專利名稱：能同時檢測狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病的免疫膠體金試紙及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及養(yǎng)殖動物疫病的檢測器具，具體涉及一種能同時檢狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病的免疫膠體金試紙。本發(fā)明還涉及該試紙的制備方法。
背景技術(shù)：
犬痕熱(Caninedistemper,CD)是由犬痕熱病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的犬和肉食目中許多動物包括狐貍、貉子和水貂的一種高度接觸性傳染病；細(xì)小病毒病(Canine Parvo, CP)是由細(xì)小病毒(Canine Parvovirus, CPV)引起的犬類動物包括狐貍、貉子和水貂的一種急性傳染病。這兩種傳染病常引起大批狐貍、貉子和水貂等動物發(fā)病，病死率一般在30% 80%之間。隨著我國狐貍、貉子和水貂等毛皮動物的飼養(yǎng)量的大幅度增力口，以及異地交流的增多，這兩種傳染病在我國狐貍、貉子和水貂等毛皮動物中的發(fā)病率和致死率均有升高的趨勢，是目前對我國狐貍、貉子和水貂等毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)危害最大的疫 病，受到了廣泛的重視。目前，病毒分離、電鏡技術(shù)、中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方法已經(jīng)在犬瘟熱、細(xì)小病毒病的診斷中發(fā)揮了作用。但是這些方法各有弊端，常規(guī)的病毒分離鑒定及中和試驗(yàn)過程繁瑣，耗時較長；電鏡技術(shù)難以在基層推廣應(yīng)用；分子生物學(xué)技術(shù)如PCR等敏感、特異，技術(shù)和設(shè)備要求高，這些檢測方法難以在獸醫(yī)臨床現(xiàn)場使用。免疫層析膠體金技術(shù)具有簡便快速，特異性強(qiáng)，敏感性高，肉眼判讀，實(shí)驗(yàn)結(jié)果易保存，無需特殊儀器設(shè)備和試劑等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在獸醫(yī)臨床疾病檢測或診斷中。目前，檢測犬的眾多疫病有其相應(yīng)疫病的膠體金試紙，而沒有專用于檢測狐貍、貉子和水貂疫病的膠體金試紙。若臨床上狐貍、貉子和水貂發(fā)生犬瘟熱或(和)細(xì)小病毒病，只能借用檢測犬的犬瘟熱或(和)細(xì)小病毒病膠體金試紙，而制備犬的犬瘟熱或(和)細(xì)小病毒病膠體金試紙所需抗犬瘟熱病毒或(和)細(xì)小病毒的單克隆抗體的抗原均從犬中分離，用在狐貍、貉子、水貂上可能會造成假陽性或假陰性結(jié)果，準(zhǔn)確性差。至今，還沒有從水貂中分離的病原體作為抗原制備的單克隆抗體制作免疫層析膠體金試紙，更沒有能同時檢測狐貍、貉子、水貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病兩種疫病的試紙。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對上述問題，提供一種能同時檢測狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病的免疫膠體金試紙，該試紙使用方便，操作簡單，檢測快速、準(zhǔn)確，并且能夠用同一試紙同時檢測狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病。本發(fā)明的目的還在于提供一種能同時檢測狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病的免疫膠體金試紙的制備方法。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案是一種能同時檢測狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病的免疫膠體金試紙，包括在上面設(shè)置加樣孔和顯色區(qū)開口的試紙條卡盒，以及設(shè)置在該試紙條卡盒內(nèi)的試紙條；所述的試紙條包括有硬質(zhì)聚氯乙烯襯板、硝酸纖維素膜、樣品墊和吸收墊，所述的硬質(zhì)聚氯乙烯襯板設(shè)置在所述的試紙條卡盒的盒底面上，所述的硝酸纖維素膜置于所述的硬質(zhì)聚氯乙烯襯板的上面，在所述試紙條卡盒的一端設(shè)有置于所述硝酸纖維素膜上面的一長膠體金結(jié)合墊和置于所述長膠體金結(jié)合墊上面的一短膠體金結(jié)合