TMB顯色10分鐘，2MH2S04終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀讀數(shù)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待檢樣品中Cap蛋白的量。
使用三種不同MOI (O. 01、0. 1、1)接種兩種不同的病毒，分別于接種后7-11天取樣定量分析培養(yǎng)上清中的目的蛋白含量，結(jié)果見(jiàn)表I。
表I不同感染復(fù)數(shù)接種兩種病毒蛋白表達(dá)量(μ g/ml)分析
權(quán)利要求
1.一種豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒含有包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗體的酶標(biāo)板、封閉液、樣品稀釋液、抗原標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的抗PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體的二抗、濃縮洗滌液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和終止液，其中，所述抗原標(biāo)準(zhǔn)品為純化的重組桿狀病毒表達(dá)的形成病毒樣顆粒(VLPs)的豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap蛋白)，所述酶底物A溶液為3，3’ -5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺溶液；所述的酶底物B溶液為含有雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒，所述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗體為由純化的重組桿狀病毒表達(dá)的形成病毒樣顆粒(VLPs)的豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap蛋白)作為抗原免疫實(shí)驗(yàn)兔后純化血清所得，所述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗體的包被量為O.1 μ g-5 μ g/孔，包被稀釋液為O. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液，其中，所述碳酸鹽緩沖液的PH為9. 6。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒，所述碳酸鹽緩沖液的組成為，每升碳酸鹽緩沖溶液中含有1. 59g Na2CO3和2. 93g NaHC03。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒，所述封閉液選自質(zhì)量濃度為1-10%的牛血清白蛋白(BSA)或質(zhì)量濃度為1-10%的脫脂牛奶的任一或其組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒，所述樣品稀釋液由質(zhì)量濃度為O. 1-10%牛血清白蛋白和含有O. 01-0. 05%疊氮化鈉(NaN3)的磷酸鹽緩沖液組成，其中，所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為O. 01mol/L, pH7. 2-7. 4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒，所述濃縮洗滌液為含有O. 5% (v/v)吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液，其中，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為O.lmol/L, ρΗ7· 2-7. 4。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒，所述的酶底物A溶液選自濃度為10mg/ml的3，3’ -5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺溶液；所述的酶底物B溶液含有質(zhì)量濃度為O. 012%雙氧水的乙酸鈉緩沖溶液，其中，乙酸鈉緩沖溶液的濃度為IOmg/ml, pH 為 5. O。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒，所述終止液為lmol/L的H2SO4溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒，其中，抗原標(biāo)準(zhǔn)品的配制為用樣品稀釋液稀釋重組PCV2-Cap蛋白至lug/ml制成。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒，所述的試劑盒中還含有陰性對(duì)照液，所述的陰性對(duì)照液為用樣品稀釋液100倍稀釋不含PCV2抗原的豬陰性血清配制而成。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒，所述重組PCV2-Cap蛋白的制備方法包括如下步驟 Cl)獲得重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體PFastBac Dual_20RF2，其中，所述載體是分別在PFastBac Dual轉(zhuǎn)移載體的PlO啟動(dòng)子和Ppolh啟動(dòng)子(多角體蛋白啟動(dòng)子)之后各插入一個(gè)拷貝的PCV2 Cap蛋白編碼基因0RF2，優(yōu)選所述的PCV2 Cap蛋白編碼基因0RF2是完整的、未經(jīng)修飾的PCV2b 0RF2,更優(yōu)選所述PCV 2Cap蛋白編碼基因0RF2分別通過(guò)BamHI/Hind III和Kpn I/Xhο I雙酶切插入pFastBac Dual轉(zhuǎn)移載體中; (2)同源重組，產(chǎn)生重組桿狀病毒DNA； (3)包裝，產(chǎn)生表達(dá)PCV2衣殼蛋白的重組桿狀病毒； (4)獲得重組桿狀病毒rBac-20RF2； (5)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，接種步驟(4)的重組桿狀病毒，使其表達(dá)Cap蛋白，并自我組裝形成病毒樣顆粒(VLPs)； (6)滅活病毒； (7)分離純化重組PCV2Cap蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒，其中，所述的PCV2Cap蛋白編碼基因0RF2的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
13.—種利用權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，包括下述步驟 1)將待檢試樣用樣品稀釋液1:100稀釋?zhuān)瑢⑵浼尤刖鶆虬豢筆CV2-Cap蛋白的多克隆抗體的酶標(biāo)板孔中，每孔加100μ 1，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，其中，陽(yáng)性對(duì)照組加入1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列稀釋的抗原標(biāo)準(zhǔn)品各100 μ I，陰性對(duì)照組加入100 μ I陰性對(duì)照液，空白對(duì)照組加入100 μ I樣品稀釋液，每個(gè)試樣和對(duì)照平行加樣2-6個(gè)孔； 2)加樣完成后，將酶標(biāo)板置37°C孵育I小時(shí)后，洗滌液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗滌液由濃縮洗滌液加水稀釋10倍制得； 3)每孔加入100μIHRP標(biāo)記的抗PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體的二抗，37°C孵育I小時(shí)，洗滌液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗滌液由濃縮洗滌液加水稀釋10倍制得； 4)每孔加入100μ I顯色液，避光顯色5-10分鐘后，每孔再加入50 μ I終止液，其中，所述的顯色液由酶底物B溶液100倍稀釋酶底物A溶液制得； 5)將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，在450nm測(cè)定其光吸收值OD45tol； 6)結(jié)果計(jì)算與判定 其中，定性結(jié)果的判定Cut off (CO值)=陰性對(duì)照光吸收值OD45tlnmX2.1倍，樣品值=樣品光吸收值OD45tlmZCO值，其中，樣品值>1為陽(yáng)性；樣品值彡I為陰性；或者， 定量結(jié)果的判定以2為底OD值的對(duì)數(shù)為X軸，以2為底標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)為Y軸，利用“EXCEL”軟件獲得線性曲線及方程式，將以2為底樣品OD值的對(duì)數(shù)帶入曲線方程式計(jì)算出樣品的濃度。
14.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)PCV2抗原或PCV2疫苗產(chǎn)品的應(yīng)用，優(yōu)選所述的PCV2抗原選自豬群PCV2感染、PCV2疫苗抗原的任一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒及其制備方法和其應(yīng)用。其中，所述檢測(cè)試劑盒含有包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗體的酶標(biāo)板、封閉液、樣品稀釋液、抗原標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的抗PCV2-Cap蛋白的單克隆抗體的二抗、濃縮洗滌液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和終止液，其中，所述抗原標(biāo)準(zhǔn)品為純化的重組豬圓環(huán)病毒2型核衣殼蛋白(PCV2-Cap蛋白)。本發(fā)明試劑盒的特異性達(dá)100%，靈敏度高達(dá)4ng/ml，可用于豬群PCV2抗原檢測(cè)和PCV2疫苗產(chǎn)品的定量檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK103033622SQ20121035655
公開(kāi)日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者廖園園, 漆世華, 朱薇, 李建, 秦偉, 王威, 熊媛媛, 張萍, 秦紅剛, 李偉, 謝紅玲, 溫文生, 王楨楨, 靖志強(qiáng), 吳玉石, 韓興, 劉潔 申請(qǐng)人:武漢中博生物股份有限公司