專利名稱：一種檢測食物中藥物殘留的試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種膠體金檢測技術(shù)，尤其涉及一種間接標記的用于檢測食物中藥物殘留的試劑盒及其使用方法，屬于食品安全快速檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，對于食物中藥物殘留的檢測，例如，水產(chǎn)品中的呋喃唑酮的檢測的方法，常見的有化學(xué)比色法、液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、膠體金法等。其中，前面三種方法存在一些缺陷，不能滿足現(xiàn)場快速檢測的要求，主要表現(xiàn)在化學(xué)比色法的干擾比較多導(dǎo)致特異性變差，檢測的靈敏度也不高，達不到市場的要求；液相色譜法的特異性好，靈敏度也比較高，但是需要特殊的儀器設(shè)備，專業(yè)的操作人員，檢測費用很高，檢測所需時間也比較長，一般需 要隔天才能出檢測結(jié)果，單個樣本的檢測費用基本都在2000左右，不適合廣泛的推廣；酶聯(lián)免疫法需要使用酶標儀，需要專業(yè)的操作人員，操作時間比膠體金法要長2小時左右，不適合現(xiàn)場操作，費用也比膠體金法稍高，若檢測樣本較少，費用也將成倍高于膠體金法。膠體金法利用抗原與抗體的高度專一性特異反應(yīng)來進行檢測，具有高靈敏度和高特異性，操作過程簡單，不需要使用特殊的儀器設(shè)備，所需時間較短，5 8分鐘即可判讀，事前需要進行樣本處理的也能在2個小時內(nèi)出結(jié)果，而且結(jié)果可用肉眼判讀，適合現(xiàn)場檢測，可以較好的實現(xiàn)我國食品安全領(lǐng)域快速、準確的檢測要求。因為檢測樣本的原因，如水產(chǎn)品容易死亡，特別是在流通的環(huán)節(jié)，必須使用快速方法進行檢測，以上數(shù)種方法中也只有免疫膠體金法能夠滿足要求。然而現(xiàn)有技術(shù)中，人們在使用膠體金法檢測時，都是在單克隆抗體上用膠體金直接標記，不僅抗體用量大，且會導(dǎo)致被標記抗體的活性出現(xiàn)明顯的下降，從而導(dǎo)致產(chǎn)品靈敏度降低。例如，申請?zhí)枮?00810224933. 3的中國發(fā)明專利，公開了一種檢測禽流感的試紙條及其制備方法，該試紙條包括以下部分墊板、硝酸纖維素膜、兩個結(jié)合墊和兩片吸水濾紙，所述的硝酸纖維素膜含有金標記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG，所述的結(jié)合墊是含有脫脂酪蛋白、金標記的AIV單克隆抗體、AIV血清和羊抗鼠IgG的玻璃纖維膜。在使用該種方法時，就容易出現(xiàn)膠體金用量大，抗體活性降低的技術(shù)問題，從而導(dǎo)致靈敏度降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種間接標記的檢測食物中藥物殘留的試劑盒。它具有檢測靈敏度高的優(yōu)點。本發(fā)明的上述目的可以通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的。一種檢測食物中藥物殘留的試劑盒，包括檢測板和金標微孔，檢測板包括載體膜和膠體金結(jié)合墊，膠體金結(jié)合墊附著于載體膜上的一端，所述金標微孔上包被有單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物；所述載體膜上設(shè)有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測區(qū)上固定有特異性結(jié)合抗原，質(zhì)控區(qū)上固定有二抗；
所述單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物具體為，膠體金標記在抗抗體上而所述抗抗體與單克隆抗體特異性結(jié)合，的一種結(jié)合物。本發(fā)明的上述目的還通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的。一種檢測食物中藥物殘留的試劑盒，包括檢測板，檢測板包括載體膜和膠體金結(jié)合墊，膠體金結(jié)合墊附著于載體膜上的一端，所述膠體金結(jié)合墊上包被有單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物；所述載體膜上設(shè)有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測區(qū)上固定有特異性結(jié)合抗原，質(zhì)控區(qū)上固定有二抗；
