一種非侵入性精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種非侵入性精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法，包括以下步驟：運用色散型共聚焦拉曼光譜儀進行分析，選擇激發(fā)拉曼光譜，將精子細胞置反射光鏡下中，通過一定的激發(fā)功率和曝光時間可采集到精子細胞的化學(xué)基團光譜。分別對精子頂體、頸部、尾部大小劃分掃描區(qū)域重復(fù)掃描三次，即可獲得拉曼數(shù)據(jù)譜峰，分析其波形變化和位移；最后將采集到的精子形態(tài)的拉曼光譜，應(yīng)用RRUFF拉曼數(shù)據(jù)庫檢索，得到精子形態(tài)各區(qū)域的拉曼光譜。本發(fā)明優(yōu)點在于：本發(fā)明采用的激光拉曼光譜為一種非侵入性技術(shù)，它不需要任何染料和固定也能反映出每條精子不同個體超微結(jié)構(gòu)、不同成分的散射物質(zhì)的特性，對精子形態(tài)學(xué)分析提供了一個新的評估方法。
【專利說明】一種非侵入性精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種精子形態(tài)與結(jié)構(gòu)分析方法，具體地說，是一種非侵入性精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前全世界約有20%育齡夫婦患有不孕癥，不孕癥中男性原因占50%左右，而在男性不育癥中約60%以上原因為少、弱精子癥，究其原因尚不完全清楚。目前許多醫(yī)院的臨床醫(yī)師，還是依賴實驗室的常規(guī)精液分析指標，選擇臨床治療方案。盡管常規(guī)精液分析的應(yīng)用具有悠久的歷史，但許多醫(yī)療單位至今仍然在使用人工顯微鏡分析技術(shù)；灰度計算機分析精液技術(shù)(CASA, Computer-aided sperm analysis)分析方法在臨床上雖已經(jīng)廣泛應(yīng)用多年；而相差顯微鏡的CASA分析方法因為儀器價格較貴，在醫(yī)院推廣仍很有限。因此精液分析是評價成年男子生育能力和不育癥治療效果的重要手段之一，是常規(guī)檢測項目，也是存在問題最多的不育評估項目之一。
[0003]最新出版的WH05 (2011年2月)提出的嚴格精子形態(tài)學(xué)分析方法標準，使男性精子的形態(tài)正常比例標準降到了 4%。對于人類，用顯微鏡檢查分析精子復(fù)雜的形態(tài)學(xué)過程并不是非常有效，會產(chǎn)生各種異常的和功能不完善的精子。重要的是，研究者要分析引起這些缺陷的原因及其對生育可能造成的后果。隨著“蛋白組學(xué)”技術(shù)和方法的快速發(fā)展，我們從男性的基礎(chǔ)代謝和精子蛋白質(zhì)組學(xué)、受精的機理以及運動功能等研究中獲得了認識，學(xué)者們提出了公認的原因:精子的不育原因許多來源于精子的功能異常，其中對精子核DNA的損害是目前研究最多，而且是被越來越多地學(xué)者承認與胚胎發(fā)育質(zhì)量和胚胎植入至關(guān)重要的影響因素之一。
[0004]近年來的研究表明精子DNA的完整性與精子活力、精子形態(tài)及精子功能有顯著相關(guān)性，并且可以影響受精卵的分裂以及胚胎的發(fā)育。但目前的精子DNA分析方法尚不穩(wěn)定，因為它不能識別精子固有的分子異常，雖然有各種測試評估DNA完整性的方法，但這些辦法都是使用了各種熒光染料，對精子本身有侵入性傷害，例如彗星法、精子染色質(zhì)擴散法(SCD)及丫啶橙流式細胞儀分析法等都是使用熒光染料。這些使用熒光染料檢查后的精子無法再給臨床應(yīng)用提供可替代選擇使用的精子。
[0005]隨著計算機及其在圖像數(shù)字處理技術(shù)方面的進展，一門嶄新的、非侵入性、快速而靈敏的光譜學(xué)檢測方法，激光拉曼*(Raman)光譜技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日漸廣泛，被逐步應(yīng)用于各種細胞分類和鑒別研究工作中。在這里不僅可以觀察細胞形貌，而且還能檢測出表征細胞形態(tài)的峰譜，它包含了單純形貌觀察得不到的更豐富的信息，通過這些信息反映出細胞的物質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)的變化，這在生物遺傳及臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科的研究進程中有潛在的應(yīng)用前景。目前使用激光拉曼光譜系統(tǒng)對單個精子形態(tài)分析方法的建立研究尚未見報道

