專利名稱：用于非侵入性三維探測的靈活的非線性激光掃描顯微鏡的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于靈活的非侵入性三維探測的非線性激光掃描顯微鏡，尤其是在生命物質中(在活體中)，優(yōu)選在動物的皮膚中、在植物中和在細胞培養(yǎng)中，以及在無生命的物質中，例如礦物質、紡織物和藝術品。下面應該始終將非線性激光掃描顯微鏡或者說具有多光子(MP)激發(fā)的顯微鏡理解為具有雙光子激發(fā)或多光子激發(fā)的顯微鏡。
背景技術：
公知雙光子顯微鏡和多光子斷層照相機(MPT)，在使用它們時，熒光信號和SHG信號(Second Harmonic Generation, 二次諧波生成)在活體的生物分子中由近紅外區(qū)域的脈沖激光輻射激發(fā)并且由合適的高靈敏性的和快速的接收器探測(例如US 5034613A、DE20117294U1 ；DE 20306122U1)。此外，非熒光的和非SHG活性的組成部分如水和脂質能夠借助 CARS顯微鏡和 CARS 斷層照相機(CARS Coherent Ant1-Stokes Raman Scattering,相干反斯托克斯-拉曼散射)示出(參見例如未在先公開的DE 102010047578A1)。利用這些非線性的光學顯微鏡和斷層照相機在三維上達到幾百微米的亞微米范圍和掃描區(qū)域(對象區(qū)域)內的水平分辨率。這樣的非線性顯微鏡和斷層照相機以使用固定的構建和抑制震動的光學的工作臺設施為基礎。它們能夠作為直立的或倒轉的光學顯微鏡設施運行。但是沒有公知如下用于非線性顯微鏡檢查或斷層照相檢查的高分辨率成像系統(tǒng)(具有I微米或小于I微米的橫向分辨率)，所述成像系統(tǒng)在所需要的亞微米范圍內的橫向和軸向分辨率的情況中允許測量頭的自由定位。為此所必需的光束傳輸能夠通過光纖維系統(tǒng)或者作為自由光束傳輸系統(tǒng)來實現(xiàn)。自由光束激光傳輸系統(tǒng)的精確度，如其例如以鏡活節(jié)臂的形式公知的那樣，由在這些臂的機械式籠狀結構內部的機械偏差、機械應力和溫度漂移影響。對鏡活節(jié)臂的機械軸的影響(例如通過溫度漂移)在活節(jié)臂的不同的形態(tài)中導致激光光束在活節(jié)臂的輸出端的位置相對于目標位置的或者說機械軸的偏差，從而借助高分辨率的聚焦光學裝置在不同的測量頭校準的情況下僅限制地使測量對象的可靠掃描成為可能。激光光束在光學活節(jié)臂的輸出端上的位置的波動能夠用概念“傳輸系統(tǒng)的精確度”來概括。此外，激光光束傳輸?shù)木_度受活節(jié)臂的光學的光束路線的給出長度和激光的光束指向穩(wěn)定性(英語pointing stability)影響。在此，應該將激光輻射在激光的直接輸出端上的方向穩(wěn)定性的變化稱為指向穩(wěn)定性，這種變化由激光的諧振器配置的熱造成的影響得出。激光輻射耦入到鏡活節(jié)臂中是特別關鍵的。當激光輻射的光軸與活節(jié)臂的機械軸(進入軸)一致時(共線性)，得到最優(yōu)的耦入。在此出現(xiàn)的偏差附加于上面提到的活節(jié)臂本身由機械和熱造成的偏差地影響精確度。在應用纖維傳輸光學裝置時，在光束引導中待補償?shù)钠铍m然減小到僅在光束耦入和光束耦出時出現(xiàn)，但是在目標地點上所不希望的激光光束偏差的基本問題仍然存在。尤其還存在所不希望的耦入到纖維護套(“包層”)中的危險。由US 5，463，215A公知用于以耦入到光纖維中為目的的光束的校準的設備，在該設備中，激光光束的未耦入到纖維直徑中的部分經由兩個布置為后向反射器的環(huán)形的錐狀的鏡以及在環(huán)上成45°旋轉的鏡耦出到探測器裝置上。然后，通過探測器與環(huán)繞的鏡的位置的同步來識別激光軸和纖維軸的共線性的偏差以及散焦。此外，覆蓋纖維輸入端的照明(也就是說光束直徑大于纖維直徑)是必需的并且因此強度損失從一開始就已經是不能夠避免的。因此，由現(xiàn)有技術得出以下缺點-通常的雙光子顯微鏡和多光子斷層照相機(MPT)基于它們的固定的構建示出受限制的應用范圍并且例如不適合用于在人體上的多用途的研究；-針對靈活的構建的轉變，引導光束的系統(tǒng)的機械的公差過大，以致于不能確保用于掃描區(qū)的允許亞微米分辨率的能重現(xiàn)地照明的測量光斑照射的足夠的穩(wěn)定性；以及-在多光子顯微鏡檢查中，將成像限制在對內生材料的自發(fā)熒光的探測和對確定分子的非線性的倍頻經常是有缺點的，其中，與CARS系統(tǒng)的所希望的結合因為高共線性要求至今只能夠在固定的系統(tǒng)中實現(xiàn)。

