專利名稱：一種高效液相色譜法測(cè)定豆芽中尿素殘留量的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種豆芽中尿素殘留量的檢測(cè)方法，具體涉及一種高效液相色譜法測(cè)定豆芽中尿素殘留量的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
尿素別名碳酰二胺、碳酰胺、脲，是由碳、氮、氧和氫組成的有機(jī)化合物，又稱脲，其化學(xué)式為CO(NH2)2,白色晶體或粉末。它是動(dòng)物蛋白質(zhì)代謝后產(chǎn)物，通常用作植物的氮肥。尿素在肝合成，是哺乳類動(dòng)物排出的體內(nèi)含氮代謝物。尿素是第一種以人工合成無機(jī)物質(zhì)而得到的有機(jī)化合物，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、化妝品等領(lǐng)域。近年來，不法生產(chǎn)經(jīng)營者在豆芽生產(chǎn)過程中，非法添加尿素來促其快速生長。食用后，殘留的尿素會(huì)被人體吸收，在體內(nèi)產(chǎn)生亞硝酸鹽，長期食用可致癌，嚴(yán)重危害食用者健康。各省市加大對(duì)豆芽的違法生產(chǎn)經(jīng)營的查處力度，搗毀了一大批“問題豆芽”生產(chǎn)窩點(diǎn)，保障廣大消費(fèi)者的健康和利益。目前，國內(nèi)尚沒有豆芽中尿素的限量要求和指標(biāo)，對(duì)于尿素在食品工業(yè)生產(chǎn)中的使用標(biāo)準(zhǔn)也有所變化，《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760-2007)、《進(jìn)出口食品添加劑檢驗(yàn)規(guī)程第25部分食品工業(yè)用加工助劑》(SN/T 2360. 25-2009)均將尿素納入允許使用的食品工業(yè)用加工助劑(食品工業(yè)用加工助劑一般應(yīng)在制成最后成品之前除去，有規(guī)定食品中殘留量的除外)，但《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(GB 2760-2011)食品工業(yè)加工助劑名單中已無尿素?！抖寡啃l(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB22556-2008)中規(guī)定，食品添加劑的品種和使用量應(yīng)符合GB2760的規(guī)定；地方標(biāo)準(zhǔn)四川省《豆芽》(DB51/T1061-2010)、北京市《豆芽安全衛(wèi)生要求》(DBl 1/377-2006)、青島市《豆芽生產(chǎn)管理技術(shù)規(guī)范》(DB 3702/T090-2006)、浙江省《無公害豆芽第2部分質(zhì)量安全要求》(DB33/625. 2-2007)等，主要限定鉛、無機(jī)砷、總汞、鎘、亞硫酸鹽、亞硝酸鹽、百菌清、多菌靈、2，4-D、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸鈉、赤霉素等最大殘留量，并無尿素的限量要求。目前，國內(nèi)關(guān)于豆芽生產(chǎn)、衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中尚無尿素檢測(cè)方法，其他物質(zhì)中尿素含量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有《河北省地方標(biāo)準(zhǔn)乳及乳制品中尿素氮的測(cè)定分光光度法》(DB13/T1111-2009)、《出口蘑菇罐頭中尿素殘留量檢驗(yàn)方法》(SN/T 1004-2001)、《游泳水中尿素測(cè)定方法》(GB/T 18204. 29-2000)，主要包括二乙酰一肟比色、對(duì)二甲氨基苯甲醛比色法，利用這些物質(zhì)與尿素產(chǎn)生顏色反應(yīng)，在一定波長條件下測(cè)定吸光度，從而定量檢測(cè)尿素含量。安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)《化妝品中尿素的測(cè)定高效液相色譜法》(DB34/T1330-2011)，用乙腈+水溶解化妝品中的尿素，以乙腈+水為流動(dòng)相，使用C18色譜柱分離，二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。國內(nèi)外文獻(xiàn)中尿素檢測(cè)方法有兩類第一類是化學(xué)分析法，主要包括二乙酰一肟比色法、對(duì)二甲氨基苯甲醛比色法、鄰苯二甲醛比色法、丁二酮肟比色法、苯酚次氯酸鹽比色法、酶解納氏比色法等，此類文獻(xiàn)原理基本類似尿素與某些物質(zhì)發(fā)生顏色反應(yīng)，在一定波長條件下檢測(cè)含量。此法應(yīng)用于豆芽中尿素的測(cè)定，由于豆芽基質(zhì)有淺黃色，對(duì)比色結(jié)果干擾較大，容易造成假陽性。第二類是液相色譜法，此類方法又分為兩種，一種是用某些溶劑直接提取樣品(黃酒、土壤等)中的尿素，采用C18柱分離，二極管陣列檢測(cè)器在190-205nm紫外光區(qū)域檢測(cè)尿素含量，此種方法在測(cè)定豆芽中尿素時(shí)，豆芽基質(zhì)也容易造成影響，雜質(zhì)峰對(duì)目標(biāo)峰有干擾；另一種是利用某些特定物質(zhì)(主要是9-羥基咕噸)對(duì)尿素進(jìn)行衍生，產(chǎn)生具有熒光的物質(zhì)，從而利用液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè)樣品(紅酒、人體尿液、黃酒等)中尿素的 含量。(Shona Clark, et al. Determination of urea using high-performance liquidchromatography with fluorescence detection after automated derivatisation withxanthydrol. Journal of Chromatography A, 2007 (1161) :207213 ;刑江濤等.