專利名稱：貝肉中16種脂溶性貝類毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脂溶性貝類毒素的檢測方法，特別是一種貝肉中16種脂溶性貝類毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法
背景技術(shù)：
海洋生物毒素(貝類毒素)特指主要由海洋有毒微藻或微生物產(chǎn)生、能夠在海洋生物尤其是雙殼貝類中富集的、對其他生物包括人類產(chǎn)生危害的一大類小分子有毒化學(xué)物質(zhì)。針對這些生物毒素，研究者初期主要根據(jù)所引起的中毒癥狀將其分為六大類麻痹性貝類毒素(Paralytic Shellfish Poisoning, PSP)、腹灣性貝類毒素(DiarrheticShellfish Poisoning, DSP)、神經(jīng)性貝類毒素(Neurotoxic Shellfish Poisoning, NSP)、·記憶缺失性貝類毒素(Amnesic Shellfish Poisoning,ASP)、西加魚毒素(Ciguatera FishPoisoning, CFP)、藍綠藻毒素。不過隨著研究的深入，新的生物毒素種類不斷被發(fā)現(xiàn)，且多種毒素如OA往往與毒素AZA和PTX伴生而成，但具有不同的致毒機理，原有分類方法已不能滿足管理和科研的需求。因此，2004年，由聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織和政府間海洋委員會共同組建的雙殼類軟體生物毒素工作組將貝類毒素分為八大類，分別為石房蛤毒素組(Saxitoxin, STX)、軟骨藻酸組(Domoic acid, DA)、大田軟海綿酸毒素組(Okadaicacid, 0A)、原多甲酸毒素組(Azaspiracid, AZA)、短裸甲藻毒素組(Brevetoxin, BTX)、蛤毒素組(Pecenotoxins, PTX)、蟲下夷扇貝毒素組(Yessotoxin, YTX)和環(huán)亞胺類毒素(Cyclicimines,CIs)。除此之外，水螅毒素(Palytoxins,P1TX)和西加魚毒素(Ciguatoxins,CTX)也正在被考慮是否劃作貝類毒素中。現(xiàn)有8大類貝類毒素中，STX和DA毒素組較易溶解于水，比較而言0A、AZA> BTX、PTX、YTX、CIs均為聚醚類物質(zhì)，具熱穩(wěn)定性，易溶解于甲醇、乙醚等非極性有機試劑中，因此被統(tǒng)一稱作為脂溶性貝類毒素(lipophilic phycotoxins，LPs)。LPs的脂溶性導(dǎo)致這類毒素在貝類等生物體中的消除半衰期長達數(shù)十天甚至數(shù)月，在貝類肌肉、內(nèi)臟團等組織中的分布不具有顯著的組織差異性，且加熱、微波等常規(guī)加工方式因降低水產(chǎn)品中的水分含量而導(dǎo)致毒素濃度更高，因此這類毒素對消費者帶來的潛在危害更難預(yù)防，已成為歐盟等發(fā)達國家制定貿(mào)易和技術(shù)壁壘的重要關(guān)注點?，F(xiàn)有的檢測技術(shù)主要還是小鼠生物法，存在動物福利以及檢出限高且不能明確辨析貝毒成分等問題，雖然質(zhì)譜檢測技術(shù)也已開始用于貝類毒素的檢測，但檢測種類比較單一，或前處理方法尚需進一步完善。因此建立一種快速、靈敏、準確的多種脂溶性貝類毒素同時檢測方法變得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種方法針對性強、操作簡單、準確快速、檢測面廣、測試成本低、易于推廣應(yīng)用的貝肉中16種脂溶性貝類毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的。
一種貝肉中16種脂溶性貝類毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法，包括樣品處理、凈化、測定條件、定性測定和定量測定，其具體步驟如下(I)樣品處理精確稱取樣品后，加入甲醇，渦旋混合，超聲提取，離心取上清液，殘渣中加入甲醇,重復(fù)提取一次,合并兩次提取液,于40°C氮氣吹至約lmL，加入3mL水渦旋混勻，超聲Imin ；(2)凈化依次用ImL甲醇、ImL 30%甲醇水溶液活化Strata _X固相萃取柱，注入提取液，再用ImL 20%甲醇水溶液淋洗，最后用ImL O. 3%氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，甲醇定容至lmL，洗脫液過O. 22 μ m濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析；(3)測定條件待測樣品用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜進行測定，儀器參數(shù)條件見表1，選擇反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量見表2 ； 表I液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的儀器參數(shù)條件