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的任務如下，S卩，實現(xiàn)用于針對尤其是皮膚、在泌尿生殖區(qū)域內的組織、在人體的口腔中和在眼睛區(qū)域內的組織、而且還有植物的組織、動物的組織、在細胞培養(yǎng)中的組織和在無生命材料中的組織的多用途的高分辨率的非線性研究的非侵入性三維探測的移動的、能自由使用的非線性激光掃描顯微鏡，該激光掃描顯微鏡在測量頭的無限制靈活性的情況下允許聚焦光學裝置的能重現(xiàn)的照射。作為擴展的任務，應該能夠在共同的靈活的測量頭中以結合不同的測量方法、優(yōu)選MP斷層照相檢查和CARS斷層照相檢查為目的實現(xiàn)兩條光束路線的能重現(xiàn)地一致的同時的應用。根據(jù)本發(fā)明，這個任務在用于非侵入性三維探測的靈活的非線性激光掃描顯微鏡中，該激光掃描顯微鏡包含至少一個輻射源，該輻射源產生用于觸發(fā)由原子和分子射出的二次輻射的激發(fā)光束；用于將輻射傳輸?shù)骄哂芯劢构鈱W裝置的測量頭的靈活的傳輸光學裝置，利用該聚焦光學裝置使輻射聚焦到測量對象中并且射出的二次輻射返回和對準至少一個探測器系統(tǒng)；通過如下方式解決，即，測量頭以能在空間中自由擺動和轉動并且能靈活定位的方式與至少一個輻射源連接，從而能實施直立的、倒轉的以及成任意空間角度的顯微鏡檢查，布置有至少一個用于使至少一個輻射源的脈沖激光輻射的至少一個激發(fā)光束偏轉和校準的能調節(jié)的傾斜鏡，以便通過傳輸光學裝置以如下的方式將至少一個激發(fā)光束對準到測量頭中，即，使得激發(fā)光束在測量頭的每個任意的位置上與測量頭的孔徑受限的光學元件同中心地布置，在測量頭中在聚焦光學裝置之前布置有用于由激發(fā)光束耦出測試光束的光束分束器，在測試光束的與目標位置共軛的位置上布置有用于得出激發(fā)光束在目標位置上限定的光束位置的、分辨地點的(ortsauflosend.)光電探測器，其中，測試光束在光電探測器上的中心校準相應于激發(fā)光束在目標位置上的正常校準，并且存在用于依賴于測試光束與它在光電探測器上的中心校準間得出的偏差來操控能控制的傾斜鏡的控制單元，從而不依賴于傳輸光學裝置由位置造成的妨礙程度而達到激光光束的方向穩(wěn)定。
有利地，能控制的傾斜鏡借助能控制的鏡保持器、以選自如下的組，即電容性的、電感性的或壓電的調節(jié)器、步進電動機或直流電動機中的驅動原理為基礎來驅動。在此，能控制的傾斜鏡可以根據(jù)目的借助雙軸的鏡保持器或借助兩個單軸的鏡保持器來實現(xiàn)。有利地選擇聚焦光學裝置的入射光瞳或其它孔徑受限的光學元件的入射光瞳作為用于至少一個激發(fā)光束的穩(wěn)定校準的目標位置。根據(jù)目的，用于產生測試光束的光束分束器依賴于至少一個激發(fā)光束在測量頭中的光束引導來構造為反射光束分束器或者透射光束分束器。用于耦出測試光束的光束分束器可以有利地同時構造為用于共線地耦入兩個不同的激發(fā)光束的二向色鏡。用于探測作為在目標位置上的激發(fā)光束的等價物的測試光束的對位置靈敏的光電探測器優(yōu)選是圓形的光電二極管。但是備選地，也能夠使用矩形的或其它的探測器形狀以及分辨地點的(分區(qū)的)接收器，如象限光電二極管、正交布置的橫向效應二極管、交叉布置的探測器行((XD或CMOS)，CXD矩陣陣列或CMOS矩陣陣列。除了在傳輸光學裝置中的光束穩(wěn)定的調整之外，利用對位置靈敏的光電探測器能夠有利地確定和修正激光的指向穩(wěn)定性。用于由測量對象射出的二次輻射的探測器系統(tǒng)優(yōu)選構造為具有用于MPT成像或SHG成像的探測器，從而存在用于熒光物體的靈活的診斷系統(tǒng)，該診斷系統(tǒng)經由低機械精確度的靈活的光學活節(jié)臂允許測量頭在空間中任意自由定位并且確保能重現(xiàn)的MPT成像。用于二次輻射的探測器系統(tǒng)可以特別有利地構造為具有多個用于MPT成像、SHG成像和CARS成像的探測器，從而存在用于生命物質中的熒光和非熒光物體的靈活的診斷系統(tǒng)，該診斷系統(tǒng)經由共同的靈活的光學活節(jié)臂允許共同使用的測量頭在空間中任意自由定位并且由MPT信號、SHG信號和CARS信號產生同時和同地的成像。在此，用于熒光物體和非熒光物體的如此結合的診斷系統(tǒng)根據(jù)目的還能夠經由靈活的光學活節(jié)臂和單獨的光纖維允許共同使用的測量頭在空間中任意自由定位。此外，如下是可能的，即，在靈活的合并的診斷系統(tǒng)中經由兩條單獨的光纖維實現(xiàn)用于同時和同地成像的共同的測量頭的任意自由定位。此外，用于二次輻射的探測器系統(tǒng)在緊湊的變體中具有用于MPT成像和用于CARS成像的共同的測量探測器，其中，設置有用于暫時中斷CARS激發(fā)的機構，該機構允許MPT成像相對于合并的信號顯示的分離。用于時間相關的單光子計數(shù)器的探測器系統(tǒng)優(yōu)選具有用于MPT成像的TCSPC探測器。在此，探測器系統(tǒng)根據(jù)目的裝配有額外的觸發(fā)二極管，該觸發(fā)二極管充分利用為了測量信號耦出而設置在測量頭中的光束分束器的背面反射。在靈活的激光掃描顯微鏡的有利的實施方案中，測量頭機械式地通過靈活的、能在任意姿態(tài)上鎖止的支撐臂支撐在移動的基礎儀器上，該支撐臂強制性地一起引導傳輸光學裝置，其中，在基礎儀器中至少存在用于產生脈沖激發(fā)輻射的輻射源、用于同步脈沖激光輻射和校準至少一個到測量頭的傳輸光學裝置的光學單元以及用于測量頭中的激發(fā)輻射的方向穩(wěn)定的控制單元和用于處理由測量頭的探測系統(tǒng)傳輸?shù)挠糜诶蔑@示單元來成像顯示的信號的評估單元。