墊，所述的樣品墊置于所述的短膠體金結(jié)合墊的上面，該樣品墊的上面與所述的加樣孔相對應(yīng)，所述的吸收墊置于所述試紙條卡盒的另一端位于所述硝酸纖維素膜的上面；所述的長膠體金結(jié)合墊和短膠體金結(jié)合墊上分別噴涂有抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，該抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體為用純化的貂源犬瘟熱病毒和重組的酵母表達(dá)的帶組氨酸標(biāo)簽的細(xì)小病毒的VP2基因蛋白免疫Balb/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，篩選得到抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體為雜交瘤細(xì)胞系分泌的，所述的硝酸纖維素膜上分別噴涂有兔抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒抗體構(gòu)成的兩條檢測線和兔抗鼠抗體構(gòu)成的一條質(zhì)控線，該兩條檢測線和質(zhì)控線與所述的顯色區(qū)開口相對應(yīng)。 所述能同時檢測狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病的免疫膠體金試紙的制備方法，它包括以下步驟
1、制備純化的貂源犬瘟熱病毒和重組的酵母表達(dá)的帶組氨酸標(biāo)簽的細(xì)小病毒的VP2基因蛋白；
2、分別用純化的貂源犬瘟熱病毒和重組的酵母表達(dá)的帶組氨酸標(biāo)簽的細(xì)小病毒的VP2基因蛋白免疫Balb/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，篩選得到分泌抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系；
3、制備抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體；
4、用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；
5、將步驟3制得的抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體分別加入步驟4制備得到的膠體金中，分別得到抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體一膠體金標(biāo)記物；
6、將抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體一膠體金標(biāo)記物分別噴涂在長膠體金結(jié)合墊和短膠體金結(jié)合墊上；
7、制備兔抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒抗體，制備兔抗鼠抗體；
8、將兔抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的抗體噴涂在硝酸纖維素膜上構(gòu)成兩條檢測線，并將兔抗鼠抗體噴涂在硝酸纖維素膜上構(gòu)成一條質(zhì)控線；
9、將硬質(zhì)聚氯乙烯襯板、硝酸纖維素膜、長膠體金結(jié)合墊、短膠體金結(jié)合墊、樣品墊、吸收墊按順序粘結(jié)在一起組成試紙條，并將該試紙條按要求固定裝入試紙條卡盒內(nèi)，得到所述的能同時檢測狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病的免疫膠體金試紙。本發(fā)明借助膠體金標(biāo)記顯色的免疫層析反應(yīng)，以制備能同時檢測狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病的免疫膠體金試紙，結(jié)構(gòu)更加合理，應(yīng)用兔抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒抗體作為檢測線，建立競爭免疫層析快速檢測待測樣品中是否含有犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)
I、適用于狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病的快速檢測，并且能用同一試紙同時檢測犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒。
