專(zhuān)利名稱：微孔陣列芯片及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的第一方案涉及可用于抗原特異性淋巴細(xì)胞等生物體細(xì)胞的檢測(cè)等的微孔陣列芯片。本發(fā)明的第一方案特別涉及可容易地進(jìn)行微孔定位的微孔陣列芯片(Microwell Array Chip)。本發(fā)明的第二方案涉及微孔對(duì)生物體細(xì)胞的捕集率和收集率均優(yōu)異的微孔陣列芯片及其制造方法。本發(fā)明的第三方案涉及可用于抗原特異性淋巴細(xì)胞等生物體細(xì)胞的檢測(cè)等的硅 制微孔陣列芯片。本發(fā)明的第三方案特別涉及根據(jù)需要，可容易地將容納在微孔中的生物體細(xì)胞進(jìn)行回收的微孔陣列芯片。
背景技術(shù)：
以往，抗原特異性淋巴細(xì)胞通過(guò)例如使用96孔板，每孔加入約200，000個(gè)淋巴細(xì)胞，在抗原存在下培養(yǎng)3天至一周，由此進(jìn)行檢測(cè)(球機(jī)能檢索法”矢野純一、藤原道夫編著，中外醫(yī)學(xué)社(1994年)；“免疫實(shí)驗(yàn)操作法1、11”右田俊介、紺田進(jìn)、本庶佑、濱岡利之編集，南江堂(1995年))。該方法中，可確認(rèn)約200，000個(gè)淋巴細(xì)胞群中存在抗原特異性淋巴細(xì)胞。但是無(wú)法鑒定存在于淋巴細(xì)胞群中的各抗原特異性淋巴細(xì)胞。對(duì)于此，近年來(lái)人們開(kāi)發(fā)利用了通過(guò)將用熒光染料標(biāo)記的抗原分子與淋巴細(xì)胞混合，來(lái)使熒光標(biāo)記抗原與抗原特異性淋巴細(xì)胞的抗原受體結(jié)合，再使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)合有突光標(biāo)記抗原的淋巴細(xì)胞的方法(Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH,McHeyzer-Williams MG, Bell JI, McMichael AJ, Davis MM. Phenotypic analysis ofantigen-specific T lymphocytes (抗原特異性 T 淋巴細(xì)胞的表型分析),Science, 274 94-96,1996)。該方法可以鑒定與抗原結(jié)合的I個(gè)淋巴細(xì)胞。還可以分選I個(gè)與抗原結(jié)合的淋巴細(xì)胞。但是，上述檢測(cè)方法中，為了分選，必須有細(xì)胞分選儀這樣高價(jià)且復(fù)雜的儀器，并且還有以下的問(wèn)題。(I)用于分選的儀器條件設(shè)定較難，用于分選細(xì)胞的儀器操作必須熟練。(2)由于背景噪聲高，抗原特異性淋巴細(xì)胞的頻度為O. 1%以下時(shí)，無(wú)法檢測(cè)抗原特異性淋巴細(xì)胞。(3)分選細(xì)胞的效率低。(4)分選頻度低的細(xì)胞需要時(shí)間。(5)可以確認(rèn)有抗原結(jié)合，但難以對(duì)結(jié)合有抗原的淋巴細(xì)胞的反應(yīng)進(jìn)行分析。作為其它的抗原特異性淋巴細(xì)胞檢測(cè)法，還開(kāi)發(fā)出通過(guò)將與磁珠結(jié)合的抗原分子與淋巴細(xì)胞混合，使結(jié)合有磁珠的抗原與抗原特異性淋巴細(xì)胞的抗原受體結(jié)合，使用磁石分選抗原特異性淋巴細(xì)胞的方法(Abts H, Emmerich M, Miltenyi S, Radbruch A, TeschH, CD20positive human B lymphocytes separated with the magnetic sorter(MACS)can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal ofImmunological methods 125:19-28,1989·)。該方法無(wú)需復(fù)雜的裝置，細(xì)胞分選所需的時(shí)間短，可以確認(rèn)有抗原結(jié)合。但無(wú)法對(duì)結(jié)合有抗原的淋巴細(xì)胞是否與抗原反應(yīng)(細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA合成、蛋白質(zhì)合成等細(xì)胞的代謝生理反應(yīng))進(jìn)行分析。另外，抗原特異性淋巴細(xì)胞的頻度為0.1%以下時(shí)，無(wú)法檢測(cè)抗原特異性淋巴細(xì)胞。而本發(fā)明人對(duì)于提供無(wú)需復(fù)雜的裝置、細(xì)胞分選時(shí)間短、可確認(rèn)有抗原結(jié)合、也可檢測(cè)頻度低的抗原特異性淋巴細(xì)胞(0.001%以上)、可以對(duì)結(jié)合有抗原的淋巴細(xì)胞是否與抗原反應(yīng)進(jìn)行分析、并且可分選抗原特異性淋巴細(xì)胞的抗原特異性淋巴細(xì)胞檢測(cè)方法進(jìn)行了各種研究。對(duì)個(gè)別檢測(cè)一個(gè)個(gè)淋巴細(xì)胞的抗原特異性、并且回收檢測(cè)出的抗原特異性淋 巴細(xì)胞的方法進(jìn)行了開(kāi)發(fā)。但是，目前為止尚未知有可個(gè)別檢測(cè)一個(gè)個(gè)淋巴細(xì)胞的抗原特異性，并可回收所檢測(cè)的抗原特異性淋巴細(xì)胞的微孔陣列芯片。因此，本發(fā)明人對(duì)于提供可利用于上述檢測(cè)法中、可將一個(gè)淋巴細(xì)胞容納在一個(gè)微孔中的微孔陣列芯片的情況進(jìn)行了各種研究。并試作了在基板表面形成可容納一個(gè)淋巴細(xì)胞左右大小的微孔的微孔陣列芯片，進(jìn)行了將淋巴細(xì)胞容納進(jìn)(捕集到)微孔中和從微孔中回收的測(cè)試。已經(jīng)清楚在該過(guò)程中，在設(shè)置有很多微細(xì)的微孔的陣列芯片上回收檢測(cè)出的抗原特異性淋巴細(xì)胞時(shí)，特別是將檢測(cè)與回收以分別的步驟進(jìn)行時(shí)，為了從已檢測(cè)的微孔中確實(shí)無(wú)誤地回收抗原特異性淋巴細(xì)胞，必須進(jìn)行微孔的定位。即，如果只是將很多微孔排列的陣列芯片，是不容易進(jìn)行特定的微孔定位的。還清楚了 上述過(guò)程中，將淋巴細(xì)胞容納入微孔中時(shí)，如果使用細(xì)胞懸浮液將淋巴細(xì)胞捕集到微孔中，然后清洗陣列芯片，則大多數(shù)細(xì)胞從微孔中流出，捕集率和填充率顯著降低。因此，本發(fā)明的第一目的在于提供可利用上述檢測(cè)法、可將一個(gè)淋巴細(xì)胞容納入一個(gè)微孔中的微孔陣列芯片。本發(fā)明的第一方案的目的特別在于提供可容易地確定多數(shù)且微細(xì)的微孔的位置的微孔陣列芯片。本發(fā)明的第二目的在于提供捕集到微孔中的淋巴細(xì)胞等細(xì)胞在之后清洗時(shí)不易從微孔中流出的微孔陣列芯片。本發(fā)明的第三目的在于提供可利用上述檢測(cè)法、可將一個(gè)淋巴細(xì)胞容納入一個(gè)微孔中的微孔陣列芯片。本發(fā)明的第三方案的目的特別在于提供可容易地將容納在微孔中的一個(gè)淋巴細(xì)胞回收的微孔陣列芯片。本發(fā)明的第三方案的目的在于進(jìn)一步提供不限于淋巴細(xì)胞，可將一個(gè)生物體細(xì)胞容納進(jìn)一個(gè)微孔中的微孔陣列芯片。

發(fā)明內(nèi)容
用以實(shí)現(xiàn)上述第一目的的本發(fā)明的第一方案如下。(I)微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有多個(gè)微孔，上述微孔具有在一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸，在與微孔的開(kāi)口相同的基板表面上具有微孔的標(biāo)記。(2)⑴的微孔陣列芯片，其中多個(gè)微孔以相同的間隔縱橫配置，每組規(guī)定個(gè)數(shù)的微孔上設(shè)有標(biāo)記。(3) (I)或(2)的微孔陣列芯片，其中多個(gè)微孔是將規(guī)定個(gè)數(shù)的微孔分成各組，設(shè)置于基板的主表面上，并設(shè)有標(biāo)記以掌握各組的位置。(4) (3)的微孔陣列芯片，其中屬于一個(gè)組的微孔的數(shù)量在10-10000的范圍內(nèi)。(5) (I)-⑷中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片,其中標(biāo)記含有突光材料或反射材料。 (6) (1)-(5)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中標(biāo)記是用于定位的標(biāo)記。(7) (1)-(6)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中基板是硅、金屬或樹(shù)脂制的。(8) (1)-(7)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中上述微孔是圓筒形、由多個(gè)面構(gòu)成的多面體、倒圓錐形或倒角錐形、或上述兩種以上形狀的組合形狀。(9) (1)-(8)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中與微孔的平面形狀內(nèi)切的最大圓的直徑是要容納到微孔中的生物體細(xì)胞直徑的O. 5-2倍的范圍，且微孔的深度是要容納到微孔中的生物體細(xì)胞直徑的O. 5-4倍的范圍。(10) (1)-(9)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中生物體細(xì)胞是淋巴細(xì)胞，所述微孔陣列芯片用于以一個(gè)單位檢測(cè)抗原特異性淋巴細(xì)胞。(11) (I)-(IO)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中上述主表面上具有疏水性區(qū)域，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。(12) (11)的微孔陣列芯片，其中上述疏水性區(qū)域具有硅表面或含氟表面。用以實(shí)現(xiàn)上述第二目的的本發(fā)明的第二方案如下。