本發(fā)明以如下考慮為基礎，S卩，一般有兩種可能性來達到在鏡活節(jié)臂中的靈活的光束傳輸?shù)木_度，即通過應用大多為大體積的、笨重的和成本高昂的光學機械式籠狀系統(tǒng)或通過應用激光輻射的高要求的方向穩(wěn)定方案。本發(fā)明利用用于激光輻射(或也能夠是非相干輻射)的技術上簡單的、有成本效率的和小體積的方向穩(wěn)定方案來解決這些不可兼顧的要求，該方向穩(wěn)定方案為了偏差最小化而具有探測器、控制單元和激發(fā)器。依賴于在無限制靈活的測量頭內部的共軛目標平面中探測到的偏差，在激光光束耦入到測量頭的照明和采集系統(tǒng)(聚焦光學裝置)中之前，借助控制單元(簡單的邏輯電路)進行該激光光束的光束方向的校正。當應用多個激發(fā)光束時，通過這種光束穩(wěn)定也同時保證了測量輻射的共線性。由此，在光束引導所需要的精確度方面，減少了對鏡活節(jié)臂的機械式籠狀結構的要求，并且產生的體積節(jié)省和重量節(jié)省帶來了顯微鏡測量系統(tǒng)的(例如斷層照相機的)靈活性和移動性。尤其是在纖維傳輸系統(tǒng)中的纖維耦合的情況下能夠看到方向穩(wěn)定的優(yōu)點，例如緊湊的和小體積的構造形式和成本效率。此外，根據(jù)本發(fā)明的解決方案的特征如下，S卩，待由具有靈活的測量頭的顯微鏡成像系統(tǒng)研究的對象部位能夠通過不同的測量方法同時地研究，例如借助高分辨率的多光子熒光顯微鏡檢查、多光子SHG顯微鏡檢查和/或CARS顯微鏡檢查。在此，一個或多個短脈沖激光的不同的激發(fā)光束能夠經由同一只靈活的光學活節(jié)臂或者經由一只靈活的光學活節(jié)臂和額外的光纖維或者經由兩條光纖維傳輸并且能夠利用用于光束穩(wěn)定的同一裝置來控制和調整。利用本發(fā)明實現(xiàn)用于針對以亞微米分辨率成像的研究的非侵入性三維探測的緊湊的靈活的非線性激光掃描顯微鏡是可能的，該激光掃描顯微鏡在測量頭的無限制的靈活性的情況下允許能重現(xiàn)地照射測量對象。此外，不同測量方法的，優(yōu)選多光子熒光顯微鏡檢查的、多光子SHG顯微鏡檢查的和/或CARS顯微鏡檢查的光束路線能夠在共同的靈活的測量頭中合并并且在此實現(xiàn)同一能重現(xiàn)的照射和精確到點的(精確到細胞的)掃描。


下面借助實施例對本發(fā)明進行詳細闡釋。為此附圖示出圖1 :在應用鏡活節(jié)臂作為引導光束的系統(tǒng)的情況下，用于將激光光束校準到測量頭中的目標點上的本發(fā)明的原理圖；圖2:在應用圓形的光電二極管的情況下，用于在共軛的目標平面中的光束偏差的探測原理圖；圖3 :作為具有針對在人的皮膚上的斷層照相檢查的能在空間中自由定位的測量頭的移動的、能多用途地使用的激光掃描顯微鏡的本發(fā)明的實施的三維圖；圖4 :在具有兩個應用共同使用的鏡活節(jié)臂作為到測量頭的引導光束的系統(tǒng)的探測系統(tǒng)的靈活的激光掃描顯微鏡中的實施本發(fā)明的示意圖，該測量頭為了研究而在垂直的測量對象上(90°姿態(tài))例如在油畫的無生命的物質上校準；圖5 :在具有兩個應用鏡活節(jié)臂和光纖作為到共同的測量頭的引導光束的系統(tǒng)的探測系統(tǒng)的靈活的激光掃描顯微鏡中的實施本發(fā)明的示意圖，該測量頭用于研究動物例如老鼠的有生命的組織而在正常姿態(tài)(0° )上校準；
圖6 :在具有兩個應用兩條光纖維作為到共同的測量頭的引導光束的系統(tǒng)的探測系統(tǒng)的斷層照相機中的實施本發(fā)明的示意圖，該測量頭用于任意物質的研究例如在培養(yǎng)皿中的溶液而作為倒轉的顯微鏡(180°姿態(tài))被校準。
具體實施例方式圖1不出系統(tǒng)的原理上的構建。激光器1，優(yōu)選具有圓形的光束橫截面(或者也可具有偏離的光束橫截面，例如橢圓形的或多模激光光束)的單模激光器(橫向模式)，發(fā)射激光光束11到能調節(jié)的傾斜鏡2上，利用該傾斜鏡激光光束11耦入到傳輸光學裝置3中并且傳導到在測量頭4內部的目標位置41上。借助在測量頭4中布置的光束分束器42，激光光束11中的一小部分(例如< 10%)作為測試光束43耦出到分辨地點的光電探測器5上。相對于目標位置41共軛地布置分辨地點的光電探測器5，從而使得光電探測器5對于激光光束11的(或者說從其中耦出的測試光束43的)光束橫截面13 (僅在圖2中示出)與正常位置或者說中心位置的位置偏差是敏感的。這意味著，測試光束43相對激光光束11具有偏離的光軸(例如呈90°的角度)。控制單元6 (這個控制單元能實現(xiàn)為簡單的邏輯單元)評估光電探測器5的輸出信號并且依賴于測試光束43 (光束橫截面13的中心或者說功率重心，如圖2中所示)與光電探測器5的中心位置的偏差來控制可調節(jié)的傾斜鏡2的角度校準而使光電探測器信號最大化。圖2中，在畫上陰影線的正方形的內部，分辨地點的光電探測器5畫為單個的大面積的圓形的光電二極管51。但是也有大量用于探測激光光束11的光束橫截面13的位置偏差的其它可能性。這能夠由以分辨地點的方式進行測量的探測器，如象限光電二極管，通過兩個正交布置的橫向效應二極管(英文position sensitive device - PSD,對位置敏感的器件)、交叉布置的探測器行(CCD -英文charge coupled device,電荷稱合器件,或CMOS -英文complementary metal oxid semiconductor,互補金屬氧化物半導體)、CCD矩陣或CMOS矩陣來實現(xiàn)，其中，二維傳感器陣列實施為具有圓形地聯(lián)通(面元劃分)的面元件，或者與光導纖維共同作用地整體地采集。