2、本發(fā)明的試紙檢測結(jié)果特異性強(qiáng)，靈敏度高。犬瘟熱病毒或細(xì)小病毒細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID5tl)達(dá)9. 4X IO5稀釋至I :512仍可檢測到。3、本發(fā)明的試紙不需任何儀器設(shè)備，攜帶方便，檢測成本低。4、本發(fā)明的試紙操作簡單易掌控，無需專業(yè)人員操作。5、本發(fā)明的試條保存方便，穩(wěn)定性好。


附圖是本發(fā)明能同時檢測狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病的免疫膠體金試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。如附圖，本發(fā)明能同時檢測狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病的免疫膠體金試紙包括有試紙條和試紙條卡盒3,試紙條固定在試紙條卡盒3內(nèi)。試紙條卡盒3有盒體和上蓋兩部分，在上蓋靠左側(cè)的位置開設(shè)有加樣孔1，在上蓋中部位置開設(shè)有顯色區(qū)開口 2。試紙條是由硬質(zhì)聚氯乙烯襯板4、硝酸纖維素膜5、樣品墊6、吸收墊7、長膠體金結(jié)合墊8和短膠體 金結(jié)合墊9通過粘結(jié)組合成一體而構(gòu)成，其具體組合結(jié)構(gòu)是硝酸纖維素膜5置于硬質(zhì)聚氯乙烯襯板4的上面，在硝酸纖維素膜5的上面靠左側(cè)由下至上依次設(shè)置長膠體金結(jié)合墊8、短膠體金結(jié)合墊9和樣品墊6，吸收墊7設(shè)置在硝酸纖維素膜5上面靠右側(cè)的位置。試紙條可采用粘接、卡槽固定、盒體上蓋壓緊的方式固定在試紙條卡盒內(nèi)。在硝酸纖維素膜5的中部噴涂有兩條檢測線10和一條質(zhì)控線11。長膠體金結(jié)合墊8和短膠體金結(jié)合墊9由玻璃纖維素膜制成，一個長膠體金結(jié)合墊8和一個短膠體金結(jié)合墊9為一組，該兩膠體金結(jié)合墊上分別噴涂膠體金標(biāo)記的抗水貂的犬瘟熱病毒單克隆抗體和細(xì)小病毒VP2基因蛋白單克隆抗體，所述的抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體為用純化的貂源犬瘟熱病毒和重組的酵母表達(dá)的帶組氨酸標(biāo)簽的細(xì)小病毒的VP2基因蛋白免疫Balb/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，篩選得到抗貂源犬痕熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體為雜交瘤細(xì)胞系分泌的。硝酸纖維素膜5為試紙條的檢測膜，上面靠左側(cè)的為兩條檢測線10，質(zhì)控線11位于右側(cè)，兩條檢測線10分別噴涂兔抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒抗體，質(zhì)控線11噴涂兔抗鼠抗體。當(dāng)被檢樣品中含有相應(yīng)病毒時，病毒可分別先與金標(biāo)抗貂源犬瘟熱病毒單克隆抗體和細(xì)小病毒VP2基因單克隆抗體結(jié)合，然后在層析作用下與相應(yīng)檢測線上的抗體結(jié)合而富集后形成肉眼可見的色帶，進(jìn)而根據(jù)顯色結(jié)果進(jìn)行判定。本發(fā)明能同時檢測狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病的免疫層析膠體金試紙的具體制備方法是
I、抗貂源犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備將從水貂中分離的犬瘟熱病毒河北株培養(yǎng)純化，以培養(yǎng)純化的貂源犬瘟熱病毒河北株免疫Balb/c小鼠，第I次腹部皮下注射完全弗氏佐劑+貂源犬瘟熱病毒抗原(I =DlOOyL,按SOyg蛋白/只小鼠的量，初次免疫4只無特定病原體(SPF)的Balb/c雌性小鼠。一周后皮下第一次加強(qiáng)免疫，注射不完全弗氏佐劑+犬瘟熱病毒抗原(I : I) 100 μ L，抗原量為50 μ g ;再過14d后，腹腔注射不完全弗氏佐劑+貂源犬瘟熱病毒抗原(I : I) 200 μ L，抗原量為100 μ g，間隔14d，尾靜脈采血，測定免疫效果。上述，當(dāng)抗體效價達(dá)到要求后，于融合前3d (與上次免疫相隔2周以上)用非乳化抗原加強(qiáng)免疫一次。3d后，無菌取脾進(jìn)行融合。經(jīng)過細(xì)胞融合，細(xì)胞上清用抗原包被的酶標(biāo)板來篩選，同時設(shè)陰、陽性對照。得到的陽性克隆經(jīng)過多次檢測，分泌抗體穩(wěn)定。有限稀釋法克隆3次后，陽性檢出率達(dá)100%。