(13)微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有多個(gè)微孔，上述微孔具有在一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸，上述微孔的開(kāi)口部具有突起部，使開(kāi)口部變狹窄。(14) (13)的微孔陣列芯片，其中上述突起部是由設(shè)置于基板表面的膜向上述開(kāi)口部突出而形成的。(15) (13)或(14)的微孔陣列芯片，其中由上述突起部形成的開(kāi)口的大小為可使要容納到微孔中的生物體細(xì)胞通過(guò)的大小。(16) (13)-(15)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中基板是硅、金屬或樹(shù)脂制的。(17) (14)-(16)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中設(shè)于基板表面的膜是氧化膜、氮化膜、雜質(zhì)擴(kuò)散層、金屬膜或樹(shù)脂膜。(18) (13)的微孔陣列芯片的制造方法，該方法包含以下步驟在基板的至少一側(cè)主表面上形成膜的步驟；在形成的膜上涂布抗蝕劑的步驟；經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)上述抗蝕劑面進(jìn)行曝光，除去抗蝕劑的非硬化部分的步驟；蝕刻上述膜和基板的暴露部分，打微孔陣列形狀的孔的步驟；以及除去抗蝕劑的步驟。(19) (18)的微孔陣列芯片的制造方法，其中基板是硅、金屬或樹(shù)脂制的。
(20) (18)或(19)的微孔陣列芯片的制造方法，其中設(shè)于基板表面的膜是氧化膜、氮化膜、雜質(zhì)擴(kuò)散層、金屬膜或樹(shù)脂膜。(21) (13)-(20)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中上述主表面上具有疏水性區(qū)域，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。(22) (21)的微孔陣列芯片，其中上述疏水性區(qū)域具有硅表面或含氟表面。用以實(shí)現(xiàn)上述第三目的的本發(fā)明的第三方案如下。(23)微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片具有多個(gè)微孔，是用于在各微孔中容納I個(gè) 被檢生物體細(xì)胞的硅制微孔陣列芯片，上述微孔具有的每一個(gè)微孔中僅可容納I個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸。(24) (23)的微孔陣列芯片，其中上述微孔是圓筒形、由多個(gè)面構(gòu)成的多面體、倒圓錐形或倒角錐形、或上述兩種以上形狀的組合形狀。(25) (23)或(24)的微孔陣列芯片，其中與微孔的平面形狀內(nèi)切的最大圓的直徑是要容納到微孔中的生物體細(xì)胞直徑的O. 5-2倍的范圍，且微孔的深度是要容納到微孔中的生物體細(xì)胞直徑的O. 5-4倍的范圍。(26) (23)-(25)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中生物體細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，所述微孔陣列芯片用于以一個(gè)單位檢測(cè)抗原特異性淋巴細(xì)胞。(27) (23)-(26)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中微孔的內(nèi)面被氟碳膜或氧化硅膜覆蓋。(28) (27)的微孔陣列芯片，該芯片可用于將容納到一個(gè)微孔中的一個(gè)生物體細(xì)胞從微孔中回收。(29) (23)-(28)中任一項(xiàng)的微孔陣列芯片，其中在上述具有多個(gè)微孔的面上具有疏水性區(qū)域，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。(30) (29)的微孔陣列芯片，其中上述疏水性區(qū)域具有硅表面或含氟表面。(31)上述微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有微孔，上述主表面上具有疏水性表面區(qū)域，該疏水性表面區(qū)域設(shè)置成包圍上述微孔。(32) (31)的微孔陣列芯片，其中上述疏水性區(qū)域具有硅表面或含氟表面。附圖簡(jiǎn)述圖I表示微孔陣列芯片Ia的平面圖，其中縱橫分別設(shè)有3個(gè)IOX 10的微孔Ib的組Ic。圖2是具有實(shí)施例I中的熒光標(biāo)記的本發(fā)明第一方案的微孔陣列芯片的制作方法說(shuō)明圖。圖3表不在娃基板3a上具有反射標(biāo)記3d的微孔陣列芯片3a的平面圖。圖4是反射標(biāo)記的反射原理說(shuō)明圖。圖5是具有實(shí)施例2中的反射標(biāo)記的本發(fā)明第一方案的微孔陣列芯片的制作方法(前半部分)的說(shuō)明圖。圖6是具有實(shí)施例2中的反射標(biāo)記的本發(fā)明第一方案的微孔陣列芯片的制作方法(后半部分)的說(shuō)明圖。圖7(A)和(B)是具有在開(kāi)口部13a不存在突起部的微孔13的陣列芯片的平面圖和側(cè)面截面圖。圖7(C)、(D)和(E)是在微孔13的開(kāi)口部13a存在由膜12’的一部分形成的突起部14的陣列芯片的平面圖、側(cè)面截面圖和斜視圖。圖8(A)、(B)和(C)是表示與圖7不同的本發(fā)明第二方案的微孔陣列芯片的平面圖、側(cè)面截面圖和斜視圖。微孔13的開(kāi)口部13a處存在由膜12”的一部分形成的突起部14’，并且由突起部14’形成的開(kāi)口的形狀為圓形。圖9(A)、⑶和(C)是采用硅基板的微孔陣列芯片的制作過(guò)程說(shuō)明圖(側(cè)面截面圖)，(C)的微孔是倒四角錐形。(D)的微孔是方形，(E)的微孔是半球形。

圖10表示實(shí)施例3中制作的微孔陣列芯片的各部分的尺寸。圖11是孔內(nèi)具有氟碳膜的微孔陣列芯片的概略說(shuō)明圖。圖12是實(shí)施例4中孔內(nèi)具有氟碳膜的微孔陣列芯片的制作方法的說(shuō)明圖。圖13是實(shí)施例5中孔內(nèi)具有氧化膜(氧化硅)的微孔陣列芯片的制作方法的說(shuō)明圖。圖14是在具有多個(gè)微孔的主表面上具有疏水性區(qū)域的微孔陣列芯片的概略圖，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。圖15是圖14所示的微孔陣列芯片的制作方法的說(shuō)明圖。圖16是設(shè)置有疏水性區(qū)域的微孔陣列芯片的制作方法的說(shuō)明圖。圖17是實(shí)施例6中對(duì)內(nèi)壁實(shí)施了平滑處理的微孔的放大照片。圖18是實(shí)施例7中在開(kāi)口部形成突起的微孔的放大照片。實(shí)施發(fā)明的最佳方式[第一方案]
以下對(duì)本發(fā)明的第一方案進(jìn)行說(shuō)明。微孔陣列芯片本發(fā)明的第一方案的微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有多個(gè)微孔,上述微孔具有一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸。本發(fā)明的微孔陣列芯片在與微孔的開(kāi)口相同的基板表面上還具有微孔的標(biāo)記。上述被檢生物體細(xì)胞例如可以是淋巴細(xì)胞，本發(fā)明的微孔陣列芯片例如可用于以一個(gè)單位檢測(cè)抗原特異性淋巴細(xì)胞。第一方案的微孔陣列芯片中，多個(gè)微孔以相同的間隔縱橫配置，優(yōu)選在每組規(guī)定個(gè)數(shù)的微孔上設(shè)置標(biāo)記。特別是在第一方案的微孔陣列芯片中，規(guī)定個(gè)數(shù)的微孔分成各組，設(shè)置于基板的主表面上，并設(shè)置有標(biāo)記，以便掌握各組的位置。例如，圖I表示微孔陣列芯片Ia的平面圖，其中縱橫分別設(shè)置了 3個(gè)IOX 10的微孔Ib的組1C。在各IOX 10的微孔組Ic的四個(gè)角設(shè)置有標(biāo)記Id。另外，設(shè)置在微孔陣列芯片Ia整體的四個(gè)角的標(biāo)記可設(shè)置為可與設(shè)置在各組的四個(gè)角的標(biāo)記區(qū)分并識(shí)別的標(biāo)記。對(duì)構(gòu)成一個(gè)微孔組的微孔數(shù)量沒(méi)有特別限定，例如可以是10-10000的范圍。標(biāo)記可以是只用于顯示位置的材料，也可以是數(shù)字或文字。通過(guò)使用數(shù)字或文字的標(biāo)記，不僅確定各組的位置，也可以特定各組。即，可以賦予各組以編碼。標(biāo)記例如可通過(guò)熒光顯微鏡或圖像掃描儀來(lái)讀取，因此優(yōu)選含有熒光材料或反射材料。熒光材料具體來(lái)說(shuō)是對(duì)于由外部入射的激勵(lì)光具有特定波長(zhǎng)的熒光發(fā)光的材料，優(yōu)選選擇可形成薄膜、可通過(guò)半導(dǎo)體集成電路制作技術(shù)之一的光蝕刻法加工的材料。例如優(yōu)選鄰萘醌二疊氮-酚醛清漆型抗蝕劑，例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)制造的0FPR-800等。反射材料可以選擇加工過(guò)的基板材料、還有在基板上制作的薄膜等。通過(guò)蝕刻或壓痕加工等對(duì)基板材料進(jìn)行加工，例如可以制作與表面保持傾斜的反射結(jié)構(gòu)，或可形成具有文字或信息等的識(shí)別圖案等。另外，通過(guò)在基板材料上形成薄膜，經(jīng)過(guò)蝕刻等加工制作凹凸結(jié)構(gòu)，可以通過(guò)薄膜表面的微細(xì)凹凸、薄膜端面的傾斜來(lái)形成漫反射結(jié)構(gòu)，也可得到與上述同樣的效果。利用熒光觀察微孔內(nèi)的試樣時(shí)，不發(fā)熒光的部分完全看不見(jiàn)。因此為了掌握試樣在基板上的位置，必須進(jìn)行熒光標(biāo)記。對(duì)微孔的形狀和尺寸沒(méi)有特別限定，微孔的形狀例如可以是圓筒形，除圓筒形之夕卜，也可以是由多個(gè)面構(gòu)成的多面體(例如長(zhǎng)方體、六棱柱、八棱柱等)、倒圓錐形、倒角錐形(倒三角錐形、倒四角錐形、倒五角錐形、倒六角錐形、七角以上的倒多角錐形)等，還可·以是將兩種以上這些形狀組合得到的形狀。