此外，可以使用相當少見的具有移動的狹縫的探測系統(tǒng)(英文scanning slit detector,掃描狹縫探測器)。在改變能調節(jié)的傾斜鏡2的角度位置的情況下(根據(jù)圖1 )，激光光束11的(在這里假定為圓形的)光束橫截面13在畫上陰影線的正方形內部偏移。在光束橫截面13的面和光電探測器5(該光電探測器應有利地相應于圓形的光束橫截面13構造為圓形的光電二極管51)的面部分重合的情況下，產生輸出信號，該輸出信號以光電探測器5的由入射的激光光束產生的光電流為基礎。根據(jù)圖1的設施的目標是光束橫截面13在光電探測器5的中心上的永久的定中心。光束橫截面13的位置在這里通過笛卡爾坐標系統(tǒng)內部的坐標X和Y限定，該笛卡爾坐標系統(tǒng)配屬給在測量頭4的目標位置41上的激光光束11的理想位置。同一坐標系統(tǒng)配屬給共軛的位置，在該共軛的位置上布置有光電探測器5，并且示出識別光束偏差的基礎。圖1中的目標位置41的笛卡爾坐標系統(tǒng)的原點與圓形的光電二極管51的中心相關，因為這個圓形的光電二極管布置在相對于目標位置41共軛的平面中。光電探測器5的輸出信號通過圓形的光電二極管51的靈敏度分布與光束橫截面13的強度函數(shù)的依賴于位置的重合或者卷積而產生，如其在圖2中例如在畫上陰影線的正方形內部(假定的坐標系統(tǒng))表現(xiàn)為針對在X坐標中的信號分量52的近似的高斯分布和表現(xiàn)為在Y坐標中的性質上相同類型的信號分量53。由于輸出信號分成X分量和Y分量，光束橫截面13的位置可以借助能調節(jié)的傾斜鏡2的角度偏移可改變地和分步地(例如首先針對X坐標并且然后針對Y坐標地使光電二極管信號最大化)調整。光束橫截面13在笛卡爾坐標系統(tǒng)的X方向上的偏移產生具有全局最大值521的依賴于位置的信號分量52。信號分量52的振幅依賴于(圓形的)光束橫截面13和圓形的光電二極管51的重合，或更確切的說，依賴于激光光束11的強度函數(shù)與光電二極管51的靈敏度函數(shù)的卷積。激光光束11的從屬于最大值521的偏移角度代表在X方向上所尋找的坐標。由此得出并且校準傾斜鏡2的在X軸上所尋找的校正位置。由這個X坐標出發(fā)，在正交的(坐標系統(tǒng)的Y軸的)方向上的偏移導致圓形的光電二極管51的第二信號分量53的最大值531與在Y方向上所尋找的坐標相關。以這種方式得出傾斜鏡2的在Y軸上所尋找的校正位置并且能夠相應地校準傾斜鏡2。由于最初的補償移動，信號分量53的振幅通過光束橫截面13和光電二極管51的面的增加的重合部分相對于信號分量52而增加或者說最大化。對于理想圓形的高斯型光束橫截面13和理想圓形的光電二極管51可以一次性地得出坐標。在此，在移向X方向上的和Y方向上的坐標之后，目標位置41的笛卡爾坐標系統(tǒng)的原點與光束橫截面13的中心或者說重心相關。對于非理想的(偏離于圓形高斯型)光束橫截面13或者說非圓形的光電探測器51，X方向上的和Y方向上的坐標尋找的過程必須多次重復。然后，第一次校準的結果能夠重新在測試光束43中檢測并且必要時再次調整傾斜鏡2。因此，通過定中心過程的多次應用，除了圓形的(單模)光束橫截面之外所謂的多模的或者說非對稱的光束橫截面13也能夠定中心到目標位置41上(迭代的近似)。在此，不是理想的圓形的光束橫截面13的中心而是光束橫截面13的強度重心被校準。利用在坐標X和坐標Y中的圓形光電二極管51的兩個信號分量52和53的信息的幫助，借助控制單元6如此地校準能調整的傾斜鏡2，使得光電二極管51的信號變大并且因此光束橫截面13 (或者說它的強度重心)移動到目標平面41的中心上。為了這個調控原理的最大的準確度，信號分量52和53必須具有無平頂區(qū)的最大值521或者531。這能夠通過將圓形的光電二極管51的直徑調整到光束橫截面13的直徑上來進行，其中，光電二極管51的直徑應該是在l/e2的激光光束I的強度時光束半徑的兩倍。盡可能準確地得出信號分量52或者說53的最大值521或者說531的其它的可能性是接下來的信號處理(例如高斯型匹配或低通濾波)。這也允許利用長相干的激光輻射源來運行系統(tǒng)，在該激光輻射源中由于在光束分束器上的多次反射而具有干擾。信號分量52和53的動態(tài)范圍能夠通過應用對數(shù)放大器(沒有畫出)來提高，這在具有可變輸出功率的激光器中還保證了方向穩(wěn)定的功能。為了產生測試光束43，根據(jù)激光光束11在測量頭4中應該在哪個方向上繼續(xù)被引導而能夠使用激光光束11在光束分束器42上的反射(如圖1中所示)或者透射(如圖4中所示)。在應用纖維傳輸光學裝置的情況下(如圖5中出現(xiàn)的那樣)，激光光束11的耦入和因此系統(tǒng)的透射由于在光學單元72內部的熱漂移和機械應力而受影響。如果應用單模纖維，該單模纖維的芯直徑非常小，那么透射僅在不過幾分鐘內就會衰減百分之幾十。在此，除了在測量頭4中的不充足的激光功率之外，在纖維內部發(fā)生了由熱交換作用造成的纖維傳輸系統(tǒng)的損壞，無論如何必須避免這種熱交換作用。激光光束11的校正的作用原理或者說其到纖維傳輸光學裝置的芯中的定中心與圖1的描述類似地進行，其中，在圖2中所描述的圓形的光電二極管51的功能能夠由構造為纖維的傳輸光學裝置3的圓形的芯直徑和在這之后連接的、對所有傳輸?shù)墓夥e分的光電探測器5來表現(xiàn)。在此，光導纖維32與在之后安置的任意形式的光電探測器5 —起等效地模仿針對利用圓形的光電二極管51進行調整的、根據(jù)圖1和圖2所描述的功能。