依法共得14株陽性克隆細(xì)胞，再用純化的貂源犬瘟熱病毒包被酶標(biāo)板，作復(fù)合檢測，將14株陽性的細(xì)胞株，再次用貂源犬瘟熱病毒包板，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，做第二次篩選，得到3株陽性雜交瘤細(xì)胞株編號為4-lE7、6-2H10、7-lC6。將篩選出來的3株陽性細(xì)胞株進(jìn)行亞類鑒定，得到3株免疫球蛋白IgGl類型的陽性雜交瘤細(xì)胞株。其腹水效價可達(dá)到1:51200和1:204800，細(xì)胞培養(yǎng)上清液效價可達(dá)到1:256和1:512。將收集的腹水12 OOOXg離心15min，棄去表層油脂，上清用辛酸-硫酸銨法純化。經(jīng)辛酸-硫酸銨鹽析法純化尚有少量雜帶，單抗樣品再經(jīng)G-蛋白親和純化后，幾乎無任何雜帶出現(xiàn)，抗體純度非常高。獲得的單抗僅與犬瘟熱病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，而與其它病毒如細(xì)小病毒和犬傳染性肝炎病毒-I型(CAV- I )及犬傳染性肝炎病毒-II型(CAV- II)沒有交叉反應(yīng)。2、抗酵母表達(dá)貂源細(xì)小病毒VP2基因蛋白的單克隆抗體的制備用聚合酶鏈?zhǔn)椒?br> 應(yīng)方法對貂源細(xì)小病毒VP2基因進(jìn)行擴(kuò)增，成功擴(kuò)增到了細(xì)小病毒VP2基因，將細(xì)小病毒VP2基因克隆到畢赤酵母分泌表達(dá)載體pPICZAA中，構(gòu)建真核重組表達(dá)載體pPICZAA-VP2，將該重組質(zhì)粒線性化后，轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母X-33中，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)小病毒VP2基因，聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡法鑒定表達(dá)蛋白。結(jié)果成功擴(kuò)增了細(xì)小病毒VP2基因，構(gòu)建了真核重組表達(dá)載體PPICZAA-VP2，在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)出約68 kD蛋白。免疫印跡法鑒定后，表達(dá)蛋白為目的蛋白基因VP2。表達(dá)菌株擴(kuò)大表達(dá)體系于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，上清液用70%過硫酸銨4°C沉淀濃縮，采用His選擇鎳-親和層析柱分離純化獲得重組的酵母表達(dá)的帶組氨酸標(biāo)簽的VP2基因蛋白，表達(dá)量約3mg/L。以純化的酵母重組表達(dá)的細(xì)小病毒VP2基因蛋白免疫Balb/c小鼠，將過濾后的重組VP2基因蛋白用完全弗氏佐劑隔兩周加強(qiáng)一次免疫，換用不完全弗氏佐劑乳化的抗原。一般在3免和4免后第IOd檢測Balb/c小鼠抗體效價，當(dāng)抗體效價達(dá)到效價達(dá)I : 5000 I : 10000以上時供融合用。取免疫Balb/c小鼠脾臟制備成脾細(xì)胞，以聚乙二醇PEG1500為融合劑與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。挑細(xì)胞單克隆，培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。用免疫原包板，對挑選的克隆采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，做第一次篩選，得到27株陽性雜交瘤細(xì)胞株。用有限稀釋法克隆純化陽性孔，將27株陽性的細(xì)胞株，用貂源細(xì)小病毒再次包板，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法，做第二次篩選，得到11株陽性雜交瘤細(xì)胞株。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法篩選，獲得4株能穩(wěn)定分泌抗細(xì)小病毒VP2基因蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。4株單克隆抗體中，2株屬于免疫球蛋白IgG2b亞類，2株屬于免疫球蛋白IgGl亞類，其腹水效價可達(dá)到1:51200和1:204800，細(xì)胞培養(yǎng)上清液效價可達(dá)到1:256,1:512。