相色譜條，
色譜柱__C18 柱，100 mm X 2.1 mm (i.d·), 3.5 μιη_
流動相 0.15°/。甲酸水溶液(A),乙腈溶液(B)
流速0.30mL/min
進樣量 5 μ
梯度洗脫程時間(min)A (%) B (%)
序 0.01— 90 10
—5.0010 90
一 5.01~ 10 90
7.00— 10 90■
一 10.00— 90 10
_ 15.00I 90 I10
質(zhì)譜參考條件__
離子源電噴霧離子源
掃描方式ESI-/ESI+切換掃描
監(jiān)測方式多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)
電噴霧電壓(IS)5500V
氣簾氣壓力(CUR)高純氮氣，15 一
霧化氣壓力(GSI)高純氮氣，50 —
輔助氣流速(GS2)高純氮氣，40
離子源溫度(TEM)—高純氮氣，550°C
碰撞氣(CAD)高純氮氣，10表2選擇反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子、碰撞能量和掃描方式
毒奉名稱簡稱 QiMassQ3 Mass~ ^^ ~掃模式
喊祝小__(Da)(Pa)(volts)(volts) ^
AZA-I ~ 842.5 824.55040 一正離子
AZA-I ~ 842.5 806.5*5055正離子
AZA-2 856J 83815040正離子
原多甲酸母素 h-------·TO— 50~I離手—
AZA-3__828.5 810.5__60__40正離子
_ AZA-3 ~ 828.5 ~ 792.5*50 50正離子—
PTX-2 — 876.4212.7* 40 50' 正離子— _ _ PTX-2 ~ 876.4 823.0 40 —_30正離子
~環(huán)亞胺類毒奉GYM508Γ 174.1* ~ 6030 正離子_
M妝哭母系GYM508.3490.36050正離子
權(quán)利要求
1. 一種貝肉中16種脂溶性貝類毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法，包括樣品處理、凈化、測定條件、定性測定和定量測定，其特征在于具體步驟如下 (1)樣品處理精確稱取樣品后，加入甲醇，渦旋混合，超聲提取，離心取上清液，殘渣中加入甲醇，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，于40°c氮氣吹至約lmL，加入3mL水渦旋混勻，超聲Imin ； (2)凈化依次用ImL甲醇、ImL30%甲醇水溶液活化Strata -X固相萃取柱，注入提取液，再用ImL 20%甲醇水溶液淋洗，最后用ImL O. 3%氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，甲醇定容至lmL，洗脫液過O. 22 μ m濾膜后，供液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜分析； (3)測定條件待測樣品用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜進行測定，儀器參數(shù)條件見表1，選擇反應(yīng)監(jiān)測母離子、子離子和碰撞能量見表2 ； 表I液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的儀器參數(shù)條件
全文摘要
一種貝肉中16種脂溶性貝類毒素的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法，包括樣品處理、凈化、測定條件、定性測定和定量測定。本發(fā)明檢測方法采用甲醇提取，固相萃取柱凈化，進行貝肉中16種脂溶性貝類毒素的同時檢測。方法操作簡單方便，凈化效果好，整體回收率高，重現(xiàn)性強，同時節(jié)省了有機溶劑和處理時間，簡化了樣品的前處理過程。
文檔編號G01N30/60GK102928528SQ20121038844
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者譚志軍, 吳海燕, 郭萌萌, 李兆新, 王聯(lián)珠, 翟毓秀 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所