實施例1如圖3中所示，作為移動的、靈活的非線性掃描顯微鏡的測量系統(tǒng)由用于能自由選擇放置的在輪子上的移動基礎儀器組成。在這臺基礎儀器上經由支撐臂8附著有在空間中能自由移動的測量頭4。額外地，針對用于成像的激光掃描所需要的激光輻射的光學的光束引導，在基礎儀器7與測量頭4之間安裝有兩個不同的光學的傳輸光學裝置3、鏡活節(jié)臂31和光纖維32。這些均針對傳輸用于不同探測方法(例如無一般性限制地用于多光子斷層照相檢查和CARS斷層照相檢查)的激發(fā)輻射而設置，其中，不同的激發(fā)光束在測量頭4中共線地重合。此外，在測量頭4中使用圖1中從原理上示出的具有對位置敏感的光電探測器5、控制單元6和能控制的傾斜鏡2的光束穩(wěn)定系統(tǒng)。由此，圖3中所示出的測量頭4自由地對準到作為測量對象9 (人)的人皮膚91在空間中任意坐落的區(qū)段上是可能的，不會由于測量頭4的多樣化的擺轉可能性而出現(xiàn)激發(fā)條件的某些變化(惡化)。根據(jù)本發(fā)明的掃描顯微鏡的其它不同的技術上的設計方案包括若干多樣化的應用可能性在以下實例中詳細闡釋。實施例2圖4的根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡，如圖3在上面所描述的那樣，由用于能自由選擇地放置的、在輪子上的移動的基礎儀器組成。針對多光子成像，在基礎儀器7中具有短脈沖激光系統(tǒng)71 (5fs - 500ps ;帶有高斯型的光束橫截面，例如鈦藍寶石激光)以及光學單元72，在該光學單元中，作為雙軸傾斜鏡21的能控制的傾斜鏡2使由短脈沖激光系統(tǒng)71出來的激光光束11耦入到以鏡活節(jié)臂31的形式存在的靈活的傳輸光學裝置3中。激光光束11在這個第一示例中經由靈活的鏡活節(jié)臂31傳導到光學測量頭4。能移動的和能在每個姿態(tài)上鎖止的多節(jié)支撐臂8使光學測量頭4的自由定位成為可能，從而相應地強制性地一起引導鏡活節(jié)臂31。因此，測量頭4能夠以其聚焦光學裝置44以任意的方式對準測量對象9來定位，該聚焦光學裝置在此情況下處在與帶有豎直表面的測量對象9呈90°的姿態(tài)上，該測量對象在這個示例中是掛起來的油畫92，該油畫的組成(材料或涂層構建)能夠被研究。在此，基于對激光光束11的軸方向的不斷的控制和追蹤，目標平面41保持一樣地被照射，從而避免由波動的激發(fā)輻射而造成的測量誤差。用于CARS成像所必需的具有與短脈沖激光71偏離的波長的第二輻射源由短脈沖激光器71生成,通過如下方式，即，經由光束分束器725 f禹出激光光束11的大約一半的福射份額并且作為激光光束11’輸入給移頻器73。從中射出的具有偏離的波長的激光光束12同樣耦入到光學單元72中，其中，激光光束12經由第二可雙軸控制的傾斜鏡22(具有如雙軸傾斜鏡21那樣的相同功能)額外地通過具有可變的透鏡間距的望遠鏡式系統(tǒng)722和可變的光學延遲區(qū)段723來引導并且在穿過能調節(jié)的鏡設施724和二向色鏡726之后與短脈沖激光器71的激光光束共線地(兩個光束份額沿著同一軸線在空間上重合)校準。兩個激光光束11和12在二向色鏡726之后共線地耦入到鏡活節(jié)臂31中并且向著測量頭4傳輸。然后，在測量頭4中永久地監(jiān)控這兩個激光光束11和12的軸是否一致，通過如下方式，即，對位置敏感的光電二極管51的中心的照射在由經由光束分束器42從到聚焦光學裝置44的光束路徑中耦出的測試光束43中檢測并且借助控制單元6對所確定的偏差經由光學單元72的能雙軸控制的傾斜鏡21和22針對每個激光光束11和12進行校正。由此，在鏡活節(jié)臂31的每個任意的校準中確保均勻地照射聚焦光學裝置44的入射光瞳(目標平面41)。代替聚焦光學裝置44的入射光瞳，也能夠使用其它的在測量頭4中使用的光學元件的孔徑限制。兩個激光光束11和12的單個激光脈沖的時間上的重合通過對可變的光學延遲區(qū)段723的手動的或機動的調整來實現(xiàn)。具有不同波長的激光光束11和12在聚焦光學裝置44之后由于色散而相互分開的聚焦位置能夠通過望遠鏡系統(tǒng)722在測量對象9 (在本示例中是油畫92)的內部重合。在測量頭4的內部，兩個激光光束11和12的激光輻射的主要份額經由光束分束器42引導到為了二維掃描而設置的掃描單元46中。在掃描單元46之后，激光輻射經由望遠鏡式系統(tǒng)47引導到聚焦光學裝置44的入射光瞳中并且利用聚焦光學裝置44在待研究的油畫92中聚焦。掃描單元46允許激光光束11和12在聚焦光學裝置44的焦點平面內部的二維偏移，從而能夠對油畫進行光柵式的二維掃描或者說激發(fā)。通過經由Z軸定位器48對聚焦光學裝置44進行系統(tǒng)的調整使得測量對象9的斷層照相的三維顯示(作為在油畫92的不同涂層上的堆棧式采集)成為可能。在油畫92中的聚焦光學裝置44的焦點平面上分別由不同的激發(fā)光束(具有不同的波長和脈沖序列的激光光束11和12)生成的信號通過測量頭4的聚焦光學裝置44整體地采集并且借助兩個用于耦出測量信號、例如自發(fā)熒光信號和SHG信號的二向色光束分束器451和452與反射的激發(fā)輻射分開并且轉向到兩個測量探測器，MP探測器54和CARS探測器55上。