所述單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物具體為，膠體金標記在抗抗體上而所述抗抗體與單克隆抗體特異性結(jié)合，的一種結(jié)合物。
本發(fā)明采用的方法是膠體金免疫層析法，膠體金是一種負電荷的疏水膠，靠靜電粒子相互排斥作用來維持穩(wěn)定的膠體體系，直徑從幾納米到幾十納米不等。由于不同直徑的膠體金的光散射各異，所以其溶膠顏色的深淺相應(yīng)發(fā)生顯著的變化，這就是膠體金用于被動凝集試驗的基礎(chǔ)。同時由于膠體金金顆粒對蛋白質(zhì)有很強的吸附功能，可與SPA，Igg，毒素、糖蛋白、酶、抗生素和激素等多種物質(zhì)非共價結(jié)合，從而使其成為免疫反應(yīng)的優(yōu)良標記物。本發(fā)明所述單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物，為膠體金標記在抗抗體上而所述抗抗體與單克隆抗體特異性結(jié)合，的一種結(jié)合物。而這種結(jié)構(gòu)的結(jié)合物是采用間接標記的方法制備的。方法為不對目標抗體進行直接的標記，而采用標記抗抗體，然后把目標抗體加入標記抗抗體的膠體金溶液中。如要標記鼠抗AOZ-BSA抗體，不對該抗體直接進行標記，而采用標記羊抗鼠抗體，標記好以后，將鼠抗AOZ-BSA抗體加入標記好的羊抗鼠膠體金溶液，利用標記好的羊抗鼠溶液會和鼠源性抗體結(jié)合的特點，以達到對鼠抗AOZ-BSA抗體進行膠體金標記的目的。這樣做的優(yōu)點在于，標記過程中，抗體的效價會降低，因未對單抗進行標記，效價降低的只是羊抗鼠抗體，如果效價降低出現(xiàn)在單克隆抗體上，那么會降低靈敏度；而且因為效價降低，單抗的使用量必須增加，以保證檢測時足夠的顯色指示，這也會導(dǎo)致產(chǎn)品靈敏度的降低。本發(fā)明采用間接標記法，標記在二抗上，如羊抗鼠IgG，此時效價降低的是羊抗鼠IgG，而單克隆抗體才是檢測的關(guān)鍵，因此羊抗鼠效價的降低，并不會對結(jié)果產(chǎn)生影響，從而有效地提高了檢測的靈敏度，同時還節(jié)省了單克隆抗體的用量。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述檢測板還包括樣品墊、吸水墊、載體板和背襯，所述載體膜附著在背襯上，背襯附著在載體板上；樣品墊設(shè)在膠體金結(jié)合墊上，所述載體膜上相對于所述膠體金結(jié)合墊的另一端設(shè)有吸水墊。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述載體板采用塑料板，所述載體膜采用硝酸纖維素薄膜。本發(fā)明從一個創(chuàng)新角度出發(fā)，提供了兩種技術(shù)方案的試劑盒。一種是具有金標微孔的，一種是沒有金標微孔的。具有金標微孔的試劑盒，檢測時，待檢溶液先加入金標微孔中，反應(yīng)后轉(zhuǎn)移到檢測板的樣品墊上，樣品溶液因載體膜的毛細管作用向另一端擴散。在移動的過程中，會發(fā)生相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)，并通過免疫膠體金的顏色顯示出來。如果樣品溶液含有相應(yīng)藥物殘留，藥物將和膠體金顆粒上的抗體先行反應(yīng)，因此當膠體金顆粒隨樣品溶液擴散至檢測區(qū)時，膠體金顆粒上抗體的活性位點因被樣品溶液中的藥物占據(jù)而無法與檢測區(qū)上特異性抗原結(jié)合；所以當樣品中的藥物含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測區(qū)將較質(zhì)控區(qū)顯色淡甚至無顯色，判定為陽性。反之，當樣品中藥物含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測區(qū)顯色與質(zhì)控區(qū)相近或偏深，判定為陰性。無金標微孔的試劑盒，其單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物是包被在膠體金結(jié)合墊上的，使用時直接將待檢溶液滴在樣品墊上。然檢測的判定方法以及檢測的原理都是一致的。本發(fā)明的目的之二是提供一種檢測食物中藥物殘留的試劑盒的使用方法。一種檢測食物中藥物殘留的試劑盒的使用方法，它采用了具有金標微孔的試劑盒的技術(shù)方案中對待測樣品進行檢測，檢測時將樣品溶液滴加在金標微孔中，等待數(shù)分鐘后，轉(zhuǎn)移到檢測板上，等待數(shù)分鐘后，肉眼觀察，若檢測區(qū)較之質(zhì)控區(qū)顯色淡或無顯色，判定為陽性，反之，判定為陰性。