專(zhuān)利名稱(chēng)：廣東涼茶顆粒電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種廣東涼茶顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)和來(lái)源區(qū)分方法，具體涉及廣東涼茶顆粒的直接電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜的構(gòu)建方法和標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
背景技術(shù)：
廣東涼茶是嶺南人民根據(jù)本地的氣候和水土特性，在長(zhǎng)期預(yù)防疾病與保健過(guò)程中以中醫(yī)養(yǎng)生理論為指導(dǎo)，以中草藥為基礎(chǔ)，研制總結(jié)出來(lái)的具有清熱解毒、生津止渴等功效的一類(lèi)植物飲料。廣東涼茶顆粒是著名的廣東涼茶之一，由崗梅、山芝麻、五指柑、淡竹葉、 木蝴蝶、布渣葉、火炭母、金沙藤、廣金錢(qián)草和金櫻根10味藥材組成，具有清熱解毒、祛濕生津、涼血排毒等功效，用于四時(shí)感冒、發(fā)熱喉痛、濕熱積滯、口干尿黃等癥。現(xiàn)已有王老吉廣東涼茶無(wú)糖顆粒、王老吉廣東涼茶含糖顆粒、香雪廣東涼茶含糖顆粒、觀(guān)鶴廣東涼茶含糖顆粒、龍馬廣東涼茶含糖顆粒和速永康廣東涼茶含糖顆粒等劑型在市場(chǎng)上銷(xiāo)售。
目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)廣東涼茶顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)和來(lái)源區(qū)分的研究。中藥指紋圖譜技術(shù)是一種表征中藥所含成分與其質(zhì)量關(guān)系的有效手段，已成為國(guó)內(nèi)外廣泛認(rèn)可的重要質(zhì)量評(píng)價(jià)模式。常規(guī)的指紋圖譜方法為色譜法，由于需要很長(zhǎng)的色譜分離時(shí)間，無(wú)法滿(mǎn)足快速和高通量的要求。直接電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜可在常壓條件下直接進(jìn)行指紋圖譜分析，不需要色譜分離，因此，分析時(shí)間大大縮短，一個(gè)完整的指紋譜圖分析僅僅需要不到30 秒的時(shí)間，滿(mǎn)足了快速分析和高通量的要求。因此，建立廣東涼茶顆粒的快速、高效、高通量直接電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜方法，從整體上全面反映制劑的內(nèi)在質(zhì)量，為其質(zhì)量控制提供一種提供直觀(guān)、簡(jiǎn)便、有效的手段。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為廣東涼茶顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)、來(lái)源區(qū)分和真?zhèn)舞b別提供一種新的快速、可靠、高通量指紋圖譜方法，通過(guò)建立廣東涼茶顆粒電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜的方法， 并由此方法得到廣東涼茶顆粒的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
為達(dá)到本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案用直接電噴霧質(zhì)譜法建立廣東涼茶顆粒電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜的方法，具體包括如下步驟
(I)供試品溶液的制備精密稱(chēng)取廣東涼茶顆粒I 20g，50% 100%甲醇萃取，采用索氏萃取或超聲萃取或微波輔助萃取或加速溶劑萃取方法進(jìn)行萃取，萃取時(shí)間為 10 120min，萃取液濃縮定容至5 50mL，針孔式微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液；
(2)質(zhì)譜條件采用電噴霧質(zhì)譜直接檢測(cè)，便攜式蠕動(dòng)泵直接進(jìn)樣，流速10 100 μ L/min,或高效液相色譜不經(jīng)過(guò)色譜柱分離進(jìn)樣,流速100 500 μ L/min ;離子源采用電噴霧離子源；質(zhì)譜質(zhì)量分析器采用飛行時(shí)間或四級(jí)桿或離子阱或靜電場(chǎng)軌道阱或傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)量分析器；譜圖采用全掃描模式記錄質(zhì)譜的輪廓圖，掃描質(zhì)量范圍m/ z 100 1000 ；
(3)測(cè)定取供試品溶液注入質(zhì)譜儀，進(jìn)樣量I 100 μ L，按照直接電噴霧質(zhì)譜法測(cè)定，記錄質(zhì)譜圖，得到指紋圖譜；
(4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜供試品指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) 2004Α版》，均值法計(jì)算生成標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
(5)主成分分析供試品指紋圖譜采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行主成分分析，進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)和來(lái)源區(qū)分。
本發(fā)明最佳的檢測(cè)方法可以通過(guò)下述步驟實(shí)施(I)供試品溶液的制備稱(chēng)取廣東涼茶顆粒5. Og,加入甲醇50mL,超聲萃取30min,萃取液旋轉(zhuǎn)蒸懼濃縮至近干,加入5mL甲醇溶解，搖勻，針孔式微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液；(2)質(zhì)譜條件50 μ L/min流速便攜式蠕動(dòng)泵直接進(jìn)樣，或流速200 μ L/min高效液相色譜不經(jīng)過(guò)色譜柱分離進(jìn)樣，電噴霧離子源，飛行時(shí)間質(zhì)量分析器，全掃描模式記錄質(zhì)譜的輪廓圖，掃描質(zhì)量范圍m/z 100 1000 ；(3)測(cè)定取供試品溶液注入質(zhì)譜儀，進(jìn)樣量5yL，按照直接電噴霧質(zhì)譜法測(cè)定，記錄質(zhì)譜圖，得到指紋圖譜；(4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜供試品指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》，均值法計(jì)算生成標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；(5)主成分分析供試品指紋圖譜采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行主成分分析，進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)和來(lái)源區(qū)分。