MP信號和CARS信號的評估在基礎儀器71的評估單元61中進行并且能夠作為多維的灰度值分布在顯示單元62上以圖像的方式顯示。為了以時間相關的單個光子計數(shù)器(英語Time Correlated Single PhotonCounting - TCSPC)為基礎的圖像采集，其具有如下目標，即，通過測量原子振動和分子振動的衰減時間來分列原子和分子以及它們的周圍環(huán)境，測量探測器54和55能夠由高時間分辨率的探測器取代并且它們的信號能夠在評估單元61中處理。為了在TCSPC測量中所必需的觸發(fā)而設置有觸發(fā)二極管56，該觸發(fā)二極管充分利用光束分束器451和452的寄生式的背面反射。在這個示例中使用了光束分束器451的背面反射。選擇性地也能夠針對對位置敏感的光電二極管51充分利用光束分束器451或452的寄生的背面反射，利用該光電二極管的輸出信號，控制單元6經由雙軸傾斜鏡21和22控制激光光束11和12關于在測量頭4中限定的目標平面41的穩(wěn)定的方位。此外，圖4中這個對于光電二極管51備選的位置用虛線畫出并且用光電二極管51’表示，其中，充分利用了光束分束器452的寄生的背面反射。這個可選的光電二極管51’，因為它更靠近目標平面41 (聚焦光學裝置44的入射光瞳)，所以能夠被優(yōu)選并且省去布置在測試光束43中的光電二極管51。光束分束器42能夠在這種情況中由全反射鏡(未畫出)取代。利用對待測量油畫92的激光光束穩(wěn)定的激發(fā)，使方向穩(wěn)定性以10 - 20的因子來改善。這種類型的改善保證了在測量頭4的所有位置上的對圖像區(qū)的均勻的照射并且因此保證了能重現(xiàn)的、能對比的測量結果。實施例3圖5示出在使用鏡活節(jié)臂31和光纖維32作為兩個分開的引導光束的光學傳輸系統(tǒng)3的情況下的測量系統(tǒng)。短脈沖激光71以相同的方式，如在第二示例中那樣，利用光學單元72經由雙軸傾斜鏡21耦入到靈活的鏡活節(jié)臂31中并且傳導到光學的測量頭44。為了產生額外的CARS成像而使用的移頻器73借助由光束分束器725耦出的經由換向鏡721的帶有由短脈沖激光71產生的輸出波長的激光光束11’提供并且發(fā)射出具有偏離于短脈沖激光71的波長的激光光束12。有異于之前的示例，激光光束12在它首先穿過望遠鏡系統(tǒng)722之后，在光學延遲區(qū)段723之前借助第一單軸傾斜鏡23和與其正交布置的第二單軸傾斜鏡24在兩個坐標方向上分開地校準。此外，激光光束12，如圖4所描述的那樣，穿過延遲區(qū)段723和鏡設施724。同樣有異于圖4中的構建，此后激光光束12不經過用于與激光光束11 一起引導的二向色光束分束器726，而是該激光光束單獨地耦入到光導纖維32中并且經由這條光導纖維引導到測量頭4。在測量頭4中，激光光束12經由合適的二向色分束器421與由鏡活節(jié)臂31導入的激光光束11共線地重合并且聚焦到老鼠93的組織(作為具體的測量對象9)中，其中，該分束器421同時承擔用于激光光束11的偏轉功能以及用于將測試光束43耦出到光電二極管51上的分束功能。由老鼠93的組織返回來的信號的識別和處理在這個示例中經由光束分束器451耦出地借助用于所產生的MP信號和CARS信號的共同的探測器57進行，其中，通過阻斷激光光束11或12中的一個或者備選地通過借助延遲組件723來改變這兩個激光光束11和12的彼此的相位(時間上的參考)，能夠將CARS信號與MP信號區(qū)別開，由此探測器57只接收MP信號。此外，通過這兩個激光光束11和12的同相激發(fā)，能夠一同(重合地)探測老鼠3的組織的CARS信號和MP信號。實施例4激光掃描顯微鏡的其它有利的設計方案在圖6中示出，其中，兩條光纖維32和33作為引導光束的光學傳輸系統(tǒng)3使用。具有不同波長的兩個激光光束11和12如第三個示例中那樣在光學單元72中引導、校準并且相互協(xié)調，使得相互不重合。但是與之前的示例有區(qū)別的是激光光束12在第二激光源74中產生并且于在延遲組件723和緊接著的鏡設施724中的較耗費的相位同步之后耦入到光導纖維32中(如根據(jù)圖5的第三示例那樣)。激光光束11在這種情況中耦入到第二纖維、優(yōu)選單模纖維33中。然后，這兩條纖維32和33在測量頭4中，以如第三示例中類似的形式，借助二向色分束器421共線地重合。激光光束11和12的穩(wěn)定的共線的校準以及因此激發(fā)的信號的識別以同樣的方式如第二實施例中描述的那樣進行。作為測量對象9的用液態(tài)的或固態(tài)的物質填充的培養(yǎng)皿94能夠靜止地固定在測量頭4上(在最簡單的情況中例如利用雙面的膠帶)或者與定位工作臺(例如雙軸的或三軸的十字工作臺，未示出)能移動地聯(lián)接。這使得在非常少的技術消耗的情況下的顯微鏡式成像成為可能。代替培養(yǎng)皿94，也能夠以相同的方式研究在微量滴定盤上的物體。因此，圖6中相應示出的倒轉的顯微鏡設施允許任意樣本的研究，例如放入營養(yǎng)液中的樣本、固態(tài)的研磨成粉的或制成顆粒的材料甚或固體(靠近表面的區(qū)域)。所描述的帶有CARS探測器的MPT系統(tǒng)的相對于通常的和不靈活的系統(tǒng)的優(yōu)點在于具有小重量的通過光學活節(jié)臂31和/或光導纖維32、33在空間中能自由定位的測量頭4和移動的基礎儀器7。