一種檢測食物中藥物殘留的試劑盒的使用方法，它采用了無金標微孔的試劑盒的技術(shù)方案對待測樣品進行檢測，檢測時將樣品溶液滴加在檢測板上，等待數(shù)分鐘后，肉眼觀 察，若檢測區(qū)較之質(zhì)控區(qū)顯色淡或無顯色，判定為陽性，反之，判定為陰性。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述樣本處理是將樣本組織中的藥物萃取出來，然后進行稀釋或濃縮的一種技術(shù)手段。有些樣本可以通過簡單的常規(guī)處理就能直接用于檢測，而有些樣本則不行，因此需要通過樣本處理，把樣本中的待檢物質(zhì)提取出來，從而達到檢測目的。通過溶液配方的配比組合，使得不同樣本間的差異最小化，同時，保證樣本的前處理工藝具有快速，簡單，便于操作等特點，保證整個檢測過程在短時間內(nèi)完成。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述樣本處理是將樣本組織中的藥物萃取出來，進行稀釋或濃縮，進行衍生加臂，使之充分暴露免疫位點的一種技術(shù)手段。作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述樣本處理包括以下步驟
Φ取的去脂肪組織樣本，用均質(zhì)機均質(zhì)處理；
@取均質(zhì)處理的樣本于離心管中；
@加入萃取劑于裝有肉樣的離心管中；
Φ劇烈振蕩后，室溫下離心機離心；
用配備的滴管移取上清液于另一離心管中，吹干；
分別用專用滴管向吹干的離心管中加入正己烷和緩沖液，室溫下離心，取下層溶液，待檢。作為上述技術(shù)方案的另一種優(yōu)選，所述樣本處理包括以下步驟Φ取去脂肪組織樣本，用均質(zhì)機均質(zhì)處理；
^取均質(zhì)處理的樣本于離心管中，并加入去離子水、鹽酸、樣本衍生化試劑，充分混
合；
@55 65°C水浴條件下孵育O. 8 I. 2h，超聲處理8 12min ；
Φ取出后加入磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、乙酸乙酯，充分混合，離心或靜置使之分層；
@移取上層溶液于離心管中，吹干；
@向吹干的離心管中加入正己烷，振蕩，然后加入緩沖溶液，充分混勻，離心或靜置 使之分層；
@吸取下層溶液，待檢。 由于有些需要檢測的藥物的分子量比較小，不能直接檢測，因此需要對小分子的藥物進行處理。對這樣的樣本進行的處理，是將小分子藥物進行衍生加臂，使之充分暴露免疫位點。樣本衍生化試劑的使用就是其中的一種常規(guī)技術(shù)。所述樣本衍生化試劑是指，一種用于對樣本進行處理，使得它帶有羧基或者硝基，以充分暴露抗原位點，便于抗體的識別的試劑。樣本衍生化試劑的選取由具體的樣本決定，樣本衍生化試劑及其如何選取屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知技術(shù)，在此不作贅述。本發(fā)明具有以下技術(shù)效果
本發(fā)明提供的兩種試劑盒，都是采用間接方法對蛋白進行膠體金標記。采用間接方法標記不僅避免了特異性抗體的標記損傷，節(jié)省特異性抗體的用量，還能提高產(chǎn)品的特異性和靈敏度。


圖I是本發(fā)明實施例一試劑盒的結(jié)構(gòu)示意 圖2是本發(fā)明載體膜的結(jié)構(gòu)示意圖，箭頭表示樣本溶液在載體膜上的擴散方向；
圖3是本發(fā)明實施例二試劑盒的結(jié)構(gòu)示意 圖中，I-樣品墊，2-膠體金結(jié)合墊，3-載體膜，4-吸水墊，5-背襯，6-載體板，7-金標微孔，3_1是檢測區(qū)，3_2是質(zhì)控區(qū)。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明進行進一步的說明。本具體實施方式
僅僅是對本發(fā)明的解釋，并不是對本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本發(fā)明之后所作出的任何改進，只要在本發(fā)明的權(quán)利要求書保護范圍內(nèi)，都將受到專利法的保護。實施例一
檢測水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物的試劑盒