例如可以是一部分為圓筒形，其余部分為倒圓錐形。為倒圓錐形、倒角錐形時(shí)，底面為微孔的開(kāi)口，不過(guò)也可以是從倒圓錐形、倒角錐形的·頂切除一部分得到的形狀(此時(shí)，微孔的底部平坦)。對(duì)于圓筒形、長(zhǎng)方形，微孔的底部通常是平坦的，不過(guò)也可以制成曲面(凸面或凹面)?？梢詫⑽⒖椎牡撞恐瞥汕娴那樾闻c從倒圓錐形、倒角錐形的頂切除一部分得到的形狀的情形同樣。微孔的形狀或尺寸可考慮要在微孔中容納的生物體細(xì)胞的種類(lèi)(生物體細(xì)胞的形狀或尺寸等)來(lái)適當(dāng)確定，以使一個(gè)微孔中可容納一個(gè)生物體細(xì)胞。為了使一個(gè)微孔中容納一個(gè)生物體細(xì)胞，例如，與微孔的平面形狀內(nèi)切的最大圓的直徑為要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑的O. 5-2倍的范圍、優(yōu)選O. 8-1. 9倍的范圍、更優(yōu)選O. 8-1. 8倍的范圍。微孔的深度為要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑的O. 5-4倍的范圍、優(yōu)選O. 8-1. 9倍的范圍、更優(yōu)選O. 8-1. 8倍的范圍。微孔為圓筒形時(shí)，其尺寸例如可以是直徑3-100 μ m,生物體細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選直徑為4-15 μ m。另外，深度例如可以是3-100 μ m,生物體細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞時(shí)，可優(yōu)選深度為4-40 μ m。不過(guò)，如上所述，微孔的尺寸應(yīng)考慮要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑與微孔尺寸的恰當(dāng)比來(lái)適當(dāng)決定。對(duì)一個(gè)微孔陣列芯片所具有的微孔數(shù)量沒(méi)有特別限定，當(dāng)生物體細(xì)胞為淋巴細(xì)胞時(shí)，從抗原特異性淋巴細(xì)胞的頻度為IO5個(gè)中至少有I個(gè)、約有500個(gè)的角度考慮，Icm2的微孔數(shù)可以是例如2，000-1, 000, 000個(gè)的范圍。第一方案中，為了將細(xì)胞順利取出，優(yōu)選微孔的內(nèi)壁表面形狀是平滑的。表面的凹凸高度可以是0-1. O μ m的范圍，優(yōu)選0-0. 5 μ m的范圍，更優(yōu)選0-0. I μ m的范圍。在微孔內(nèi)壁的任意位置都可以改變凹凸高度。通過(guò)在進(jìn)行了平滑處理的孔內(nèi)壁的一部分上制作凹凸，可以使孔具有功能性。例如，在孔入口附近制作例如高度0.5-1 μπι的突起，則進(jìn)入孔中的細(xì)胞在清洗時(shí)難以流出。該方案相當(dāng)于后述的第二方案。通過(guò)使孔底面帶突起，可以使細(xì)胞不接觸孔底面，而由突起支撐。微孔內(nèi)壁的平滑化可通過(guò)蝕刻進(jìn)行。可適當(dāng)選擇蝕刻裝置的真空度、蝕刻氣體種類(lèi)、蝕刻步驟等。例如使用STS公司的Multiplex ASE蝕刻裝置進(jìn)行微孔內(nèi)壁的平滑化時(shí)，優(yōu)選適當(dāng)設(shè)定蝕刻步驟和保護(hù)膜形成步驟的工藝周期時(shí)間。另外，微孔內(nèi)壁的平滑化也可以通過(guò)濕式蝕刻或?qū)嵫趸襟E與氧化膜蝕刻組合來(lái)進(jìn)行。例如，使用STS公司的Multiplex ASE蝕刻裝置，在微孔內(nèi)壁的任意位置改變凹凸高度時(shí)，通過(guò)改變?cè)撗b置的工藝周期，即可在微孔內(nèi)壁所需的位置形成所需高度的凹凸。濕式蝕刻等中，可通過(guò)適當(dāng)選擇蝕刻液的種類(lèi)、濃度、溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)。還可通過(guò)蝕刻，在孔側(cè)壁的任意位置形成突起。例如通過(guò)前述的STS公司的Multiplex ASE蝕刻裝置，在要形成突起的位置延長(zhǎng)工藝周期時(shí)間，則可在孔側(cè)壁所需的位置形成所需高度的突起。另外，用該裝置以外的蝕刻裝置等，通過(guò)適當(dāng)選擇、改變蝕刻條件，也可以在要形成突起的位置形成突起。第一方案的微孔陣列芯片例如可以是 硅、金屬或樹(shù)脂制的。不過(guò)，如果是硅制，則可直接應(yīng)用目前半導(dǎo)體集成電路制作技術(shù)的主流——硅加工技術(shù)，特別是從精細(xì)加工性、量產(chǎn)性、將來(lái)與包括傳感器的分析電路的集成化來(lái)看，比其它材料優(yōu)異。上述金屬例如可以是鋁、不銹鋼、銅、鎳、鉻、鈦等。上述樹(shù)脂例如有聚酰亞胺、聚乙烯、氯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸酯、聚對(duì)苯
二甲酸乙二醇酯等。微孔陣列芯片例如是硅制，標(biāo)記含有熒光材料時(shí)，對(duì)其制造方法進(jìn)行說(shuō)明。(I)將熒光物質(zhì)(例如東京應(yīng)化0FPR-800)涂布在硅基板的一側(cè)主表面上。熒光物質(zhì)也可以是東京應(yīng)化0FPR-800以外的材料，只要是具有吸收激勵(lì)光并因此由激態(tài)回復(fù)基態(tài)時(shí)釋放能量，發(fā)出熒光的特性的物質(zhì)即可，可適當(dāng)選擇，優(yōu)選可經(jīng)光蝕刻法加工的物質(zhì)。例如也可以用7 >卜公司AZP1350等代替。(2)通過(guò)光蝕刻法，在該表面形成標(biāo)記圖案，為提高熒光物質(zhì)的耐溶劑性，在高溫(例如180°C )下進(jìn)行硬化處理。硬化處理的溫度可根據(jù)熒光物質(zhì)適當(dāng)選擇。(3)硬化處理后，通過(guò)光蝕刻法形成微孔圖案，在低溫(100°C以下)下進(jìn)行硬化。微孔圖案可根據(jù)微孔的尺寸或排列等適當(dāng)決定。硬化溫度可根據(jù)在微孔圖案中所用的光致抗蝕劑材料適當(dāng)決定。(4)通過(guò)干式蝕刻法等形成孔。用于形成孔的干式蝕刻法可適當(dāng)采用公知的方法。(5)用丙酮等有機(jī)溶劑除去在孔圖案掩模中所用的光致抗蝕劑。所用有機(jī)溶劑不限于丙酮。只要是可除去光致抗蝕劑的物質(zhì)，均可適當(dāng)使用。除去光致抗蝕劑后，只有在硅基板上形成的微孔和熒光標(biāo)記殘留在芯片上，可得到第一方案的微孔陣列芯片。下面，當(dāng)微孔陣列芯片例如是硅制、標(biāo)記含有反射性材料時(shí)，對(duì)其制造方法進(jìn)行說(shuō)明。(I)通過(guò)光蝕刻法，在硅基板的一側(cè)主表面上形成標(biāo)記圖案。通過(guò)薄膜等制作反射結(jié)構(gòu)時(shí)，在進(jìn)行光蝕刻前需要預(yù)先在該表面上形成薄膜材料。(2)浸泡在具有蝕刻、例如面方位各向異性蝕刻特性的堿溶液中，例如制作倒錐形的反射結(jié)構(gòu)。當(dāng)有薄膜時(shí)，可適當(dāng)選擇蝕刻方法。(3)通過(guò)光蝕刻來(lái)形成微孔圖案。微孔圖案可根據(jù)微孔的尺寸或排列等適當(dāng)決定。(4)通過(guò)干式蝕刻法等形成孔。用以形成孔的干式蝕刻法可適當(dāng)采用公知的方法。(5)使用光致抗蝕劑剝離液等除去光致抗蝕劑。除去光致抗蝕劑后，只有在硅基板上形成的微孔和反射性標(biāo)記殘留在芯片上，可得到第一方案的微孔陣列芯片。第一方案的微孔陣列芯片中，還可以利用光致發(fā)光結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)利用以電子和空穴等載流子的阻擋現(xiàn)象等為代表的量子效果，例如載流子的密封效果。所使用的光致發(fā)光材料可根據(jù)所需波長(zhǎng)適當(dāng)選擇?？梢栽谛酒咸砑庸庵掳l(fā)光結(jié)構(gòu)，也可以采用在芯片本身中制作進(jìn)光致發(fā)光結(jié)構(gòu)的方法。例如，可以通過(guò)量子效應(yīng)粒子、雜質(zhì)摻雜、多孔材料、薄膜層合形成的量子阱結(jié)構(gòu)或光致發(fā)光材料的成膜，在第一方案的微孔陣列芯片上設(shè)置標(biāo)記。第一方案的微孔陣列芯片可以在具有多個(gè)微孔的主表面上具有疏水性區(qū)域，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。設(shè)置了所述區(qū)域的微孔陣列芯片的概略圖如圖14所示。如圖14所示，通過(guò)設(shè)置成包圍微孔的疏水性區(qū)域，接種于微孔陣列上的含有細(xì)胞等的溶液不會(huì)越過(guò)疏水性區(qū)域擴(kuò)散，因此可以將細(xì)胞懸浮液有效地約束在微孔上。這樣的區(qū)域可以是平面，也可以是溝槽狀。對(duì)其數(shù)量沒(méi)有特別限定，可以設(shè)置一個(gè)，也可以設(shè)置兩個(gè)以上。上述區(qū)域的寬度可根據(jù)接種液量適當(dāng)設(shè)定，例如可以是ΙΟΟμπι-lmm。上述區(qū)域?yàn)闇喜蹱顣r(shí)，其溝槽的深度也可根據(jù)接種液量適當(dāng)設(shè)定，例如可以是5-100 μ m。 上述疏水性區(qū)域例如可以是具有硅表面或含氟表面的區(qū)域。以下作為一個(gè)例子，參照?qǐng)D15，對(duì)于基板為硅制、設(shè)置有具硅表面的溝槽狀疏水性區(qū)域的微孔陳列芯片的制造方法進(jìn)行說(shuō)明。(I)在形成有氧化硅膜32a的硅基板32b (圖15(A))上涂布例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)制造的酚醛清漆樹(shù)脂系正性光致抗蝕劑0FPR-800 (32c)，形成微孔圖案32d。此時(shí)，與微孔圖案同時(shí)形成用于設(shè)置溝槽狀疏水性區(qū)域的圖案32e (圖15(B))。(2)通過(guò)氟酸等除去圖案中露出的氧化硅膜32a(圖15(C))，根據(jù)需要除去光致抗蝕劑32c。