這種系統(tǒng)允許操作人員能夠在短時間內能重現(xiàn)地執(zhí)行高分辨率的綜合測量(節(jié)省時間和節(jié)省成本)并且在此提供如下顯微鏡式的測量設施以供使用，該測量設施針對任意取向的對象表面能夠完全等效地(兼容地)并且在無需測量對象移動(例如患者重置)或由測量對象9取走樣本的情況下執(zhí)行大量對測量對象9的不同部分的測量。此外，測量頭4的靈活的定位使所謂的倒轉成像成為可能，如它在常用的顯微鏡檢查中廣泛地使用。區(qū)別于常用的僅能夠用作直立的顯微鏡(0° )或能夠用作倒轉的顯微鏡(180° )的顯微鏡系統(tǒng)，帶有能夠不受限制地移動的本發(fā)明還允許在90°姿態(tài)上的布置和任意偏離該姿態(tài)的布置。由此，對直立的對象的測量同樣是可能的，例如對在壁上的霉菌培養(yǎng)的研究、對在種植園內部的植物機體結構的研究、材料分析(參見圖4)、動物研究(參見圖5)和對人的皮膚的研究(圖3)以及不同類型的犯罪偵查的研究，還有如作為用于研究任意的液態(tài)的或固態(tài)的物質的激光掃描顯微鏡的使用(圖6)。此外，利用在測量頭4上相應匹配的附屬件(未畫出)使得應用測量頭4上的定位工作臺(十字工作臺)成為可能，以便提供常用的顯微鏡性能，該顯微鏡性能基于掃描顯微鏡(基礎儀器7)的移動性可以于每個任意地點允許在宏觀樣本區(qū)域上方的高分辨率的研究。多光子熒光顯微鏡檢查、多光子SHG顯微鏡檢查和/或CARS顯微鏡檢查的成像的診斷系統(tǒng)相對于各獨立的診斷系統(tǒng)的聯(lián)接上的優(yōu)點在于如下，即，在一個具有靈活的測量頭4的緊湊的移動的基礎儀器7中將多光子激發(fā)和成像、多光子SHG激發(fā)和成像和CARS激發(fā)和成像的方法結合起來。具有靈活的活節(jié)臂31或者光纖維32、33的所提出的布置方案允許測量頭4的自由的定位，該定位沒有分辨率限制并且沒有由于對激發(fā)輻射的有誤差的調準而產生的信號失真，通過如下方式，即，以簡單的和穩(wěn)定的方式可靠地接收和修正激發(fā)輻射并且以此確保最小誤差的成像和評估。附圖標號列表I激光器11激光光束(激發(fā)光束)12激光光束(第二激發(fā)光束)13光束橫截面2(能控制的)傾斜鏡21、22 雙軸傾斜鏡
23、24單軸傾斜鏡3傳輸光學裝置31鏡活節(jié)光學裝置32光導纖維33單模纖維4測量頭41目標位置42光束分束器421二向色分束器43測試光束44聚焦光學裝置45信號I禹出分束器451二向色光束分束器452二向色光束分束器46掃描單元47望遠鏡系統(tǒng)48Z軸定位器5(對位置敏感的)光電探測器51(圓形的)光電二極管52,53信號分量(在X-方向上、在Y-方向上)521,531 最大值54(MP)探測器55(CARS)探測器56觸發(fā)二極管57共同的探測器6控制單元61評估單元62顯示單元7(移動的)基礎儀器

71短脈沖激光器72光學單元721換向鏡722望遠鏡式系統(tǒng)723延遲組件724鏡設施725光束分束器726二向色鏡73移頻器74第二激光源
8支撐臂9測量對象91人的皮膚92油畫93老鼠的組織 94培養(yǎng)皿(具有液態(tài)的物質)
權利要求
1.用于非侵入性三維探測的靈活的非線性的激光掃描顯微鏡，其包含至少一個輻射源，該輻射源產生用于觸發(fā)由原子和分子射出的二次輻射的激發(fā)光束；用于將輻射傳輸?shù)骄哂芯劢构鈱W裝置的測量頭的靈活的傳輸光學裝置，利用該聚焦光學裝置使輻射聚焦到測量對象中并且射出的二次輻射返回并對準至少一個探測器系統(tǒng)；其特征在于， -所述測量頭(4)以能在空間中自由擺動和轉動并且能靈活定位的方式與所述至少一個輻射源(1、71、74)連接，從而能實施直立的、倒轉的以及成任意空間角度的顯微鏡檢查； -至少一個用于使所述至少一個輻射源的脈沖激光輻射的至少一個激發(fā)光束(11、12)偏轉和校準的能控制的傾斜鏡(2)如下地布置，S卩，以便通過所述傳輸光學裝置(3)以如下的方式將所述至少一個激發(fā)光束(11、12 )對準到所述測量頭(4 )中，S卩，使得所述激發(fā)光束(11、12)在所述測量頭(4)的每個任意的位置上與所述測量頭的孔徑受限的光學元件(44)同中心地布置； -在所述測量頭(4)中在所述聚焦光學裝置(44)之前布置有用于由所述激發(fā)光束(11、12)耦出測試光束(43)的光束分束器(42)； -在所述測試光束(43)的與目標位置(41)共軛的位置上布置有用于得出所述激發(fā)光束(11、12)在所述目標位置(41)上限定的光束位置的、分辨地點的光電探測器(5)，其中，所述測試光束(43 )在所述光電探測器(5 )上的中心校準相應于所述激發(fā)光束(11、12 )的正常校準； -存在用于依賴于所述測試光束(43)與它在所述光電探測器(5)上的中心校準間得出的偏差來操控所述能控制的傾斜鏡(2)的控制單元(6)，從而不依賴于所述傳輸光學裝置(3)由位置造成的妨礙程度而達到激光光束的方向穩(wěn)定。
2.根據(jù)權利要求1所述的激光掃描顯微鏡，其特征在于，所述能控制的傾斜鏡(2)借助能控制的鏡保持器、以選自如下的組，即電容性的、電感性的或壓電的調節(jié)器、步進電動機或直流電動機中的驅動原理為基礎來驅動。
3.根據(jù)權利要求1所述的激光掃描顯微鏡，其特征在于，所述能控制的傾斜鏡(2)借助雙軸的鏡保持器(21、22)或兩個單軸的鏡保持器(23、24)來實現(xiàn)。