所獲得的單克隆抗體僅與細(xì)小病毒及其細(xì)小病毒VP2基因蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而與其它病毒如犬瘟熱病毒和犬傳染性肝炎病毒-I型及犬傳染性肝炎病毒-II型沒有交叉反應(yīng)；熒光免疫染色病毒檢測進(jìn)一步表明單克隆抗體的特異性效果好。3、膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法來制備膠體金。用容量瓶量取IOOmL的三蒸去離子水，倒入規(guī)格為500. OmL的平底燒瓶中，將燒瓶放在磁力加熱攪拌器的加熱套內(nèi)，放入磁力攪拌子，打開攪拌旋鈕至適當(dāng)速度，打開加熱旋鈕，加熱至沸騰。加入I. OmL 1%氯金酸(HAuCH)溶液，繼續(xù)加熱2min，然后按100. OmL 0.01 %氯金酸；加入1.8mL 1%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱。淺黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸三鈉加入后2min內(nèi)逐漸由黃變灰再變黑最后變紅或橙紅色。待溶液變?yōu)榱良t色或橙紅色后，再繼續(xù)加熱攪拌15min。制備的膠體金外觀呈清亮透明的橙紅色，通過分光光度計掃描其在吸收光譜中產(chǎn)生最大吸收所對應(yīng)的波長Xmax為522nm,通過電鏡觀察,顆粒大小均勻,平均直徑為18. 5nm。4、貂源犬瘟熱病毒單克隆抗體(1C6)和細(xì)小病毒VP2基因蛋白單克隆抗體(2B3)膠體金標(biāo)記與純化。取一系列小試管，分別加入5 mL膠體金，用O. I mol/L碳酸鉀(K2CO3)調(diào)節(jié)膠體金的PH值分別調(diào)為6,6. 5、7、7· 5、8、8. 5、9、9· 5、10 ;然后在每種不同pH值的膠體金中分別加入I. Omg/mL的犬瘟熱病毒單克隆抗體(1C6) 100. Ομ ，用封口膜封閉試管口，靜置15min,4°C 2000r/min離心10 min。取上清用紫外一可見光分光光度計在可見光范圍內(nèi)(400 600 nm)進(jìn)行掃描，獲得膠體金可見光吸收光譜，測定最大吸收波長、吸光值。以出現(xiàn)最大吸收峰時對應(yīng)的膠體金PH值為最佳標(biāo)記pH值。犬瘟熱病毒單克隆抗體(1C6)膠體金標(biāo)記的最佳pH值為8. O,當(dāng)ImL膠體金中單克隆抗體添加量為IOPg時，對應(yīng)的吸收峰最大，在此基礎(chǔ)上再加20%，即最適標(biāo)記量為12Pg/mL膠體金。由于都 是鼠源單克隆抗體，細(xì)小病毒VP2基因蛋白單克隆抗體(2B3)與細(xì)小病毒單克隆抗體(1C6)最適標(biāo)記相同。于50. OmL的小燒杯中加入20. OmL的膠體金，調(diào)pH至最佳標(biāo)記pH值后，在攪拌的狀態(tài)下緩慢加入一定量稀釋好的lmg/mL的單克隆抗體,攪拌30min,加入10%牛血清白蛋白(BSA)至終濃度為1%，繼續(xù)攪拌30 min，4°C放置2h后，將上述膠體金標(biāo)記物分裝于7. OmL的離心管中，以2 000r/min離心15min,吸出上清,棄沉淀；以8 700r/min離心45 min,棄去上清夜,加入標(biāo)記洗漆液至原體積；再次以10 000r/min離心30min,棄去上清夜,加入標(biāo)記洗漆液至原體積；以10 000r/min離心30 min,棄去上清夜,沉淀用I. OOmL標(biāo)記洗漆液重懸,置4 °C冰箱備用。5、硝酸纖維素膜和膠體金結(jié)合墊包被6%甲醇的0.01 mol/L pH 7. 2磷酸鹽緩沖液(PBS)為包被緩沖液，0. 22um膜濾過，置4°C備用。封閉液采用2%牛血清白蛋白(BSA)、1% 吐溫 20,0. 5% 聚乙烯毗咯烷酮 K30 (PVP K30)，2. 5% 蔗糖、0. 02% 疊氮納(NaN3)、
0.01 mol/L PH7.4 PBS溶液，0. 22 μ m微孔濾膜濾過，置4°C備用。檢測膜為硝酸纖維素膜，選用Millipore HF135，膜的流速為135 士 34 s/cm，孔徑大約為0. 45Mm。先將兔抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒抗體、兔抗鼠抗體用所述包被緩沖液稀釋后，分別噴涂于所述的硝酸纖維素膜Millipore HF135上，作為檢測線10 (犬瘟熱線和細(xì)小病毒病線)和質(zhì)控線11，噴涂在檢測膜硝酸纖維素膜檢測線10上犬瘟熱線的兔抗貂源犬瘟熱病毒抗體濃度為I. 5mg/mL,噴涂量為2-3PL/cm ;噴涂在檢測膜硝酸纖維素膜檢測線10上細(xì)小病毒病線的兔抗貂源細(xì)小病毒抗體濃度為I. 