通過(guò)采用氟系氣體或離子轟擊的干式蝕刻或利用堿溶液、氟硝酸等的濕式蝕刻法，蝕刻硅。此時(shí)形成微孔32f，同時(shí)，制作了圖案32e的部分中，具有疏水性的硅表面暴露出來(lái)，形成溝槽狀疏水性區(qū)域32g(圖15(D))。(3)除去光致抗蝕劑，可得到設(shè)置有具硅表面的溝槽狀疏水性區(qū)域的微孔陣列芯片，該疏水性區(qū)域包圍微孔(圖15(E))。如上所述，本發(fā)明中，通過(guò)在形成孔的同時(shí)蝕刻硅基板自身，可得到設(shè)置有溝槽狀疏水性區(qū)域的微孔陣列芯片，通過(guò)蝕刻氧化膜，使硅表面暴露出來(lái)，可得到設(shè)置有溝槽狀疏水性區(qū)域的微孔陣列芯片。以下，參照?qǐng)D16，對(duì)所述微孔陣列芯片的制作方法的一個(gè)例子進(jìn)行說(shuō)明。(I)在形成有氧化硅膜42a的硅基板42b (圖16(A))上涂布例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)制造的酚醛清漆樹(shù)脂系正性光致抗蝕劑0FPR-800 (42c)，形成用于設(shè)置溝槽狀疏水性區(qū)域的圖案42e (圖16(B))。(2)通過(guò)氟酸等除去圖案中露出的氧化硅膜42a，使硅暴露出來(lái)(圖16(C))。這里，除去一部分光致抗蝕劑。(3)在該硅基板表面上再一次涂布光致抗蝕劑，形成微孔圖案42d(圖16(D))。通過(guò)氟酸等除去形成的圖案中暴露出的氧化硅膜。(4)通過(guò)采用氟系氣體或離子轟擊的干式蝕刻或利用堿溶液、氟硝酸等的濕式蝕刻法，蝕刻硅(圖16(E))。(5)除去光致抗蝕劑，可得到設(shè)置有具硅表面的溝槽狀疏水性區(qū)域的微孔陣列芯片，該疏水性區(qū)域包圍微孔(圖16(F))。上述疏水性區(qū)域可以是具有含氟表面的區(qū)域。含氟表面可以是氟碳表面；由碳、氟、氫等構(gòu)成的氟樹(shù)脂表面；氟硅表面等。具有含氟表面的疏水性區(qū)域可將氟系防水劑通過(guò)以下的方法設(shè)置例如通過(guò)壓印或印刷進(jìn)行涂布的方法；例如通過(guò)蝕刻在基板上設(shè)置溝槽、向該溝槽中流入氟系防水劑的方法；還可以通過(guò)噴墨法；噴涂法等設(shè)置。上述疏水性區(qū)域可以使用以聚對(duì)亞苯基二甲基(parylene)為代表的聚對(duì)二甲苯樹(shù)脂或硅樹(shù)脂來(lái)設(shè)置。由此也可以在金屬制或樹(shù)脂制的基板上設(shè)置疏水性區(qū)域。標(biāo)記的使用方法將熒光檢測(cè)器中使用的激勵(lì)光通過(guò)反射結(jié)構(gòu)或凹凸形狀表面進(jìn)行漫反射。檢測(cè)器上安裝有去除通常目標(biāo)熒光波長(zhǎng)以外的帶通濾波器，因此在芯片表面全反射的激勵(lì)光不會(huì)入射到檢測(cè)器中。但是漫反射的光可以經(jīng)前段具有帶通濾波器性能的反射鏡進(jìn)行反射，到 達(dá)檢測(cè)器。因此，由位于后段的檢測(cè)器前的帶通濾波器在識(shí)別標(biāo)記時(shí)進(jìn)行排除，漫反射光入 射到檢測(cè)器中。對(duì)于標(biāo)記圖案的形狀，凹形比凸形的識(shí)別性優(yōu)異。[第二方案] 以下對(duì)本發(fā)明的第二方案進(jìn)行說(shuō)明。微孔陣列芯片本發(fā)明的第二方案的微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有多個(gè)微孔,上述微孔具有一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸，上述微孔的開(kāi)口部具有突起部，該突起部使開(kāi)口部狹窄。上述突起部是設(shè)置在基板表面的膜向上述開(kāi)口部突出而形成的。但上述突起部并不限于本方案。以下按照?qǐng)D7，對(duì)設(shè)置在基板表面的膜向上述開(kāi)口部突出而形成上述突起部的方案進(jìn)行說(shuō)明。圖7的㈧和⑶是膜12設(shè)置在基板11的表面、并且具有微孔13的陣列芯片的平面圖和側(cè)面截面圖。微孔3的開(kāi)口部13a不存在突起部。而圖7的(C)、⑶和(E)是膜12’設(shè)置在基板11的表面、并且具有微孔13的陣列芯片的平面圖、側(cè)面截面圖和斜視圖。微孔13的開(kāi)口部13a中存在由膜12’的一部分形成的突起部14。圖8(A)、(B)和(C)是表示與圖7不同的第二方案的微孔陣列芯片的方案的平面圖、側(cè)面截面圖和斜視圖。圖8(A)、(B)和(C)是在基板11的表面設(shè)有膜12”、還具有微孔13的陣列芯片，微孔13的開(kāi)口部13a處存在由膜12”的一部分形成的突起部14’。由突起部14’形成的開(kāi)口形狀與圖7的(E)(方形)不同，為圓形。由突起部形成的開(kāi)口形狀可以是圖7的突起部14和圖8的突起部14’以外的形狀。另外，由突起部形成的開(kāi)口大小為可使要容納到微孔中的生物體細(xì)胞通過(guò)的大小。圖9表示微孔形狀不同的第二方案的微孔陣列芯片方案的側(cè)面截面圖。圖9 (C)是與上述圖7和8同樣的方案,但是相對(duì)于倒四角錐形的微孔，圖9(D)的微孔為方形，圖9(E)的微孔為半球形。不過(guò)，對(duì)微孔的形狀沒(méi)有特別限定，也可以是除此以外的形狀。對(duì)微孔的形狀和尺寸沒(méi)有特別限定，微孔的形狀例如可以是圓筒形，除圓筒形之夕卜，也可以是由多個(gè)面構(gòu)成的多面體(例如長(zhǎng)方體、六棱柱、八棱柱等)、倒圓錐形、倒角錐形(倒三角錐形、倒四角錐形、倒五角錐形、倒六角錐形、七角以上的倒多角錐形)等，還可以是將兩種以上這些形狀組合得到的形狀。例如可以是一部分為圓筒形，其余部分為倒圓錐形。為倒圓錐形、倒角錐形時(shí)，底面為微孔的開(kāi)口，不過(guò)也可以是從倒圓錐形、倒角錐形的頂切除一部分得到的形狀(此時(shí)，微孔的底部平坦)。對(duì)于圓筒形、長(zhǎng)方體，微孔的底部通常是平坦的，不過(guò)也可以制成曲面(凸面或凹面)。可以將微孔的底部制成曲面時(shí)，其情形與從倒圓錐形、倒角錐形的頂切除一部分得到的形狀的情形同樣。微孔的形狀或尺寸可考慮要在微孔中容納的生物體細(xì)胞的種類(lèi)(生物體細(xì)胞的形狀或尺寸等)來(lái)適當(dāng)確定，以使一個(gè)微孔中可容納一個(gè)生物體細(xì)胞。為了使一個(gè)微孔中容納一個(gè)生物體細(xì)胞，例如，與開(kāi)口的平面形狀內(nèi)切的最大圓的直徑為要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑的O. 5-2倍的范圍、優(yōu)選O. 8-1. 9倍的范圍、更優(yōu)選O. 8-1. 8倍的范圍，其中所述開(kāi)口由設(shè)在微孔的開(kāi)口部的突起形成。微孔的深度為要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑的O. 5-4倍的范圍、優(yōu)選O. 8-1. 9倍的范圍、更優(yōu)選O. 8-1. 8倍的范圍?！の⒖诪閳A筒形時(shí)，其尺寸例如可以是直徑3-100 μ m,生物體細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選直徑為4-15 μ m。另外，深度例如可以是3-100 μ m,生物體細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞時(shí)，可優(yōu)選深度為4-40 μπι。不過(guò)，如上所述，微孔的尺寸應(yīng)考慮要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑與微孔尺寸的恰當(dāng)比來(lái)適當(dāng)決定。對(duì)一個(gè)微孔陣列芯片所具有的微孔數(shù)量沒(méi)有特別限定，當(dāng)生物體細(xì)胞為淋巴細(xì)胞時(shí)，從抗原特異性淋巴細(xì)胞的頻度為IO5個(gè)中至少有I個(gè)、約有500個(gè)的角度考慮，Icm2的微孔數(shù)可以是例如2，000-1, 000, 000個(gè)的范圍。與上述第一方案同樣，第二方案中，為了將細(xì)胞順利取出，優(yōu)選微孔的內(nèi)壁表面形狀是平滑的。其詳細(xì)情況如之前第一方案所述。構(gòu)成第二方案的微孔陣列芯片的基板例如可以是硅、金屬或樹(shù)脂制的。不過(guò)，如果是硅制，則可直接應(yīng)用目前半導(dǎo)體集成電路制作技術(shù)的主流——硅加工技術(shù)，特別是從精細(xì)加工性、量產(chǎn)性、將來(lái)與包括傳感器的分析電路的集成化來(lái)看，比其它材料優(yōu)異。構(gòu)成基板的金屬例如可以是鋁、不銹鋼、銅、鎳、鉻、鈦等。構(gòu)成基板的樹(shù)脂例如有聚酰亞胺、聚乙烯、氯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯等。設(shè)于基板表面的膜例如可以是氧化膜、氮化膜、雜質(zhì)擴(kuò)散層、金屬膜或樹(shù)脂膜。氧化膜例如有氧化硅膜、氮氧化硅膜、氧化鋁膜、氧化鈦膜。氮化膜例如有氮化硅膜、氮化鋁膜、氮化鈦膜。雜質(zhì)擴(kuò)散層可以是在硅基板表面高濃度分布硼的層。金屬膜例如有鋁、金、鉬、不銹鋼、銅、鎳、鉻、鈦、鍺、硅鍺等。樹(shù)脂膜例如有聚酰亞胺、聚乙烯、氯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯等。對(duì)設(shè)置于基板表面的膜厚沒(méi)有特別限定，例如是100ηπι-5μπι的范圍。優(yōu)選300nm-l μ m 的范圍?；鍨楣柚茣r(shí)，設(shè)置于基板表面的膜的種類(lèi)可以直接應(yīng)用目前主流的集成電路制造技術(shù)，從量產(chǎn)性、低成本化、可靠性等角度看，優(yōu)選為氧化膜、氮化膜、雜質(zhì)擴(kuò)散層。
