專利名稱:檢測(cè)殘留苯乙醇胺a的酶聯(lián)免疫試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)動(dòng)物組織及其代謝物中苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法,屬于酶聯(lián)免疫吸附分析方法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA )技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及用于檢測(cè)動(dòng)物源食品、血液及尿液中殘留的苯乙醇胺A的含量的酶聯(lián)免疫試劑盒及使用該試劑盒的檢測(cè)方法。
背景技術(shù):
苯乙醇胺A(Phenylethylamine, PEA)又稱為克倫巴胺,學(xué)名為2_[4_ (4_硝基苯基)丁基-2-基氨基]-I-甲氧基苯乙醇,是一種人工合成的化學(xué)物質(zhì)?;瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式如下
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)殘留苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫試劑盒,其特征在于包括酶標(biāo)板96孔、苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)品工作液、苯乙醇胺A抗體工作液、苯乙醇胺A酶標(biāo)二抗工作液、底物液、終止液、濃縮洗滌液和濃縮樣品稀釋液; 其中,所述酶標(biāo)板是包被苯乙醇胺A抗原的酶標(biāo)板,苯乙醇胺A抗原是用0.05 mo I/LpH 9. 6的碳酸鹽包被緩沖液稀釋成1:8000比例,100微 L/孔,37°C,2h,取出4°C放置過夜;取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體,用稀釋后的濃縮洗滌液300微 L/孔,洗板3次,Imin/次;然后加入O. 5% BSA封閉,150微 L/孔,37°C放置2h;取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體,用潔凈的毛巾包裹后拍干板內(nèi)殘留液體;將拍干后的酶標(biāo)板整齊地?cái)[放置GMP車間恒溫25°C晾干;抽檢要求板內(nèi)孔與孔之間,板間的OD值變異系數(shù)均小于10% ;檢驗(yàn)合格后將酶標(biāo)板密封后置4°C下保存; 其中,所述苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為O ng/mL、0. I ng/mL、0. 3 ng/mL、0. 9 ng/mL、2. 7 ng/mL、8. I ng/mL ; 其中,所述苯乙醇胺A抗體工作液是用抗體稀釋液稀釋成1:10000比例; 所述苯乙醇胺A酶標(biāo)二抗工作液是用酶標(biāo)二抗稀釋液稀釋成1:2000比例; 所述底物液包含O. 05 mo I/L的NaHPO4 · 12Η20、0· 025 mo I/L的一水檸檬酸(C6H8O7 ·Η20)、0· 2 mmol/L的3, 3, 5, 5-四甲基聯(lián)苯胺_、0· 5 mmol/L的過氧化氫脲和5%的N, N-二甲基甲酰胺; 所述終止液是2 mol/L的硫酸(H2SO4); 所述濃縮洗滌液是20倍濃縮洗滌液,其包含0. 05%吐溫-20,0. 01 mol/L的PBST,pH值范圍7. 0-7. 5之間; 所述濃縮樣品稀釋液是2倍濃縮稀釋液,其成分為0. 01 mol/L, pH7. 4磷酸鹽PBS緩沖液。
2.權(quán)利要求I所述檢測(cè)殘留苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法,其特征在于該方法包括以下步驟 (1)預(yù)處理待測(cè)樣品,即將待測(cè)試的樣品處理為液體樣品,或者用有機(jī)溶劑提取待測(cè)樣品,氮?dú)獯蹈刹⑵鋸?fù)溶于樣品稀釋液工作液中; (2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出,置于室溫20 25°C平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻; (3)取包被苯乙醇胺A抗原的酶標(biāo)板,加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50mL/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中; (4)加入苯乙醇胺A抗體工作液,50mL/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min ; (5)小心揭開蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌工作液250mL/孔,充分洗滌4飛次,每次間隔10 S,用吸水紙拍干,拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破; (6)加入苯乙醇胺A酶標(biāo)二抗100mL/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min,取出重復(fù)洗板步驟(5); (7)加入底物液100mL/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng).15 20 min ; (8)加入終止液50mL/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長450/630nm檢測(cè),測(cè)定每孔吸光度值,在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù); (9)以標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對(duì)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中苯乙醇胺A的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)殘留苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法,其特征在于其中在步驟(3)中,苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)品和處理好的樣品同時(shí)添加到對(duì)應(yīng)微孔中。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)殘留苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法,其特征在于其中所述處理后的樣品是經(jīng)過以下處理的樣品 尿樣取待檢尿樣,若樣品比較混池時(shí),可5000 r/min以上,離心5 min或過濾。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)殘留苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法,其特征在于其中所述處理后的樣品是經(jīng)過以下處理的樣品 血清取待檢血清樣,若樣品比較混池時(shí),可5000 r/min以上,離心5 min或過濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測(cè)殘留苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法,其特征在于其中所述處理后的樣品是經(jīng)過以下處理的樣品 對(duì)于豬肉、豬肝 準(zhǔn)確稱取2. 0±0. 05 g勻漿樣品至50 mL離心管中; 先加入3%三氯乙酸4 mL,用渦旋儀渦動(dòng)至均勻后再加入2mL乙腈并充分振蕩搖勻;4000 r/min 離心 10 min ; 取上清液3mL至另一離心管中,向其內(nèi)加入I 11101/1似20)3溶液400 mL,并混勻調(diào)節(jié)pH值至 9. 8±0. 2 ; 加入5 mL乙酸乙酯,振蕩30 s, 4000 r/min離心5 10 min ;取3 mL上層液體于50 60°C氮?dú)饬飨麓蹈桑? 加入I mL稀釋后的樣品稀釋液并充分振蕩搖勻; 取50 mL用于分析。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述檢測(cè)殘留苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫試劑盒的使用方法,其特征在于其中的樣品稀釋液用去離子水將苯乙醇胺A濃縮樣品稀釋液按I: I體積比進(jìn)行稀釋,即I份苯乙醇胺A濃縮樣品稀釋液+1份去離子水。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測(cè)殘留苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫試劑盒及其使用方法,屬于酶聯(lián)免疫吸附分析方法技術(shù)領(lǐng)域。所述試劑盒包括包被苯乙醇胺A抗原的酶標(biāo)板、苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)品工作液、苯乙醇胺A抗體工作液、苯乙醇胺A酶標(biāo)二抗工作液、底物液、終止液、濃縮洗滌液和濃縮樣品稀釋液。本發(fā)明的試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法,標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本殘留的苯乙醇胺A和酶標(biāo)板上預(yù)包被的抗原共同競(jìng)爭(zhēng)苯乙醇胺A抗體。該方法可以用于直接檢測(cè)動(dòng)物源性食品、尿樣、動(dòng)物組織和血清樣品中的苯乙醇胺A,具有方便、快速、靈敏等特點(diǎn),適用于大批量樣品檢測(cè),本試劑盒靈敏度0.1ng/mL。
文檔編號(hào)G01N33/544GK102901813SQ201210368968
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者杜道林, 洪霞, 張禎, 薛永來 申請(qǐng)人:江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司