如圖I和2所示，一種檢測水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物的試劑盒，包括樣品墊I、膠體金結(jié)合墊2、載體膜3、吸水墊4、背襯5，載體板6和金標微孔7，所述載體膜3具體為硝酸纖維素膜，所述載體板6為PVC試劑板。硝酸纖維素膜粘附在背襯5上，背襯5粘附在PVC試劑板上，硝酸纖維素膜一端設(shè)有膠體金結(jié)合墊2，膠體金結(jié)合墊2上設(shè)有樣品墊，硝酸纖維素膜另一端設(shè)有吸水墊4。金標微孔7上包被有單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物，所述硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測區(qū)3-1和質(zhì)控區(qū)3-2，檢測區(qū)3-1上固定有特異性結(jié)合抗原，質(zhì)控區(qū)3-2上固定有羊抗鼠抗體，羊抗鼠抗體是個二抗。所述單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物采用間接標記的方法制備，具體為，采用膠體金去標記羊抗鼠抗體，將單克隆抗體鼠抗AOZ-BSA抗體加入標記好的羊抗鼠抗體溶液中， 利用標記好的羊抗鼠溶液會和鼠源性抗體結(jié)合的特點，以達到對鼠抗AOZ-BSA抗體間接標記膠體金的目的。檢測水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物的試劑盒的使用方法
由于呋喃唑酮代謝物是一種小分子物質(zhì)，因此需要對樣本進行處理后才能進行檢測。樣本處理如下
Φ取一定量的去脂肪組織樣本，用均質(zhì)機均質(zhì)處理；
@稱取3g均質(zhì)處理的樣本于50 ml離心管中，并加入6ml去離子水，O. 75mlIM鹽酸，0.2ml樣本衍生化試劑，充分混合3min;
Φ 65°C水浴條件下孵育50分鐘，超聲10分鐘；
φ取出后加入7.5ml O. IM磷酸氫二鉀，0.6ml IM氫氧化鈉，加入乙酸乙酯8ml，充分混合 Imin , 4000 r/min,離心 5min ；
■D移取上層溶液3ml于5ml離心管中，60°C下空氣吹干；
Φ向吹干的試管中加入Iml正己烷，加蓋振蕩lmin，然后加入0.3ml緩沖液，充分混勻，4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心Imin (或靜置至明顯分層)；
Φ吸取0.1毫升下層溶液，待檢；
檢測如下
當待檢樣品溶液在金標微孔中反應(yīng)3 5分鐘后，轉(zhuǎn)移到試劑盒的樣品墊I上，3 8分鐘后，樣品溶液因硝酸纖維素膜載體的毛細管作用向另一端擴散，在移動的過程中，會發(fā)生相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)，并通過免疫膠體金的顏色顯示出來，如果樣品溶液含有相應(yīng)藥物殘留，藥物將和膠體金顆粒上的抗體先行反應(yīng)，因此當膠體金顆粒隨樣品溶液擴散至檢測區(qū)3-1時，膠體金顆粒上抗體的活性位點因被樣品溶液中的藥物占據(jù)而無法與檢測區(qū)3-1上的特異性抗原結(jié)合；所以當樣品中的藥物含量超過試劑盒檢出限時，試劑盒上的檢測區(qū)3-1將較質(zhì)控區(qū)3-2顯色淡甚至無顯色，判定為陽性，反之，當樣品中藥物含量在試劑盒檢出限以下或無殘留時，試劑盒上的檢測區(qū)3-1顯色與質(zhì)控區(qū)相近或偏深，判定為陰性。
權(quán)利要求
1.一種檢測食物中藥物殘留的試劑盒，包括檢測板和金標微孔，檢測板包括載體膜和膠體金結(jié)合墊，膠體金結(jié)合墊附著于載體膜上的一端，其特征在于所述金標微孔上包被有單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物；所述載體膜上設(shè)有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測區(qū)上固定有特異性結(jié)合抗原，質(zhì)控區(qū)上固定有ニ抗； 所述單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物具體為，膠體金標記在抗抗體上而所述抗抗體與單克隆抗體特異性結(jié)合，的一種結(jié)合物。