基板為硅制時(shí)，從光蝕刻的應(yīng)用、蝕刻選擇性、量產(chǎn)性等觀點(diǎn)看，優(yōu)選設(shè)置于基板表面的膜為樹(shù)脂制。基板為硅制時(shí)，從光蝕刻的應(yīng)用、與傳感器的一體化、膜的耐久性、量產(chǎn)性等觀點(diǎn)看，優(yōu)選設(shè)置于基板表面的膜為金屬制?；鍨榻饘僦茣r(shí)，從蝕刻選擇性、膜的耐熱性、耐久性等提高的觀點(diǎn)看，優(yōu)選設(shè)置于基板表面的膜為金屬制?；鍨榻饘僦茣r(shí)，從光蝕刻的應(yīng)用、蝕刻選擇性等觀點(diǎn)看，優(yōu)選設(shè)置于基板表面的膜為樹(shù)脂制?；鍨榻饘僦茣r(shí)，從成膜的容易性、膜的耐久性或貼合性等觀點(diǎn)看，優(yōu)選設(shè)置于基板表面的膜為氧化膜、氮化膜等?；鍨闃?shù)脂制時(shí)，從低成本以及可利用公知的各種成型、加工技術(shù)的觀點(diǎn)看，優(yōu)選 設(shè)置于基板表面的膜為樹(shù)脂制?；鍨闃?shù)脂制時(shí)，從膜的功能性、加工性、耐久性等觀點(diǎn)看，優(yōu)選設(shè)置于基板表面的膜為金屬制。微孔陣列芯片的制造方法第二方案的微孔陣列芯片例如可通過(guò)以下的方法制造，其制造方法包含以下步驟在基板的至少一側(cè)主表面上形成膜的步驟；在形成的膜上涂布抗蝕劑的步驟；經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)上述抗蝕劑面進(jìn)行曝光，除去抗蝕劑的非硬化部分的步驟；蝕刻上述膜和基板的暴露部分，打微孔陣列形狀的孔的步驟；以及除去抗蝕劑的步驟。以下對(duì)基板為硅制的情形進(jìn)行說(shuō)明。(I)通過(guò)熱CVD、CVD等方法，在洗凈的硅基板表面上形成氧化膜等薄膜。(2)在形成的薄膜上涂布抗蝕劑。(3)經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)抗蝕劑面進(jìn)行曝光，除去抗蝕劑的非硬化部分。即，通過(guò)光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使硅表面暴露。(4)對(duì)膜和基板的暴露部分進(jìn)行蝕刻，打出微孔陣列形狀的孔。蝕刻例如可使用堿蝕刻溶液(例如TMAH :氫氧化四甲基銨等)進(jìn)行。此時(shí)，蝕刻沿基板厚度方向和薄膜下方向進(jìn)行。這里，若進(jìn)行規(guī)定時(shí)間以上的蝕刻，則在形成于硅基板上的微孔入口處形成薄膜的遮沿狀突起。(5)除去抗蝕劑，得到第二方案的微孔陣列芯片。接著，對(duì)基板為金屬制的情形進(jìn)行說(shuō)明。(I)在洗凈的金屬基板表面上形成樹(shù)脂或與基板具有蝕刻選擇性的金屬薄膜，或者對(duì)金屬基板表面進(jìn)行氧化處理、氮化處理，形成薄膜。(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蝕劑。(3)經(jīng)由具有微孔圖案的光掩模，對(duì)光致抗蝕劑面進(jìn)行曝光，除去光致抗蝕劑的未硬化部分。即，通過(guò)光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使基板表面暴露。(4)通過(guò)蝕刻等方法，將基板的暴露部分打出微孔陣列形狀的孔。此時(shí)，蝕刻方法可任意選擇。(5)這里，在向底部方向進(jìn)行蝕刻的同時(shí)也向薄膜下橫向進(jìn)行一些蝕刻，因此形成遮沿狀結(jié)構(gòu)。(6)除去光致抗蝕劑，得到第二方案的微孔陣列芯片。下面，對(duì)基板為樹(shù)脂制的情形進(jìn)行說(shuō)明。(I)在洗凈的樹(shù)脂基板上形成樹(shù)脂或金屬薄膜，或者進(jìn)行改性處理，以提高樹(shù)脂表面的耐性。該改性處理例如可以是UV處理或注入改性材料等。(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蝕劑。 (3)經(jīng)由具有微孔圖案的光掩模，對(duì)光致抗蝕劑面進(jìn)行曝光，除去光致抗蝕劑的未硬化部分。即，通過(guò)光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使基板表面暴露出來(lái)。(4)通過(guò)溶解等方法，在基板的暴露部分打出微孔陣列形狀的孔。此時(shí)，可適當(dāng)選擇用于蝕刻的溶液?；蛘呷绻遄陨砜梢怨馕g刻，則也可以例如以微孔圖案的金屬薄膜作為掩模，進(jìn)行UV曝光，除去曝光部分。此時(shí)，孔的深度可通過(guò)UV曝光量控制。(5)這里，在向底部方向進(jìn)行溶解的同時(shí)也向薄膜下橫向進(jìn)行一些蝕刻，因此形成遮沿狀結(jié)構(gòu)。(6)除去光致抗蝕劑，得到第二方案的微孔陣列芯片。接著，對(duì)硅基板表面設(shè)置有氧化膜的情形進(jìn)行說(shuō)明。(I)通過(guò)熱氧化、熱CVD、等離子體CVD等方法，在洗凈的硅基板上形成氧化膜(氧化硅膜等)。(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蝕劑。(3)經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)光致抗蝕劑面進(jìn)行UV曝光，除去光致抗蝕劑的未硬化部分。即，通過(guò)光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使硅表面暴露出來(lái)。除去光致抗蝕劑。(4)對(duì)基板的暴露部分進(jìn)行蝕刻，打出微孔陣列形狀的孔。蝕刻例如可使用堿蝕刻溶液(例如TMAH :氫氧化四甲基銨等)進(jìn)行。此時(shí)，蝕刻沿基板厚度方向和薄膜下橫向進(jìn)行。這里，若進(jìn)行規(guī)定時(shí)間以上的蝕刻，則在形成于硅基板上的微孔入口處形成薄膜的遮沿狀關(guān)起。(5)由此得到第二方案的微孔陣列芯片。下面，對(duì)硅基板表面設(shè)置有金屬薄膜的情形進(jìn)行說(shuō)明。(I)通過(guò)CVD、電阻加熱蒸鍍、濺射蒸鍍、電子射線蒸鍍等，在硅基板上形成金屬薄膜。(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蝕劑。(3)經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)光致抗蝕劑面進(jìn)行UV曝光，除去光致抗蝕劑的未硬化部分。即，通過(guò)光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使硅表面暴露出來(lái)。此時(shí)，為形成圖案而對(duì)薄膜進(jìn)行蝕刻的方法可適當(dāng)選擇。例如，當(dāng)為鋁時(shí)，使用磷酸+硝酸+乙酸+水的混合酸。這里，如果需要，可以除去光致抗蝕劑。(4)對(duì)基板的暴露部分進(jìn)行蝕刻，打出微孔陣列形狀的孔。蝕刻例如可使用堿蝕刻溶液等進(jìn)行。蝕刻溶液等可適當(dāng)選擇。例如制作由鋁薄膜構(gòu)成的結(jié)構(gòu)時(shí)，使用可蝕刻硅而不蝕刻鋁的蝕刻溶液(例如選擇水合肼。肼不侵蝕大部分的金屬)。此時(shí)，蝕刻沿基板厚度方向和薄膜下橫向進(jìn)行。這里，若進(jìn)行規(guī)定時(shí)間以上的蝕刻，則在形成于硅基板上的微孔入口處形成薄膜的遮沿狀突起。(5)由此得到第二方案的微孔陣列芯片。下面，對(duì)硅基板表面設(shè)置有樹(shù)脂薄膜的情形進(jìn)行說(shuō)明。(I)通過(guò)CVD、涂布、浸潰等方法，在洗凈的硅基板上形成樹(shù)脂薄膜。(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蝕劑。經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)光致抗蝕劑面進(jìn)行UV曝光，除去光致抗蝕劑的未硬化部分。即，通過(guò)光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使硅表面暴露出來(lái)。此時(shí)，為形成圖案而除去樹(shù)脂薄膜的方法可適當(dāng)選擇。例如使用感光 性聚酰亞胺薄膜時(shí)，涂布形成的樹(shù)脂薄膜本身具有圖案形成能力，因此可以省略光致抗蝕劑涂布步驟，只通過(guò)曝光顯影步驟即可進(jìn)行起。(5)由此得到第二方案的微孔陣列芯片。下面，對(duì)硅基板表面設(shè)置有金屬薄膜的情形進(jìn)行說(shuō)明。(I)通過(guò)CVD、電阻加熱蒸鍍、濺射蒸鍍、電子射線蒸鍍等，在硅基板上形成金屬薄膜。(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蝕劑。(3)經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)光致抗蝕劑面進(jìn)行UV曝光，除去光致抗蝕劑的未硬化部分。即，通過(guò)光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使硅表面暴露出來(lái)。此時(shí)，為形成圖案而對(duì)薄膜進(jìn)行蝕刻的方法可適當(dāng)選擇。例如，當(dāng)為鋁時(shí)，使用磷酸+硝酸+乙酸+水的混合酸。這里，如果需要，可以除去光致抗蝕劑。(4)對(duì)基板的暴露部分進(jìn)行蝕刻，打出微孔陣列形狀的孔。蝕刻例如可使用堿蝕刻溶液等進(jìn)行。蝕刻溶液等可適當(dāng)選擇。例如制作由鋁薄膜構(gòu)成的結(jié)構(gòu)時(shí)，使用可蝕刻硅而不蝕刻鋁的蝕刻溶液(例如選擇水合肼。肼不侵蝕大部分的金屬)。此時(shí)，蝕刻沿基板厚度方向和薄膜下橫向進(jìn)行。這里，若進(jìn)行規(guī)定時(shí)間以上的蝕刻，則在形成于硅基板上的微孔入口處形成薄膜的遮沿狀突起。(5)由此得到第二方案的微孔陣列芯片。下面，對(duì)硅基板表面設(shè)置有樹(shù)脂薄膜的情形進(jìn)行說(shuō)明。(I)通過(guò)CVD、涂布、浸潰等方法，在洗凈的硅基板上形成樹(shù)脂薄膜。(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蝕劑。經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)光致抗蝕劑面進(jìn)行UV曝光，除去光致抗蝕劑的未硬化部分。即，通過(guò)光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使硅表面暴露出來(lái)。此時(shí)，為形成圖案而除去樹(shù)脂薄膜的方法可適當(dāng)選擇。例如使用感光性聚酰亞胺薄膜時(shí)，涂布形成的樹(shù)脂薄膜本身具有圖案形成能力，因此可以省略光致抗蝕劑涂布步驟，只通過(guò)曝光顯影步驟即可進(jìn)行樹(shù)脂薄膜的加工。(3)對(duì)基板的暴露部分進(jìn)行蝕刻，打出微孔陣列形狀的孔。蝕刻例如可使用堿蝕刻溶液等進(jìn)行。蝕刻溶液等可適當(dāng)選擇。例如為聚酰亞胺薄膜時(shí)，可以選擇水合肼、乙二胺焦兒茶酚。此時(shí)，蝕刻沿基板厚度方向和薄膜下橫向進(jìn)行。這里，若進(jìn)行規(guī)定時(shí)間以上的蝕亥IJ，則在形成于硅基板上的微孔入口處形成薄膜的遮沿狀突起。(4)由此得到第二方案的微孔陣列芯片。