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種非侵入性精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種非侵入性精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法，所述的精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法包括以下步驟:運用色散型共聚焦拉曼光譜儀進行分析，選擇激發(fā)拉曼光譜，將精子細胞置反射光鏡下中，通過一定的激發(fā)功率和曝光時間可采集到精子細胞的化學(xué)基團光譜。分別對精子頂體、頸部、尾部大小劃分掃描區(qū)域重復(fù)掃描三次，即可獲得拉曼數(shù)據(jù)譜峰，分析其波形變化和位移；最后將采集到的精子形態(tài)的拉曼光譜，應(yīng)用RRUFF拉曼數(shù)據(jù)庫檢索，得到精子形態(tài)各區(qū)域的拉曼光譜。
[0008]所述的精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法包括以下步驟:
(1)選擇激光激發(fā)波為532nm，激光功率5mW，激發(fā)拉曼光譜，曝光時間為IOs；
(2)激光拉曼顯微鏡掃描參數(shù):入射光調(diào)節(jié)為反射光，拉曼分析平移，即每個點掃描移動時，控制精度為I um ;
(3)根據(jù)精子形態(tài)分析標準，依據(jù)精子頂體、頸部、尾部大小，即頂體寬度3.1-3.5um，頂體長度為4.5-4.9um，頸部長度為4.0-5.0um劃分掃描區(qū)域:分別對精子頂體前區(qū)(質(zhì)膜)定點掃描3個點、頂體中間(DNA核區(qū))定點掃描4點、頂體后區(qū)(赤道板部)定點掃描3點、頸部(線粒體區(qū))部定點掃描7點、尾部(微管區(qū)域)定點掃描8點，五個劃分區(qū)域共定點掃描23點進行掃描，并重復(fù)掃描三次，將獲得精子拉曼數(shù)據(jù)譜峰，分析其峰譜變化和位移。
[0009]本發(fā)明優(yōu)點在于:
1、本發(fā)明采用的激光拉曼光譜為一種非侵入性技術(shù)，它不需要任何染料和固定也能反映出每條精子不同個體超微結(jié)構(gòu)、不同成分的散射物質(zhì)的特性，與激光的頻率和激光的強度無關(guān)；
2、本發(fā)明通過對四種不同形態(tài)的精子進行拉曼光譜的比較研究，發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)的精子均有各自的拉曼特征譜峰，對不同形態(tài)的精子特征拉曼譜峰的研究十分有意義，采用激光拉曼光譜儀可對精子形態(tài)學(xué)分析提供了一個新的評估方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]附圖1是精子頂體、頸部、尾部大小。
[0011]附圖2是根據(jù)精子頂體、頸部、尾部大小劃分掃描區(qū)域。
[0012]附圖3是四例檢測樣本的精子形態(tài)學(xué)染色圖譜。
[0013]附圖4是正?？捎呔拥睦庾V:a、頂體區(qū)域的拉曼光譜；b、精子頸部區(qū)域的拉曼光譜；c、精子尾部區(qū)域的拉曼光譜。
[0014]附圖5是原發(fā)不育男性(確診為IVF完全不受精)精子拉曼光譜，a、頂體區(qū)域的拉曼光譜山、精子頸部區(qū)域的拉曼光譜；c、為精子尾部區(qū)域的拉曼光譜。
[0015]附圖6是圓頭精子拉曼光譜，a、圓頭精子頂體區(qū)域多點重復(fù)的拉曼光譜；b、可育者精子頂體區(qū)域多點重復(fù)的拉曼光譜。