按照本發(fā)明所提供指紋圖譜的建立方法所得廣東涼茶顆粒的指紋圖譜中有61個(gè)特征離子共有峰，其中特征離子m/z 133為蘋(píng)果酸、m/z 191為奎尼酸、m/z 191為葡萄糖酸、m/z 353為綠原酸、m/z 515為異綠原酸。
本發(fā)明的原理是根據(jù)廣東涼茶顆粒中主要的活性成分是藥材崗梅、山芝麻、五指柑、淡竹葉、木蝴蝶、布渣葉、火炭母、金沙藤、廣金錢(qián)草和金櫻根的提取物，其電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜能從整體面貌上把握廣東涼茶顆粒的質(zhì)量。
本發(fā)明的有益效果如下
(I)按本發(fā)明提供的方法所建立的電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜，能有效的進(jìn)行廣東涼茶顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)和來(lái)源區(qū)分，有利于全面監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量。
(2)指紋圖譜注重各個(gè)構(gòu)成指紋特征峰的前后順序和相互關(guān)系，注重整體面貌特征，既避免了因測(cè)定一、二個(gè)化學(xué)成分而判定廣東涼茶顆粒整體質(zhì)量的片面性，又減少了為質(zhì)量達(dá)標(biāo)而人為處理的可能性。
(3)本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)型好等優(yōu)點(diǎn)。
(4)該方法可快速、準(zhǔn)確地鑒別產(chǎn)品的真?zhèn)蝺?yōu)劣，為廣東涼茶顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)和來(lái)源區(qū)分提供技術(shù)依據(jù)。


圖1、6種不同來(lái)源的廣東涼茶顆粒的電噴霧質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜.(A)王老吉無(wú)糖廣東涼茶顆粒；(B)王老吉有糖廣東涼茶顆粒；(C)香雪有糖廣東涼茶顆粒；(D觀(guān)鶴有糖廣東涼茶顆粒；(E)龍馬有糖廣東涼茶顆粒；(F)速永康有糖廣東涼茶顆粒.
圖2、6種不同來(lái)源的廣東涼茶顆粒電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜的主成分分析(PCA) 圖.㈧二維PCA得分圖；⑶三維PCA得分圖；(C) 二維PCA載荷圖；⑶三維PCA載荷圖.
下面通過(guò)實(shí)施例及其附圖詳細(xì)闡述本發(fā)明的技術(shù)方案，所列舉的實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明并沒(méi)有限制。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I.廣東涼茶顆粒電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜的建立
I儀器與試劑
I. I儀器Agilent 6210飛行試劑質(zhì)譜儀，MassHunter質(zhì)譜工作站。
I. 2試劑蘋(píng)果酸、奎尼酸、葡萄糖酸、綠原酸和異綠原酸對(duì)照品；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、二次重蒸水。
2.實(shí)驗(yàn)部分
2. I質(zhì)譜條件便攜式蠕動(dòng)泵直接進(jìn)樣，流速50 μ L/min ；電噴霧離子源；電噴霧電壓5000V ;輔助噴霧氮?dú)鈮毫?5psi ;干燥氮?dú)鉁囟?50°C ;干燥氮?dú)饬魉?L mirT1 ； fragmentor電壓100V ;錐孔電壓65V ;八級(jí)桿射頻電壓250V ;全掃描模式記錄質(zhì)譜輪廓圖， 掃描質(zhì)量范圍m/z 100 1000。
2. 2對(duì)照品溶液的制備
A.蘋(píng)果酸對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取蘋(píng)果酸對(duì)照品5. Omg,甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至 25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，針孔式微孔濾膜過(guò)濾，即得。
B.奎尼酸對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取奎尼酸對(duì)照品5. Omg,甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至 25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，針孔式微孔濾膜過(guò)濾，即得。
C.葡萄糖酸對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取葡萄糖酸對(duì)照品5. Omg,甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，針孔式微孔濾膜過(guò)濾，即得。
D.綠原酸對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品5. Omg,甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至 25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，針孔式微孔濾膜過(guò)濾，即得。
E.異綠原酸對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取異綠原酸對(duì)照品5. Omg,甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至25mL棕色量瓶中，甲醇加至刻度，針孔式微孔濾膜過(guò)濾，即得。
F.混合對(duì)照品溶液的制備分別吸取I. OOmL蘋(píng)果酸、奎尼酸、綠原酸和異綠原酸對(duì)照品溶液，組成混合對(duì)照品溶液。
2. 3供試品溶液的制備
精密稱(chēng)取廣東涼茶顆粒5. 0g，置于150mL的具塞錐形瓶中，加入甲醇50mL，超聲萃取30min，萃取液旋轉(zhuǎn)蒸餾濃縮至近干，少量甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至5mL的容量瓶中，甲醇加至刻度，針孔式微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。