下面，對(duì)硅基板表面設(shè)置有氮化硅膜的情形進(jìn)行說(shuō)明。(I)通過(guò)CVD、濺射蒸鍍等方法，在洗凈的硅基板上形成氮化硅薄膜。(2)在形成的薄膜上涂布光致抗蝕劑。(3)經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)光致抗蝕劑面進(jìn)行UV曝光，除去光致抗蝕劑的未硬化部分。即，通過(guò)光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使硅表面暴露。除去光致抗蝕劑。(4)對(duì)基板的暴露部分進(jìn)行蝕刻，打出微孔陣列形狀的孔。蝕刻例如可使用堿蝕刻溶液(例如TMAH :氫氧化四甲基銨等)進(jìn)行。此時(shí)，蝕刻沿基板厚度方向和薄膜下橫向進(jìn)行。這里，若進(jìn)行規(guī)定時(shí)間以上的蝕刻，則在形成于硅基板上的微孔入口處形成薄膜的遮沿狀關(guān)起。(5)由此得到第二方案的微孔陣列芯片。 下面，對(duì)硅基板表面設(shè)置有雜質(zhì)擴(kuò)散膜的情形進(jìn)行說(shuō)明。(I)在洗凈的硅基板上涂布光致抗蝕劑。經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)光致抗蝕劑面進(jìn)行UV曝光，除去光致抗蝕劑的未硬化部分。即，通過(guò)光蝕刻法，在薄膜上形成微孔圖案，使孔圖案部分以外的硅表面暴露。(2)清洗基板，通過(guò)熱擴(kuò)散法、離子注入等方法，將硼以高濃度(_102°/cm2左右)擴(kuò)散到硅暴露的部分。擴(kuò)散源除硼以外還可以是鍺、硅鍺等?？赏ㄟ^(guò)熱處理(Drive-in)控制擴(kuò)散層厚，其中所述熱處理是為了加深擴(kuò)散。此時(shí)，向熱處理爐中導(dǎo)入氧，在表面形成氧化娃膜。(3)孔的蝕刻例如可使用堿蝕刻溶液(例如TMAH :氫氧化四甲基銨等)進(jìn)行。此時(shí)，未擴(kuò)散有硼的娃表面容易被蝕刻，但硼高濃度擴(kuò)散的娃表面難以被蝕刻。因此蝕刻是對(duì)未擴(kuò)散硼的孔圖案部分選擇性地進(jìn)行。蝕刻沿基板厚度方向和薄膜下橫向進(jìn)行。這里，若進(jìn)行規(guī)定時(shí)間以上的蝕刻，則在形成于硅基板上的微孔入口處形成薄膜的遮沿狀突起。(4)由此得到第二方案的微孔陣列芯片。第二方案的微孔陣列芯片可以在具有多個(gè)微孔的主表面上具有疏水性區(qū)域，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。上述區(qū)域的詳細(xì)情況如之前第一方案所述。[第三方案]以下對(duì)本發(fā)明的第三方案進(jìn)行說(shuō)明。微孔陣列芯片本發(fā)明的第三方案的微孔陣列芯片是具有多個(gè)微孔、用于在各微孔中容納一個(gè)被檢生物體細(xì)胞的硅制微孔陣列芯片，上述微孔具有一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸。上述被檢生物體細(xì)胞例如可以是淋巴細(xì)胞，本發(fā)明的微孔陣列芯片例如可用于以一個(gè)單位檢測(cè)抗原特異性淋巴細(xì)胞。對(duì)微孔的形狀和尺寸沒(méi)有特別限定，微孔的形狀例如可以是圓筒形，除圓筒形之夕卜，也可以是由多個(gè)面構(gòu)成的多面體(例如長(zhǎng)方體、六棱柱、八棱柱等)、倒圓錐形、倒角錐形(倒三角錐形、倒四角錐形、倒五角錐形、倒六角錐形、七角以上的倒多角錐形)等，還可以是將兩種以上這些形狀組合得到的形狀。例如可以是一部分為圓筒形，其余部分為倒圓錐形。為倒圓錐形、倒角錐形時(shí)，底面為微孔的開(kāi)口，不過(guò)也可以是從倒圓錐形、倒角錐形的頂切除一部分得到的形狀(此時(shí)，微孔的底部平坦)。對(duì)于圓筒形、長(zhǎng)方體，微孔的底部通常是平坦的，不過(guò)也可以制成曲面(凸面或凹面)?？梢詫⑽⒖椎牡撞恐瞥汕鏁r(shí)，其情形與從倒圓錐形、倒角錐形的頂切除一部分得到的形狀的情形同樣。微孔的形狀或尺寸可考慮要在微孔中容納的生物體細(xì)胞的種類(lèi)(生物體細(xì)胞的形狀或尺寸等)來(lái)適當(dāng)確定，以使一個(gè)微孔中可容納一個(gè)生物體細(xì)胞。為了使一個(gè)微孔中容納一個(gè)生物體細(xì)胞，例如，與微孔的平面形狀內(nèi)切的最大圓的直徑為要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑的O. 5-2倍的范圍、優(yōu)選O. 8-1. 9倍的范圍、更優(yōu)選O. 8-1. 8倍的范圍。微孔的深度為要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑的O. 5-4倍的范圍、優(yōu)選O. 8-1. 9倍的范圍、更優(yōu)選O. 8-1. 8倍的范圍。微孔為圓筒形時(shí)，其尺寸例如可以是直徑3-100 μ m,生物體細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選直徑為4-15 μ m。另外，深度例如可以是3-100 μ m,生物體細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞時(shí)，可優(yōu) 選深度為4-40 μπι。不過(guò)，如上所述，微孔的尺寸應(yīng)考慮要容納在微孔中的生物體細(xì)胞直徑與微孔尺寸的恰當(dāng)比來(lái)適當(dāng)決定。對(duì)一個(gè)微孔陣列芯片所具有的微孔數(shù)量沒(méi)有特別限定，當(dāng)生物體細(xì)胞為淋巴細(xì)胞時(shí)，從抗原特異性淋巴細(xì)胞的頻度為IO5個(gè)中至少有I個(gè)、約有500個(gè)的角度考慮，Icm2的微孔數(shù)可以是例如2，000-1, 000, 000個(gè)的范圍。與上述第一和第二方案同樣，第三方案中，為了將細(xì)胞順利取出，優(yōu)選微孔的內(nèi)壁表面形狀是平滑的。其詳細(xì)情況如之前第一方案中所述。本發(fā)明的第三方案的微孔陣列芯片是硅制的。通過(guò)采用硅制芯片，可直接應(yīng)用目前半導(dǎo)體集成電路制作技術(shù)的主流——娃加工技術(shù)，特別是從精細(xì)加工性、量產(chǎn)性、將來(lái)與包含傳感器的分析電路等的集成化來(lái)看，比其它材料優(yōu)異。并且，如果第三方案的微孔陣列芯片是硅制、基板表面被氧化硅膜覆蓋，則從該芯片表面的親水性、膜的穩(wěn)定性、量產(chǎn)性角度考慮優(yōu)選。硅表面通常為疏水性，接種細(xì)胞懸浮液時(shí)，具有排斥細(xì)胞懸浮液的性質(zhì)，會(huì)妨礙生物細(xì)胞容納到微孔中。因此，從比硅具有親水性、且是穩(wěn)定的膜的觀點(diǎn)看，優(yōu)選氧化硅膜。第三方案的微孔陣列芯片優(yōu)選微孔內(nèi)面被氟碳膜或氧化硅膜覆蓋。通過(guò)微孔的內(nèi)面形成氟碳膜或氧化硅膜等惰性且排他性的表面，可以防止生物體細(xì)胞的粘附，使生物體細(xì)胞從微孔的回收變得容易，因此優(yōu)選。S卩，在微孔等中處理生物體細(xì)胞時(shí)，微孔內(nèi)部會(huì)有生物體細(xì)胞粘附的問(wèn)題。特別是從微孔回收微孔內(nèi)的生物體細(xì)胞時(shí)，生物體細(xì)胞的粘附是一個(gè)大的問(wèn)題。為解決該問(wèn)題，本發(fā)明中，優(yōu)選生物體細(xì)胞所接觸的微孔內(nèi)部形成氟碳膜或氧化硅膜等膜。氟碳膜是具有防水性的膜，優(yōu)選只在孔內(nèi)部形成防水性膜，如前所述，微孔陣列芯片的孔以外的表面優(yōu)選為氧化硅膜。盡管氧化硅膜不顯示氟碳膜那樣的防水性，但具有可防止生物體細(xì)胞粘附的效果。特別是通過(guò)干燥氧進(jìn)行的高溫?zé)嵫趸?，由該方法制作的氧化硅膜，其膜致密，雖然不顯示象氟碳膜那樣的可形成水珠程度的防水性，但顯示親水性和斥水性之間的性質(zhì)。通常，生物體細(xì)胞分散在溶液中進(jìn)行處理，因此，如果微孔陣列芯片整體具有防水性或疏水性的表面，則生物體細(xì)胞有難以容納到孔中的傾向。因此，本發(fā)明中，優(yōu)選孔以外的表面覆蓋氧化硅膜，只有孔內(nèi)部選擇性地形成氟碳膜或氧化硅膜。
不過(guò)，以通常的處理方法形成氟碳膜時(shí)，是在孔制作后進(jìn)行膜的形成。因此基板整體被氟碳膜覆蓋，基板表面也具有了防水性。因此本發(fā)明采用以下的方法。以使用硅基板的微孔陣列芯片為例，對(duì)該方法進(jìn)行說(shuō)明。通過(guò)光蝕刻法，在硅基板上形成微孔圖案。此時(shí)的光致抗蝕劑硬化溫度在100°C以下進(jìn)行。接著，通過(guò)干腐蝕用真空裝置形成微孔。確認(rèn)制作好微孔后，向真空裝置內(nèi)導(dǎo)入CF系氣體，進(jìn)行等離子體CVD。等離子體CVD可以直接使用蝕刻裝置，也可以用另外的CVD裝置進(jìn)行。成膜數(shù)分鐘后，從真空裝置中取出基板，浸泡到甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑中。由此，其上的氟碳膜也與微孔圖案掩模一起被移走，只有微孔內(nèi)壁殘留有氟碳膜。對(duì)于蝕刻和成膜步驟，只需改變氣體種類(lèi)即可用相同的裝置應(yīng)對(duì)。如前所述，可以用硅氧化膜代替氟碳膜覆蓋孔內(nèi)面。用硅氧化膜代替氟碳膜覆蓋孔內(nèi)面，也可以得到生物體細(xì)胞由孔回收的回收率改善效果。 以下對(duì)用硅氧化膜覆蓋孔內(nèi)面的方法進(jìn)行說(shuō)明。這種情況下，如果在形成孔圖案后除去光致抗蝕劑，然后形成熱氧化膜等，則可得到用硅氧化膜覆蓋孔內(nèi)面的微孔陣列芯片。通過(guò)在孔內(nèi)部形成多孔硅，以此代替氟碳膜或硅氧化膜，也可得到具有抑制生物體細(xì)胞與孔內(nèi)面粘附的效果的微孔陣列芯片。多孔硅可通過(guò)陽(yáng)極作用等方法制作孔內(nèi)面。除氟碳膜、硅氧化膜、多孔硅以外，也可以對(duì)本發(fā)明的微孔陣列芯片實(shí)施抑制活性娃表面的處理,或形成膜。第三方案的微孔陣列芯片可以在具有多個(gè)微孔的面上具有疏水性區(qū)域，該疏水性區(qū)域設(shè)置成包圍上述多個(gè)微孔。上述疏水性區(qū)域的詳細(xì)情況如之前的第一方案所述。如前所述，第三方案的微孔陣列芯片中，用氟碳膜覆蓋微孔內(nèi)面時(shí)，上述區(qū)域也一并被氟碳膜覆蓋，形成疏水性區(qū)域。