高效液相色譜-熒光檢測(cè)器法測(cè)定黃酒中尿素含量.釀酒科技，2011，3 (201) =104-106.本方法采用9-羥基咕噸衍生，液相色譜檢測(cè)尿素含量的方法，應(yīng)用于豆芽中尿素測(cè)定時(shí)，前處理方法加以改進(jìn)，結(jié)合豆芽基質(zhì)的特殊性質(zhì)，利用無水乙醇提取尿素，并沉淀豆芽中的蛋白質(zhì)，基質(zhì)影響明顯降低。對(duì)上述兩個(gè)公開文獻(xiàn)中衍生試劑的配制溶劑正丙醇改進(jìn)為無水乙醇，且改進(jìn)了衍生試劑的添加比例，明顯降低了衍生試劑的用量。本發(fā)明豆芽中尿素的測(cè)定方法，具有雜質(zhì)干擾小、準(zhǔn)確度高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，為豆芽產(chǎn)品的監(jiān)管提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于選擇合適的有機(jī)溶劑提取豆芽中的尿素，同時(shí)沉淀蛋白，降低豆芽基質(zhì)干擾，同時(shí)優(yōu)化衍生試劑的添加比例。本發(fā)明所述的的技術(shù)問題可通過以下技術(shù)方案得以解決(I)準(zhǔn)確稱取l-5g粉碎后的豆芽樣品于50mL離心管中，加入10_20mL無水乙醇，震蕩提取20-30min ；(2)提取液在6000-8000r/min條件下離心3_5min,取上清液過0. 45 μ m微孔濾
膜，濾液待測(cè)；(3)取上述濾液0. 5-1. OmL，加入0. 02mol/L 9_羥基咕噸衍生劑50-100 μ L，I. 5mol/L鹽酸50-100 μ L，使得衍生反應(yīng)比例范圍為豆芽提取液0. 02mol/L 9-羥基咕噸1.5mol/L鹽酸=5 : I : I至10 : I : 1，室溫條件下避光反應(yīng)20_30min ;(4)衍生后的樣液采用高效液相色譜法分離檢測(cè)，以碳十八烷基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱分離，熒光檢測(cè)器(激發(fā)波長213nm，發(fā)射波長308nm)檢測(cè)，外標(biāo)法定量，計(jì)算豆芽中尿素的殘留量。本發(fā)明的有益效果在于，建立了一種豆芽中尿素殘留量的測(cè)定方法，采用無水乙醇提取豆芽中的尿素，同時(shí)沉淀蛋白，降低基質(zhì)干擾、優(yōu)化了衍生試劑的添加比例，明顯降低了衍生試劑的用量。方法具有基質(zhì)干擾小、準(zhǔn)確度高、檢出限低等特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不局限于具體實(shí)施例。
實(shí)施例I某市售散裝黃豆芽中尿素殘留量的測(cè)定I、分析步驟稱取粉碎后豆芽試樣2. OOg (精確到O. OOlg)于50mL離心管中，加IOmL無水乙醇振蕩提取30min，8000r/min離心5min，上清液經(jīng)O. 45 μ m有機(jī)濾膜過濾后，濾液待測(cè)。移取濾液O. 5mL于I. 5mL進(jìn)樣瓶中，加入100 μ L O. 02mol/L 9-羥基咕噸和100 μ L I. 5mol/L鹽酸溶液，避光衍生反應(yīng)20min，待測(cè)。2、高效液相色譜條件儀器:Agilentl200液相色譜儀配有熒光檢測(cè)器；色譜柱以碳十八烷基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱(4. 6 X 150mm，5 μ m);流動(dòng)相乙腈+0. 02mol/L乙酸鈉溶液(梯度洗脫，程序見表I);流速1.0mL/min ;進(jìn)樣量10yL ;柱溫35°C ;激發(fā)波長213nm，發(fā)射波長308nm。·表I液相色譜梯度洗脫條件
權(quán)利要求
1.一種高效液相色譜法測(cè)定豆芽中尿素殘留量的檢測(cè)方法，其特征包括如下步驟 (1)樣品加入有機(jī)溶劑，震蕩提取試樣中的尿素同時(shí)沉淀蛋白質(zhì)； (2)提取液經(jīng)離心處理后，取上清液過微孔濾膜；(3)濾液加入O.02mol/L 9-羥基咕噸衍生劑，加入I. 5mol/L鹽酸，在酸性條件下衍生； (4)衍生后的樣液經(jīng)高效液相色譜分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量，計(jì)算豆芽中尿素的殘留量。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的方法，其特征在于，所用的提取豆芽中尿素和沉淀蛋白的有機(jī)溶劑為無水乙醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的方法，其特征在于，所用的O.02mol/L9-羥基咕噸衍生劑采用無水乙醇為溶劑配制。
4.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的方法，其特征在于，衍生反應(yīng)比例范圍為豆芽提取液0.02mol/L 9-羥基咕噸I. 5mol/L 鹽酸為 5 : I : I 至 10 : I : I。
全文摘要
本方法公開了一種高效液相色譜法測(cè)定豆芽中尿素殘留量的檢測(cè)方法，包括以下步驟利用無水乙醇振蕩提取豆芽中的尿素，同時(shí)沉淀蛋白，提取液經(jīng)離心后，采用9-羥基呫噸作衍生劑，在酸性條件下衍生，衍生產(chǎn)物經(jīng)碳十八烷基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。本方法具有定性準(zhǔn)確、避免假陽性、定量快速等特點(diǎn)，適合于豆芽中尿素殘留量的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102928530SQ201210388780
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者宋薇 申請(qǐng)人:譜尼測(cè)試科技股份有限公司