[0016]附圖7是斷頭精子拉曼光譜，(I)頂體區(qū)域的拉曼光譜，(II)精子頸部區(qū)域的拉曼光譜，(II1-1V)為精子尾部區(qū)域的拉曼光譜。(波長532nm)。
[0017]附圖8-12是正常精子與死精子的激光拉曼掃描峰譜，紅色(下)為正常精子的激光拉曼掃描峰譜，藍色(上)為死精子的激光拉曼掃描峰譜。其中圖8是頂體前區(qū)，圖9是核區(qū)，圖10是頂體后區(qū)，圖11是頸部，圖12是尾部。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
實施例
[0019]一、研究材料和方法
1、實驗設(shè)備
1.1激光拉曼光譜系統(tǒng)
色散型共聚焦拉曼光譜儀(Senterra R200-L),德國Bruker公司生產(chǎn)，具有光譜分辨率≤1.5CHT1，橫向分辨率〈lum，縱向分辨率〈2 um，配有波長分別為785nm、633nm和532nm的三種激光器，三維自動化控制平臺等重要性能。
[0020]1.2西班牙CASA分析儀
1.3 Eppendorf 5424小型高速離心機
1.4檢測樣本
選取在醫(yī)院特需門診就診的男性精液樣本。
[0021](A)已育男性(已生育一男孩，現(xiàn)年18歲)一例；
(B)原發(fā)不育患者(原發(fā)不育12年，曾在生殖中心接受IVF治療，確診為IVF完全不受精)一例;
(C)圓頭精子癥患者一例(患者為原發(fā)不育5年)，精液形態(tài)學(xué)分析均為100%圓頭精
子;
(D)嚴重(98%)畸形精子癥(精子形態(tài)學(xué)分析，可見大部分精子為頸部開始頭尾分離，即使頭尾連接也是歪頸)，患者一例。
[0022]以這四例典型病例為研究對象。本組研究以生育者的正常形態(tài)精子為對照。四位受檢者均被告知實驗?zāi)康牟⒑炇鹬橥鈺?br> [0023]表1四例樣本精液分析基本情況表
【權(quán)利要求】
1.一種非侵入性精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法，其特征在于，所述的精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法包括以下步驟:運用色散型共聚焦拉曼光譜儀進行分析，選擇激發(fā)拉曼光譜，將精子細胞置反射光鏡下中，通過一定的激發(fā)功率和曝光時間可采集到精子細胞的化學(xué)基團光譜；分別對精子頂體、頸部、尾部大小劃分掃描區(qū)域重復(fù)掃描三次，即可獲得拉曼數(shù)據(jù)譜峰，分析其波形變化和位移；最后將采集到的精子形態(tài)的拉曼光譜，應(yīng)用RRUFF拉曼數(shù)據(jù)庫檢索，得到精子形態(tài)各區(qū)域的拉曼光譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的精子形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)分析方法包括以下步驟: (1)選擇激光激發(fā)波長為532nm，激光功率5mW，激發(fā)拉曼光譜，曝光時間為IOs； (2)激光拉曼顯微鏡掃描參數(shù):入射光調(diào)節(jié)為反射光，拉曼分析平移，即每個點掃描移動時，控制精度為Ιμπι; (3)根據(jù)精子形態(tài)分析標準，依據(jù)精子頂體、頸部、尾部大小，即頂體寬度3.1-3.5um,頂體長度為4.5-4.9um，頸部長度為4.0-5.0um劃分掃描區(qū)域:分別對精子頂體前區(qū)，即質(zhì)膜定點掃描3個點；頂體中間，即DNA核區(qū)定點掃描4點；頂體后區(qū)，即赤道板部定點掃描3點；頸部，即線粒體區(qū)部定點掃描7點；尾部，即微管區(qū)域定點掃描8點，五個劃分區(qū)域共定點掃描23點進行掃描，并重復(fù)掃描三次，將獲得精子拉曼數(shù)據(jù)譜峰，分析其峰譜變化和位移。
【文檔編號】G01N21/65GK103698311SQ201210368263
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月28日
【發(fā)明者】李錚, 劉鋒, 朱勇, 何琳, 劉宇飛 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院