實(shí)施例實(shí)施例I(熒光標(biāo)記)圖I是本發(fā)明第一方案的裝置的實(shí)施方案例。圖I是在硅材料等的基板上面Ia形成多個(gè)微孔Ib的微孔陣列芯片。為了容易地進(jìn)行位置識(shí)別，微孔Ib以適當(dāng)?shù)臄?shù)量單位(例如10X10 :100個(gè))形成群lc。該微孔陣列芯片的用途之一是向各孔中導(dǎo)入附加有熒光物的評(píng)價(jià)對(duì)象，確認(rèn)其熒光發(fā)光。此時(shí)，通過(guò)熒光顯微鏡、熒光掃描儀等進(jìn)行的觀察是按照熒光波長(zhǎng)的規(guī)格進(jìn)行的，因此無(wú)法觀察到熒光不發(fā)光的細(xì)胞。因此，如圖I所示，各群之間形成有熒光物質(zhì)的微小的標(biāo)記Id。該標(biāo)記的制作方法如下(圖2)。以在硅材料等基板上形成的微孔為例，以下給出兩種制作方法。標(biāo)記制作法⑴(I)在帶有氧化硅膜2a的硅基板2b(圖2(1) (A))上涂布例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)制造的酚醛清漆樹(shù)脂系正性光致抗蝕劑0FPR-800，在基板上形成標(biāo)記圖案2c(圖2(1)⑶)。(2)為了通過(guò)熱交聯(lián)等提高光致抗蝕劑的耐化學(xué)品性，在180°C、將基板進(jìn)行30分鐘的硬化等處理。(3)再次涂布光致抗蝕劑2d，在硅基板2b上形成制作微孔所必需的開(kāi)口圖案2e(圖2(1) (C)和(D))。此時(shí)，顯影后的硬化以100-110°C左右的低溫進(jìn)行。(4)用氟酸除去開(kāi)口部的氧化硅膜2a，使硅暴露。(5)通過(guò)干式蝕刻法等蝕刻硅基板2b，制作微孔2f (圖2(1) (E))。(6)用甲醇、丙酮等除去(3)中涂布的光致抗蝕劑2d，得到第一方案的微孔陣列芯片(圖 2(1) (F))。標(biāo)記制作法(II)(I)在帶有氧化硅膜2a的硅基板2b(圖2(11) (A))上涂布例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)制造的酚醛清漆樹(shù)脂系正性光致抗蝕劑0FPR-800，在基板上形成標(biāo)記圖案2c(圖·2(11) (B))。(2)為了通過(guò)熱交聯(lián)等提高光致抗蝕劑的耐化學(xué)品性，在180°C、將基板進(jìn)行30分鐘的退火等處理。(3)再次涂布光致抗蝕劑2d，在硅基板2b上形成制作微孔所必需的開(kāi)口圖案2e(圖2(11) (C)和(D))。此時(shí)，顯影后的熱處理以100-110°C左右的低溫進(jìn)行。(4)用氟酸除去開(kāi)口部的氧化硅膜2a，使硅暴露(圖2(11) (E))。(5)在此用丙酮等有機(jī)溶劑除去形成孔圖案的光致抗蝕劑。(6)以硅基板2b上的氧化硅膜2a作為掩模，通過(guò)干腐蝕法等方法對(duì)硅基板2b進(jìn)行蝕刻，制作微孔2f，由此得到第一方案的微孔陣列芯片(圖2(11) (F))。根據(jù)標(biāo)記制作法(II)，在孔形成后除去光致抗蝕劑時(shí)，在干腐蝕步驟中，光致抗蝕劑改性，不會(huì)有難以除去的問(wèn)題。另外，通過(guò)等離子體效果，所形成的硅基板表面以該狀態(tài)即可得到超親水性表面。由以上的步驟，可容易地制作圖2的形狀。標(biāo)記2c的圖案可自由選擇成圖形、記號(hào)、文字等。另外，除標(biāo)記外，還可以在微芯片上表示信息等。實(shí)施例2(反射標(biāo)記)圖3是在硅基板3a上形成凹凸，與上述同樣，其漫反射光可通過(guò)熒光顯微鏡、熒光掃描儀進(jìn)行觀察的反射標(biāo)記3d的實(shí)施方案?？捎糜谠诠杌?a上排列很多的微孔3b群的位置識(shí)別等的標(biāo)記等。通過(guò)蝕刻等，在基板上制作凹陷3e，使熒光激勵(lì)光在凹陷處漫反射，導(dǎo)入觀察裝置，由此可識(shí)別凹陷位置。圖4表示其原理。當(dāng)光入射到象圖左側(cè)那樣的沒(méi)有任何凹凸等的基板4a表面時(shí)，由于全反射，沒(méi)有激勵(lì)光入射到觀察裝置中。但是，象右側(cè)，由于凹陷4b，使激勵(lì)光漫反射成放射狀，有反射光入射到觀察裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，可以進(jìn)行識(shí)別。從使激勵(lì)光漫反射成放射狀的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選凹陷4b的底部為倒錐形。基板為硅基板時(shí)，根據(jù)圖5和6，對(duì)具有反射標(biāo)記的微孔陣列芯片的制造例進(jìn)行說(shuō)明。(I)在帶有氧化硅膜5a的硅基板5b (圖5 (A))上涂布例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)制造的酚醛清漆樹(shù)脂系正性光致抗蝕劑0FPR-800 (5c)，在基板上形成標(biāo)記圖案5d (圖5 (B))。(2)用氟酸除去光致抗蝕劑5c開(kāi)口處的氧化娃膜5a,使娃暴露(圖5(C))。
(3)除去光致抗蝕劑5c，將硅基板5b浸泡在氫氧化四甲基銨或氫氧化鉀等堿蝕刻液中，進(jìn)行各向異性蝕刻，制作凹陷結(jié)構(gòu)5e (圖5(D))。此時(shí)，本發(fā)明的標(biāo)記完成。然后制作微孔陣列結(jié)構(gòu)。(4)這里，如有需要，可再次在基板5b表面追加形成氧化硅膜或氮化硅膜等掩模薄膜(圖6(A))。(5)再次涂布光致抗蝕劑5f (圖6(B))，形成微孔圖案5g，通過(guò)蝕刻劑除去開(kāi)口部的氧化硅膜或氮化硅膜等，使硅暴露(圖6 (C))。(6)如果需要，除去光致抗蝕劑5f，通過(guò)干式蝕刻、濕式蝕刻，制作微孔5h(圖60 )。(7)根據(jù)需要，除去光致抗蝕劑5f，得到第一方案的微孔陣列芯片(圖6(E))。實(shí)施例3 (遮沿結(jié)構(gòu)實(shí)施例) 圖7表示由本發(fā)明的第二方案制作的微孔結(jié)構(gòu)。本結(jié)構(gòu)只要是半導(dǎo)體基板、樹(shù)脂基板等與加工時(shí)上面薄膜的材料加工容易程度有選擇性，即可實(shí)現(xiàn)。在(100)面硅基板11表面上形成的微孔13的開(kāi)口直徑、深度都是數(shù)微米至數(shù)十微米。未形成孔的表面被氧化膜或金屬等薄膜層12’覆蓋。在通過(guò)對(duì)基板進(jìn)行蝕刻而形成的孔的開(kāi)口部13a上附有由薄膜層12’形成的遮沿狀突起部14。薄膜層12’的厚度在形成時(shí)控制在數(shù)百納米至數(shù)微米。由薄膜層12’形成的遮沿狀突起部14在蝕刻并形成微孔13時(shí)，可通過(guò)薄膜層12’不被過(guò)度蝕刻，且對(duì)基板蝕刻到薄膜層12’的下部的蝕刻方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。本實(shí)施例中，在圖9中例如使用代表性的半導(dǎo)體基板-硅來(lái)說(shuō)明其制作過(guò)程。(I)熱氧化(100)硅基板11，在表面形成最厚為數(shù)微米左右的薄膜層12。[圖9(A)](2)通過(guò)光蝕刻步驟，將孔圖案15轉(zhuǎn)印在硅基板11上，只有孔部分暴露硅。[圖9(B)](3)將硅在氫氧化四甲基銨水溶液(90°C、25% )中浸泡數(shù)十分鐘，進(jìn)行蝕刻。蝕刻時(shí)間根據(jù)所需孔的深度d和遮沿的大小w來(lái)決定。[圖8 (B)](4)蝕刻規(guī)定的時(shí)間，將硅基板從蝕刻溶液中取出。經(jīng)過(guò)以上的步驟，可形成圖9(C)的結(jié)構(gòu)。這里所用的氫氧化四甲基銨水溶液對(duì)氧化膜的蝕刻慢，對(duì)孔側(cè)面方向的蝕刻快，因此可形成氧化膜下的中空結(jié)構(gòu)。第二方案的微孔陣列芯片可以是圖9(D)和(E)的結(jié)構(gòu)。具有圖9(D)和(E)結(jié)構(gòu)的微孔的陣列芯片可以將上述方法進(jìn)行以下變更來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，選擇硅基板時(shí)，圖9 (D)通過(guò)適當(dāng)選擇RIE干式蝕刻、基板面方位或孔圖案來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，基板面方位為(100)或(110)、(111)面，可選擇使與基板表面垂直的蝕刻面露出的圖案形狀。圖9(E)可通過(guò)顯示各向同性蝕刻特性的蝕刻方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，通常的干式蝕刻或通過(guò)氟酸和硝酸的混合液進(jìn)行的蝕刻中，硅被各向同性地蝕刻，因此可容易地得到本發(fā)明的第二方案的結(jié)構(gòu)。薄膜層不限于氧化膜，可以改為有高濃度雜質(zhì)擴(kuò)散的硅、鍺、硅鍺、金屬薄膜、樹(shù)脂等。蝕刻可以是濕式蝕刻、干式蝕刻等的任何形式。濕式蝕刻中，可以將基板一并進(jìn)行處理，因此產(chǎn)品量產(chǎn)效率優(yōu)異。