2.一種檢測食物中藥物殘留的試劑盒，包括檢測板，檢測板包括載體膜和膠體金結(jié)合墊，膠體金結(jié)合墊附著于載體膜上的一端，其特征在干所述膠體金結(jié)合墊上包被有單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物；所述載體膜上設(shè)有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測區(qū)上固定有特異性結(jié)合抗原，質(zhì)控區(qū)上固定有ニ杭； 所述單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物具體為，膠體金標記在抗抗體上而所述抗抗體與單克隆抗體特異性結(jié)合，的一種結(jié)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的ー種檢測食物中藥物殘留的試劑盒，其特征在于所述檢測板還包括樣品墊、吸水墊、載體板和背襯，所述載體膜附著在背襯上，背襯附著在載體板上；樣品墊設(shè)在膠體金結(jié)合墊上，所述載體膜上相對于所述膠體金結(jié)合墊的另一端設(shè)有吸水墊。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的ー種檢測食物中藥物殘留的試劑盒，其特征在于所述載體板采用塑料板，所述載體膜采用硝酸纖維素薄膜。
5.如權(quán)利要求I所述的ー種檢測食物中藥物殘留的試劑盒的使用方法，其特征在于檢測時將樣品溶液滴加在金標微孔中，等待數(shù)分鐘后，轉(zhuǎn)移到檢測板上，等待數(shù)分鐘后，肉眼觀察，若檢測區(qū)較之質(zhì)控區(qū)顯色淡或無顯色，判定為陽性，反之，判定為陰性。
6.如權(quán)利要求2所述的ー種檢測食物中藥物殘留的試劑盒的使用方法，其特征在于檢測時將樣品溶液滴加在檢測板上，等待數(shù)分鐘后，肉眼觀察，若檢測區(qū)較之質(zhì)控區(qū)顯色淡或無顯色，判定為陽性，反之，判定為陰性。
7.如權(quán)利要求5或6所述的ー種檢測食物中藥物殘留的試劑盒的使用方法，其特征在干在檢測前還要進行樣本處理，所述樣本處理是將樣本組織中的藥物萃取出來，然后進行稀釋或濃縮的ー種技術(shù)手段。
8.如權(quán)利要求5或6所述的ー種檢測食物中藥物殘留的試劑盒的使用方法，其特征在于在檢測前還要進行樣本處理，所述樣本處理是將樣本組織中的藥物萃取出來，進行稀釋或濃縮，進行衍生加臂，使之充分暴露免疫位點的一種技術(shù)手段。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的ー種檢測食物中藥物殘留的試劑盒的使用方法，其特征在于所述樣本處理包括以下步驟 X 取去脂肪組織樣本，用均質(zhì)機均質(zhì)處理； I 取均質(zhì)處理的樣本于離心管中； S 加入萃取劑于裝有肉樣的離心管中； X 劇烈振蕩后，室溫下離心機離心； I 用配備的滴管移取上清液于另ー離心管中，吹干；S 分別用專用滴管向吹干的離心管中加入正己烷和緩沖液，室溫下離心，取下層溶液，待檢。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的ー種檢測食物中藥物殘留的試劑盒的使用方法，其特征在于在檢測前還要將樣本進行處理，所述樣本前處理包括以下步驟 I取去脂肪組織樣本，用均質(zhì)機均質(zhì)處理； I取均質(zhì)處理的樣本于離心管中，并加入去離子水、鹽酸、樣本衍生化試劑，充分混合；; 55 65°C水浴條件下孵育O. 8 I. 2h，超聲處理8 12min ； .I取出后加入磷酸氫ニ鉀、氫氧化鈉、こ酸こ酷，充分混合，離心或靜置使之分層； I移取上層溶液于離心管中，吹干； .5向吹干的離心管中加入正己烷，振蕩，然后加入緩沖溶液，充分混勻，離心或靜置使之分層； Z吸取下層溶液，待檢。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種膠體金檢測技術(shù)，尤其涉及一種間接標記的用于檢測食物中藥物殘留的試劑盒及其使用方法，屬于食品安全快速檢測技術(shù)領(lǐng)域。一種檢測食物中藥物殘留的試劑盒,包括檢測板和金標微孔，檢測板包括載體膜和膠體金結(jié)合墊，膠體金結(jié)合墊附著于載體膜上的一端，所述金標微孔上包被有單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物；所述載體膜上設(shè)有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測區(qū)上固定有特異性結(jié)合抗原，質(zhì)控區(qū)上固定有二抗。本發(fā)明采用間接方法標記不僅避免了特異性抗體的標記損傷，節(jié)省特異性抗體的用量，還能提高產(chǎn)品的特異性和靈敏度。
文檔編號G01N33/531GK102854319SQ201210368270
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者周崇盈, 查美蘭 申請人:湖州艾維德生物技術(shù)有限公司