0mg/mL，噴涂量為3_4pL/cm ;噴涂在檢測膜硝酸纖維素膜質(zhì)控線11上兔抗鼠抗體濃度為0. 8mg/mL,噴涂量為l_3PL/cm,于37°C溫箱烘干備用。長、短膠體金結(jié)合墊的材料為玻璃纖維膜，將膠體金標(biāo)記的抗貂源犬瘟熱病毒單克隆抗體和細(xì)小病毒VP2基因蛋白單克隆抗體稀釋后，分別噴涂于長膠體金結(jié)合墊8和短膠體金結(jié)合墊9上，37°C烘干備用。噴涂在長膠體金結(jié)合墊的膠體金標(biāo)記抗貂源犬瘟熱病毒單克隆抗體(I. 5mg/mL)和短膠體金結(jié)合墊抗貂源細(xì)小病毒VP2基因蛋白單克隆抗體(I. 5mg/mL)作5倍稀釋，噴涂量分別為 50-6(^L/cm。6、試紙的組裝將處理好的樣品墊6、噴涂有抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒VP2基因蛋白單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的長膠體金結(jié)合墊8、短膠體金結(jié)合墊9、噴涂有兔抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒抗體作為檢測線10和噴涂有兔抗鼠抗體作為質(zhì)控線11的硝酸纖維素膜5、吸收墊7順序依次粘附在硬質(zhì)聚氯乙烯襯板4上，組成試紙條，將該試紙條安裝在上面開有加樣孔I和顯色區(qū)開口 2的試紙條卡盒3內(nèi)，真空封裝，常溫保存，有效期6個月。本發(fā)明能同時檢測狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病的免疫層析膠體金試紙的應(yīng)用
I、狐、貉、貂樣品的預(yù)處理收集到的疑似犬瘟熱的狐、貉、貂樣品如病狐、貉、貂的眼淚、鼻拭和細(xì)小病毒感染的狐、貉、貂糞便或病死的狐、貉、貂臟器樣品，各有陰性樣品作對照。疑似犬瘟熱病毒狐、貉、貂的病料如眼淚、鼻拭、病死臟器樣品每份取約O. 5g(mL)左右，加生理鹽水約O. 5mL,制成混懸液。疑似細(xì)小病毒感染的狐、貉、貂的糞便每份取約 O. 5g左右，加生理鹽水約O. 5mL,充分搖動后靜置5min (或離心)。2、檢測分別取上清液IOOPL滴在本發(fā)明試紙上，IOmin后觀察結(jié)果。同時分別取ΙΟΟμ O. OlM PBS和已知的TCID5tl為9. 4Χ IO5的犬瘟熱病毒、細(xì)小病毒細(xì)胞培養(yǎng)液(I :512稀釋)于另兩個試紙的加樣孔中，做陰性空白和陽性標(biāo)準(zhǔn)品對照試驗(yàn)。3、結(jié)果判定在質(zhì)控線11呈現(xiàn)紅色線時，在加樣孔I中加入疑似犬瘟熱的狐、貉、貂樣品，在顯色區(qū)開口 2處，檢測線10出現(xiàn)紅色線，為犬瘟熱陽性，即樣品中含有犬瘟熱病毒，不出現(xiàn)紅色線，為犬瘟熱陰性，即樣品中不含有犬瘟熱病毒；在加樣孔I中加入疑似細(xì)小病毒感染的狐、貉、貂的樣品，檢測線10出現(xiàn)紅色線，為細(xì)小病毒病陽性，即樣品中含有細(xì)小病毒，未出現(xiàn)紅色線，為細(xì)小病毒病陰性，即樣品中不含有細(xì)小病毒。若質(zhì)控線11未出現(xiàn)紅色線，則試紙無效。本發(fā)明的應(yīng)用效果舉例
I、特異性試驗(yàn)對己知的犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行交叉試驗(yàn)，同時設(shè)PBS陰性對照。用O. OlM PBS對己知的TCID5tl為9. 4X IO5的犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒細(xì)胞培養(yǎng)液作倍比稀釋至1:512，分別取IOOPL滴在加樣孔，用本發(fā)明試紙檢測，進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。當(dāng)樣品中同時含有犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒時，在顯色區(qū)開口 2中，檢測線10 (兩條紅色檢測線)均呈陽性反應(yīng)(有2條紅色條帶出現(xiàn))，而當(dāng)樣品中只含有犬瘟熱病毒或細(xì)小病毒時，則只在對應(yīng)的一條檢測線上呈現(xiàn)陽性反應(yīng)(在相應(yīng)位置有I條紅色線出現(xiàn))，PBS陰性對照(檢測線無任何條帶出現(xiàn))以及犬傳染性肝炎病毒-I型及犬傳染性肝炎病毒-II型等其它病毒均呈陰性反應(yīng)(均無條帶出現(xiàn))，多次重復(fù)5次后結(jié)果相同，說明該方法具有高度的特異性。2、敏感性試驗(yàn)用PBS對已知犬瘟熱病毒或細(xì)小病毒(細(xì)胞半數(shù)感染量TCID5tl為