將由上述方法得到的微孔陣列芯片的各尺寸(圖10所示)變更為表I的記載，評(píng)價(jià)微孔陣列芯片的陣列比率(填充率)。結(jié)果如表I所示。所接種的細(xì)胞濃度為IO5個(gè)細(xì)胞 /μ L。細(xì)胞陣列比率(填充率)的評(píng)價(jià)方法I.由小鼠采集淋巴細(xì)胞。此時(shí)，所得細(xì)胞的濃度為I微升中含IO4-IO5個(gè)細(xì)胞(IO4-IO5個(gè)細(xì)胞/μ L)。為了保存，將細(xì)胞裝入HBSS(Hank’ S平衡鹽溶液)中。2.對(duì)各細(xì)胞進(jìn)行熒光染色。將各細(xì)胞用CellTracker Orange進(jìn)行染色，該染色物質(zhì)對(duì)測(cè)定中使用的熒光掃描儀的激勵(lì)波長(zhǎng)(532nm)發(fā)出熒光。3.將染色的細(xì)胞用微量移液器鋪于硅芯片上。重復(fù)接種3次，最后清洗除去未進(jìn)入孔中的細(xì)胞。4.用蓋玻片覆蓋，以防芯片干燥，用微陣列掃描儀讀取熒光強(qiáng)度?！?.選擇芯片上4500個(gè)孔，計(jì)數(shù)其中發(fā)熒光的孔數(shù)。陣列比率(填充率)由以下的式子計(jì)算。陣列比率(填充率)=(發(fā)熒光的孔數(shù)/4500) X 100表I樣品的遮沿與孔的尺寸和陣列比率(填充率)的關(guān)系
,I"H陣列(填充)
dP2r Wl W2
;比率樣品a 9.2 μτη 13.0 μιη 12 μιη 0.5 μπι 2.7 μιη 73%祥品 B 11,8 μπι 16.7 μηι 13.9 μηι 1,4 μπι 5.0 μιη 24.9%對(duì)樣品A和B研究其遮沿及孔的尺寸的不同會(huì)引起陣列(填充)比率怎樣變化。結(jié)果，細(xì)胞直徑為8μπι時(shí)，樣品B的陣列(填充)比率比樣品A的陣列(填充)比率差。這可能由于樣品B的開(kāi)口直徑2r過(guò)大。陣列(填充)比率是孔越深則比率越高，但象樣品B那樣開(kāi)口大，則陣列(填充)比率可見(jiàn)減少的傾向。因此，孔的設(shè)計(jì)優(yōu)選適當(dāng)選擇其深度、開(kāi)口直徑、遮沿尺寸來(lái)進(jìn)行。實(shí)施例4(氟碳膜形成實(shí)施例)圖11是本發(fā)明第三方案的微孔陣列芯片的概略說(shuō)明圖。硅基板21a表面上排列很多微孔圖案21b，其各微孔21b的尺寸為數(shù)微米至數(shù)十微米。形成的各孔側(cè)壁上形成由CxFy系氣體形成的氟碳膜21c，由于表面能量低的效果而成惰性狀態(tài)。顯示疏水性的氟碳膜21c在微孔內(nèi)部選擇性地成膜，不存在于硅的最表面21d。因此，進(jìn)入微孔21b的生物體細(xì)胞A難以粘附，微孔內(nèi)部設(shè)有氟碳膜的效果在微孔深時(shí)特別明顯地表現(xiàn)出來(lái)。使用硅基板的微孔陣列芯片的制作步驟如圖12所示。(I)在形成了氧化硅膜22a的硅基板22b上涂布例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)制造的酚醛清漆樹(shù)脂系正性光致抗蝕劑0FPR-800(22c)，形成微孔圖案22d。此時(shí)，顯影后的熱處理以比通常低的溫度(100-110°C左右)進(jìn)行。
(2)向等離子體干式蝕刻裝置中導(dǎo)入SF6等硅蝕刻氣體，蝕刻硅基板22b，形成微孔 22θ ο(3)向該蝕刻裝置中導(dǎo)入CxFy系氣體，進(jìn)行等離子體成膜。此時(shí)，在孔內(nèi)部、硅基板表面上形成氟碳膜22f。該步驟可以是將基板搬運(yùn)到等離子體CVD裝置等中，進(jìn)行同樣的處理。(4)將從裝置中取出的基板浸泡在甲醇或丙酮等有機(jī)溶劑中，除去光致抗蝕劑。此時(shí)，在抗蝕劑上形成的氟碳膜也一起被移走。(5)可得到硅基板最表面形成氧化硅膜22a、孔內(nèi)部形成惰性氟碳膜22f的微孔陣列芯片。按照與實(shí)施例3同樣的方法，對(duì)由上述方法得到的微孔陣列芯片的陣列比率(填 充率)進(jìn)行評(píng)價(jià)。收集率由下述方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果如表2所示。表2也給出了孔內(nèi)部未形成氟碳膜的微孔陣列芯片的評(píng)價(jià)結(jié)果。對(duì)于各樣品，選擇孔直徑和深度相同的孔。所接種的細(xì)胞濃度為IO5個(gè)細(xì)胞/ μ L。收集率評(píng)價(jià)方法I.按照上述細(xì)胞陣列比率評(píng)價(jià)法向微孔陣列中接種細(xì)胞。2.選出任意的多個(gè)(10-30個(gè)左右)的孔，用顯微操作器從孔中取出細(xì)胞。此時(shí)，不要主動(dòng)取出，要注意對(duì)各孔的取出條件不要有偏差。3.以可取出細(xì)胞的孔數(shù)相對(duì)于任意選擇的孔數(shù)的比例表示為收集率。收集率=(可取出細(xì)胞的孔數(shù)/任意選擇的孔數(shù))X 100表2
樣品~BI-C~E ~F
~陣歹Ij (填充)比率 99. 4%99. 2% 99. 2% 99. 4% 99. 3% 98. 9%
收集率0%10%6. 7%50%30% 89. 3%樣品規(guī)格孔徑11 μ m，深度30 μ m樣品A-C 無(wú)涂膜，蝕刻時(shí)間8分鐘 樣品D-F 有涂膜，蝕刻時(shí)間8分鐘+涂膜時(shí)間I分鐘實(shí)施例5孔內(nèi)具有氧化膜(氧化硅)的微孔陣列芯片的制作(參照?qǐng)D13)(I)在形成了氧化硅23a的硅基板23b上涂布例如東京應(yīng)化工業(yè)(株)制造的酚醛清漆樹(shù)脂系正性抗蝕劑0FPR-800，形成微孔圖案23d。(2)向等離子體干式蝕刻裝置中導(dǎo)入SF6等硅蝕刻氣體，蝕刻硅基板23b，形成微孔 23θ ο(3)將從裝置中取出的基板用硫酸和過(guò)氧化氫水的混合液等抗蝕劑剝離液除去基板上的光致抗蝕劑。(4)用所謂的RCA清洗，即氨清洗(氨+過(guò)氧化氫水+水)、鹽酸清洗(鹽酸+過(guò)氧化氫水+水)清洗基板。
(5)將基板導(dǎo)入干燥氧氣氛中的熱處理爐，在1100°C進(jìn)行30分鐘熱氧化處理。(6)溫度降下后從熱處理爐中取出。(7)在此硅基板表面、孔內(nèi)形成氧化膜23f，可制作孔內(nèi)具有氧化膜(氧化硅)的微孔陣列芯片。按照與上述同樣的方法，對(duì)由上述方法得到的微孔陣列芯片的陣列比率(填充率)和收集率進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果如表3所示。對(duì)于各樣品，選擇孔直徑和深度相同的孔。所接種的細(xì)胞濃度為IO5個(gè)細(xì)胞/ μ L。表權(quán)利要求
1.回收單個(gè)樣品生物細(xì)胞的方法，其包含在硅制的、包含多個(gè)微孔的微孔陣列芯片的每一微孔中儲(chǔ)存單個(gè)樣品生物細(xì)胞；以及，從所述的微孔中回收所述儲(chǔ)存的單個(gè)樣品生物細(xì)胞，其中，所述微孔的形狀和尺寸僅容納一個(gè)生物細(xì)胞，且其中所述微孔的內(nèi)壁涂覆防水膜以防止生物細(xì)胞粘附于所述微孔的內(nèi)壁，且易于從所述微孔回收所儲(chǔ)存生物細(xì)胞。
2.權(quán)利要求I所述的回收單個(gè)樣品生物細(xì)胞的方法，其中，所述單個(gè)生物細(xì)胞是與特異抗原反應(yīng)的抗原特異性B淋巴細(xì)胞。
3.權(quán)利要求I或2所述的回收單個(gè)樣品生物細(xì)胞的方法，其中，所述的方法還包括在回收步驟前檢測(cè)所述的B淋巴細(xì)胞。
4.權(quán)利要求I一 3中任一項(xiàng)的回收單個(gè)樣品生物細(xì)胞的方法，其中，其中上述微孔是圓筒形、由多個(gè)面構(gòu)成的多面體、倒圓錐形或倒角錐形、或上述兩種以上形狀的組合形狀。
5.權(quán)利要求I一 4中任一項(xiàng)的回收單個(gè)樣品生物細(xì)胞的方法，其中，其中與所述微孔陣列芯片的微孔的平面形狀內(nèi)切的最大圓的直徑是要容納到微孔中的生物細(xì)胞直徑的O. 5-2 倍，且微孔的深度是要容納到微孔中的生物細(xì)胞直徑的O. 5-4倍。
6.權(quán)利要求I一 5中任一項(xiàng)的回收單個(gè)樣品生物細(xì)胞的方法，其中，其中所述微孔陣列芯片還包括包圍所述多個(gè)微孔的疏水性區(qū)域。
7.權(quán)利要求6的回收單個(gè)樣品生物細(xì)胞的方法，其中所述疏水性區(qū)域具有硅表面或含氟表面。
8.權(quán)利要求I一 7中任一項(xiàng)的方法，其中，所述非所述微孔內(nèi)壁的所述微孔陣列芯片的表面不是疏水的。
9.權(quán)利要求I一 8中任一項(xiàng)的方法，其中，所述的疏水膜是氟碳膜。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有多個(gè)微孔，上述微孔具有在一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸，在與微孔的開(kāi)口相同的基板表面上具有微孔的標(biāo)記。還涉及一種微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片在基板的一側(cè)主表面上具有多個(gè)微孔，上述微孔具有在一個(gè)微孔中僅可容納一個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸，上述微孔的開(kāi)口部具有突起部，使開(kāi)口部變狹窄。又涉及上述微孔陣列芯片的制造方法，該方法具有以下步驟在基板的至少一側(cè)主表面上形成膜的步驟；在形成的膜上涂布抗蝕劑的步驟；經(jīng)由具有微孔圖案的掩模，對(duì)上述抗蝕劑面進(jìn)行曝光，除去抗蝕劑的非硬化部分的步驟；蝕刻上述膜和基板的暴露部分，打微孔陣列形狀的孔的步驟；以及除去抗蝕劑的步驟。還涉及一種微孔陣列芯片，該微孔陣列芯片具有多個(gè)微孔，是用于在各微孔中容納1個(gè)被檢生物體細(xì)胞的硅制微孔陣列芯片。上述微孔具有在一個(gè)微孔中僅可容納1個(gè)生物體細(xì)胞的形狀和尺寸。
文檔編號(hào)G01N37/00GK102928584SQ20121036398
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2004年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月25日
發(fā)明者村口篤, 岸裕幸, 時(shí)光善溫, 近藤佐千子, 小幡勤, 藤城敏史, 橫山義之, 鍋澤浩文, 高林外廣, 谷野克巳 申請(qǐng)人:富山縣政府, 維渦里斯公司