4.根據(jù)權利要求1所述的激光掃描顯微鏡，其特征在于，選擇所述聚焦光學裝置(44)的入射光瞳或其它的孔徑受限的光學元件的入射光瞳作為所述至少一個激發(fā)光束(11、12)的目標位置(41)。
5.根據(jù)權利要求1所述的激光掃描顯微鏡，其特征在于，用于產生所述測試光束(43)的所述光束分束器(42 )依賴于所述至少一個激發(fā)光束(11、12 )在所述測量頭(4 )中的光束弓I導來構造為反射光束分束器或者透射光束分束器。
6.根據(jù)權利要求1所述的激光掃描顯微鏡，其特征在于，用于耦出所述測試光束(43)的所述光束分束器(42)同時構造為用于共線地耦入兩個不同的激發(fā)光束(11、12)的二向色鏡。
7.根據(jù)權利要求1所述的激光掃描顯微鏡，其特征在于，所述光電探測器(5)是圓形的光電二極管(51)。
8.根據(jù)權利要求1所述的激光掃描顯微鏡，其特征在于，除了在所述傳輸光學裝置(3)中的光束穩(wěn)定性的調整之外，激光的指向穩(wěn)定性也是能確定和能修正的。
9.根據(jù)權利要求1所述的激光掃描顯微鏡，其特征在于，用于二次輻射的探測器系統(tǒng)構造為具有用于MPT成像或SHG成像的探測器(54)，從而存在用于熒光物體的靈活的診斷系統(tǒng)，該診斷系統(tǒng)經由低機械精確度的靈活的光學活節(jié)臂(31)允許所述測量頭(4)在空間中任意自由定位并且確保能重現(xiàn)的MPT成像。
10.根據(jù)權利要求1所述的激光掃描顯微鏡，其特征在于，用于二次輻射的探測器系統(tǒng)構造為具有用于MPT成像和用于CARS成像的探測器(54、55)，從而存在用于生命物質中的熒光物體和非熒光物體的靈活的診斷系統(tǒng)，該診斷系統(tǒng)經由共同的靈活的光學活節(jié)臂(31)允許共同使用的測量頭(4)在空間中任意自由定位并且由MPT信號和CARS信號產生同時和同地的成像。
11.根據(jù)權利要求1所述的激光掃描顯微鏡，其特征在于，用于二次輻射的探測器系統(tǒng)針對MPT成像和針對CARS成像地構造，從而存在用于生命物質中的熒光物體和非熒光物體的靈活的診斷系統(tǒng)，該診斷系統(tǒng)經由靈活的光學活節(jié)臂(31)和單獨的光纖維(32)允許共同使用的測量頭(4)在空間中任意自由定位并且由MPT信號和CARS信號產生同時和同地的成像。
12.根據(jù)權利要求1所述的激光掃描顯微鏡，其特征在于，用于二次輻射的探測器系統(tǒng)針對MPT成像和針對CARS成像地構造，從而存在用于生命物質中的熒光物體和非熒光物體的靈活的診斷系統(tǒng)，該診斷系統(tǒng)經由兩個單獨的光纖維(32、33)允許共同使用的測量頭(4)在空間中任意自由定位并且由MPT信號和CARS信號產生同時和同地的成像。
13.根據(jù)權利要求1所述的激光掃描顯微鏡，其特征在于，用于二次輻射的探測器系統(tǒng)具有用于MPT成像和用于CARS成像的共同的測量探測器(57)，其中，設置有用于暫時中斷CARS激發(fā)的機構，該機構允許MPT成像相對于合并的信號顯示的分離。
14.根據(jù)權利要求1所述的激光掃描顯微鏡，其特征在于，用于二次輻射的探測器系統(tǒng)具有用于MPT成像的TCSPC探測器并且額外地具有觸發(fā)二極管(56)，該觸發(fā)二極管充分利用為了測量信號耦出而設置的光束分束器(451)的背面反射。
15.根據(jù)權利要求1所述的激光掃描顯微鏡，其特征在于，所述測量頭(4)機械式地通過靈活的、能在任意姿態(tài)上鎖止的支撐臂(8)支撐在移動的基礎儀器(7)上并且強制性地一起弓I導所述傳輸光學裝置(3 )，其中，在所述基礎儀器(7 )中至少存在用于產生脈沖激發(fā)輻射(11、12)的輻射源(71)、用于同步所述脈沖激發(fā)輻射(11、12)和校準至少一個到所述測量頭(4)的傳輸光學裝置(31、32、33)的光學單元(72)以及用于所述測量頭(4)中的所述激發(fā)輻射(11、12)的方向穩(wěn)定的所述控制單元(61)和用于處理由所述測量頭(4)的探測系統(tǒng)(54、55)傳輸?shù)挠糜诶蔑@示單元(62)來成像顯示的信號的評估單元(6)。
全文摘要
用于非侵入性三維探測的靈活的非線性激光掃描顯微鏡，尤其用于人和動物的組織中，但也能用于無生命物質中。其中在測量頭無限制靈活性的情況下允許能重現(xiàn)地照射測量對象，其中，靈活地經由傳輸光學裝置與至少一個輻射源連接的測量頭能在空間中任意自由地定位，布置有至少一個用于校準激發(fā)光束的能調節(jié)的傾斜鏡，以便保持激發(fā)光束穿過傳輸光學裝置在測量頭的每個位置上與測量頭的孔徑受限的光學元件同中心，其中，由激發(fā)光束耦出的測試光束射到用于得出光束位置的、布置在與激發(fā)光束的目標位置共軛的位置中的、分辨地點的光電探測器上，根據(jù)測試光束的中心校準來監(jiān)控該激發(fā)光束，并且借助傾斜鏡的控制單元依賴于得出的偏差實現(xiàn)激發(fā)光束的方向穩(wěn)定。
文檔編號G01N21/64GK103033917SQ201210378039
公開日2013年4月10日 申請日期2012年10月8日 優(yōu)先權日2011年10月8日
發(fā)明者卡斯滕·柯尼希, 馬丁·魏尼格爾 申請人:耶拿研究有限責任公司