9.4Χ IO5)作倍比稀釋至1:512，分別取IOOPL滴在加樣孔，試紙仍呈陽性反應(yīng)(檢測線有2條紅色條帶出現(xiàn))，證明本發(fā)明試紙的敏感性強(qiáng)。3、穩(wěn)定性試驗(yàn)將本發(fā)明的5批試紙(批次號120516、120518、120519、120528、120530)在37°C恒溫培養(yǎng)箱中放置7d后，與保存4°C的同批試紙同時檢測10份犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒陽性樣品和10份犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒陰性樣品，結(jié)果顯示37°C作用7d對本發(fā)明的試紙無破壞作用，證明試紙?jiān)诟邷叵路€(wěn)定。4、保存期試驗(yàn)將同一批制備的本發(fā)明的試紙，分別在4°C和室溫保存I至6個月，于O個月、3個月、6個月取出，檢測I份倍比稀釋的犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒陽性樣品進(jìn)行保存期敏感性試驗(yàn)，檢測10份已知的犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒陽性樣品和犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒陰性樣品進(jìn)行保存期特異性試驗(yàn)，觀察期敏感性、特異性和穩(wěn)定性，以確定試紙的保存期。結(jié)果顯示本發(fā)明的試紙經(jīng)室溫保存6個月期特異性、敏感性均不發(fā)生改變。
5、與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、血凝試驗(yàn)方法比較臨床上狐、貉、貂的犬瘟熱確診常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測，狐、貉、貂的細(xì)小病毒病確診常用血凝試驗(yàn)方法檢測。120份被檢犬瘟熱疑似病例狐、貉、貂的眼淚(鼻拭、病死臟器)樣品中，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測陽性為47份，陰性為73份，用本發(fā)明試紙檢測陽性為49份，陰性為71份，結(jié)果顯示犬瘟熱用本發(fā)明試紙方法檢測陽性率40. 83%較酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測檢測陽性率39. 16%高(試驗(yàn)結(jié)果同時用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測，是相符的);120份被檢細(xì)小病毒病疑似病例狐、貉、貂的糞便(病死臟器)樣品中，用血凝實(shí)驗(yàn)方法檢測陽性為50份，陰性為70份，用本發(fā)明試紙檢 測陽性為53份，陰性為67份，結(jié)果顯示細(xì)小病毒病用本發(fā)明試紙方法檢測陽性率79. 10%較血凝試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法檢測檢測陽性率71. 42%高(試驗(yàn)結(jié)果同時用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測，是相符的)。
權(quán)利要求
1.一種能同時檢測狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病的免疫膠體金試紙，包括在上面設(shè)置加樣孔和顯色區(qū)開口的試紙條卡盒，以及設(shè)置在該試紙條卡盒內(nèi)的試紙條；所述的試紙條包括有硬質(zhì)聚氯乙烯襯板、硝酸纖維素膜、樣品墊和吸收墊，其特征是所述的硬質(zhì)聚氯乙烯襯板設(shè)置在所述的試紙條卡盒的盒底面上，所述的硝酸纖維素膜置于所述的硬質(zhì)聚氯乙烯襯板的上面，在所述試紙條卡盒的一端設(shè)有置于所述硝酸纖維素膜上面的一長膠體金結(jié)合墊和置于所述長膠體金結(jié)合墊上面的一短膠體金結(jié)合墊，所述的樣品墊置于所述的短膠體金結(jié)合墊的上面，該樣品墊的上面與所述的加樣孔相對應(yīng)，所述的吸收墊置于所述試紙條卡盒的另一端位于所述硝酸纖維素膜的上面；所述的長膠體金結(jié)合墊和短膠體金結(jié)合墊上分別噴涂有抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，所述的抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體為用純化的貂源犬瘟熱病毒和重組的酵母表達(dá)的帶組氨酸標(biāo)簽的細(xì)小病毒的VP2基因蛋白免疫Balb/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，篩選得到抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體為雜交瘤細(xì)胞系分泌的，所述的硝酸纖維素膜上分別噴涂有兔抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒抗體構(gòu)成的兩條檢測線和兔抗鼠抗體構(gòu)成的一條質(zhì)控線，該兩條檢測線和質(zhì)控線與所述的顯色區(qū)開口相對應(yīng)。
2.一種權(quán)利要求I所述的能同時檢測狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病的免疫膠體金試紙的制備方法，其特征是它包括以下步驟 (1)制備純化的貂源犬瘟熱病毒和重組的酵母表達(dá)的帶組氨酸標(biāo)簽的細(xì)小病毒的VP2基因蛋白； (2)分別用純化的貂源犬瘟熱病毒和重組的酵母表達(dá)的帶組氨酸標(biāo)簽的細(xì)小病毒的VP2基因蛋白免疫Balb/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，篩選得到分泌抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系； (3)制備抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體； (4)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金； (5)將步驟(3)制得的抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體分別加入步驟(4)制備得到的膠體金中，分別得到抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體一膠體金標(biāo)記物； (6)將抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體一膠體金標(biāo)記物分別噴涂在長膠體金結(jié)合墊和短膠體金結(jié)合墊上； (7)制備兔抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒抗體，制備兔抗鼠抗體； (8)將兔抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的抗體噴涂在硝酸纖維素膜上構(gòu)成兩條檢測線，并將兔抗鼠抗體噴涂在硝酸纖維素膜上構(gòu)成一條質(zhì)控線； (9)將硬質(zhì)聚氯乙烯襯板、硝酸纖維素膜、長膠體金結(jié)合墊、短膠體金結(jié)合墊、樣品墊、吸收墊按順序粘結(jié)在一起組成試紙條，并將該試紙條按要求固定裝入試紙條卡盒內(nèi)，得到所述的能同時檢測狐、貉、貂犬瘟熱和細(xì)小病毒病的免疫膠體金試紙。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能同時檢測狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病的免疫膠體金試紙及其制備方法。該試紙由試紙條卡盒試紙條組成，試紙條由硬質(zhì)聚氯乙烯襯板、硝酸纖維素膜、長膠體金結(jié)合墊、短膠體金結(jié)合墊、樣品墊、吸收墊按順序粘結(jié)在一起組成；所述的長、短膠體金結(jié)合墊分別噴涂有抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒的VP2基因單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，所述的硝酸纖維素膜上分別噴涂有兔抗貂源犬瘟熱病毒和細(xì)小病毒抗體構(gòu)成的兩條檢測線和兔抗鼠抗體構(gòu)成的一條質(zhì)控線。本發(fā)明的試紙適用于狐、貉、貂的疫病快速檢測，并且用同一試紙能夠同時完成狐、貉、貂的犬瘟熱和細(xì)小病毒病兩種疫病的檢測，其檢測簡單方便、快速、準(zhǔn)確。
文檔編號G01N33/577GK102879573SQ20121037915
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月9日
發(fā)明者史秋梅, 賀英, 張艷英, 潘素敏, 高桂生, 邵欣華, 梁銀聚, 甄盼盼, 李彩虹 申請人:河北科技師范學(xué)院, 河北新華科極獸藥有限公司