2. 4測(cè)定吸取供試品溶液與對(duì)照品溶液，注入飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，按照直接電噴霧質(zhì)譜法測(cè)定，所得指紋圖譜與圖I相似。
實(shí)施例2. 6種不同來(lái)源廣東涼茶顆粒的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜
取王老吉無(wú)糖廣東涼茶顆粒15批次、王老吉含糖廣東涼茶顆粒12批次、香雪含糖廣東涼茶顆粒8批次、觀(guān)鶴含糖廣東涼茶顆粒6批次、龍馬含糖廣東涼茶顆粒2批次和速永康含糖廣東涼茶顆粒2批次，按實(shí)施例I條件進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次，將三次測(cè)定所得譜圖的平均值以ASCII碼格式導(dǎo)出為.csv文件，然后通過(guò)軟件轉(zhuǎn)化為.txt文件，導(dǎo)入中國(guó)藥典委員會(huì)推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》，采用均值法計(jì)算生成每種來(lái)源廣東涼茶顆粒的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，見(jiàn)附圖I。
實(shí)施例3.通過(guò)對(duì)指紋圖譜進(jìn)行主成分分析進(jìn)行廣東涼茶顆粒的來(lái)源區(qū)分
取王老吉無(wú)糖廣東涼茶顆粒15批次、王老吉含糖廣東涼茶顆粒12批次、香雪含糖廣東涼茶顆粒8批次、觀(guān)鶴含糖廣東涼茶顆粒6批次、龍馬含糖廣東涼茶顆粒2批次和速永康含糖廣東涼茶顆粒2批次，按實(shí)施例I條件進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次，將三次測(cè)定所得譜圖的平均值以ASCII碼格式導(dǎo)出為.csv文件，然后采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)，進(jìn)行來(lái)源區(qū)分的化學(xué)標(biāo)識(shí)離子可很好的在PCA得分圖中表示出來(lái)，而6種不同來(lái)源的廣東涼茶顆粒則可通過(guò)PCA載荷圖進(jìn)行很好的來(lái)源區(qū)分，PCA得分圖和載荷圖見(jiàn)附圖2。
權(quán)利要求
1.一種廣東涼茶顆粒電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜的建立方法，其特征在于采用電噴霧質(zhì)譜直接構(gòu)建基于活性成分的指紋圖譜，具體包括如下步驟(1)供試品溶液的制備精密稱(chēng)取廣東涼茶顆粒，50% 100%甲醇萃取，萃取液濃縮定容后，針孔式微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液；(2)質(zhì)譜條件電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)，全掃描模式記錄質(zhì)譜的輪廓圖，掃描質(zhì)量范圍m/z 100 1000 ；(3)測(cè)定取供試品溶液注入質(zhì)譜儀，按照直接電噴霧質(zhì)譜法測(cè)定，記錄質(zhì)譜圖，得到指紋圖譜；(4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜供試品指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A 版》，計(jì)算生成標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。(5)主成分分析供試品指紋圖譜采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行主成分分析，進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)和來(lái)源區(qū)分。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的廣東涼茶顆粒電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述步驟(I)供試品溶液的制備，精密稱(chēng)取廣東涼茶顆粒I 20g，采用索氏萃取或超聲萃取或微波輔助萃取或加速溶劑萃取方法進(jìn)行萃取，萃取時(shí)間為10 120min,萃取液濃縮定容至5 50mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的廣東涼茶顆粒電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述步驟(2)質(zhì)譜進(jìn)樣方式采用10 100 μ L/min流速便攜式螺動(dòng)泵直接進(jìn)樣或100 500 μ L/min流速高效液相色譜不經(jīng)過(guò)色譜柱分離進(jìn)樣，質(zhì)譜離子源采用電噴霧離子源，質(zhì)譜質(zhì)量分析器采用飛行時(shí)間或四級(jí)桿或離子阱或靜電場(chǎng)軌道阱或傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)量分析器，譜圖采用全掃描模式記錄質(zhì)譜的輪廓圖，掃描質(zhì)量范圍m/z 100 1000。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的廣東涼茶顆粒指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述步驟(3)測(cè)定將供試品溶液I IOOOyL注入質(zhì)譜儀，按照直接電噴霧質(zhì)譜法測(cè)定，得到指紋圖譜。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的廣東涼茶顆粒電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜的建立方法，其特征是在于所述步驟(4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜供試品指紋圖譜在質(zhì)量范圍m/z 100 1000采用均值法計(jì)算生成標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中有61個(gè)特征離子共有峰，其中特征離子m/z 133為蘋(píng)果酸、m/z 191為奎尼酸、m/z 195為葡萄糖酸、m/z 353為綠原酸、m/z 515為異綠原酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的廣東涼茶顆粒電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述步驟(5)主成分分析采用具有主成分分析功能的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行主成分分析，根據(jù)主成分分析結(jié)果的載荷圖進(jìn)行廣東涼茶顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)和來(lái)源區(qū)分。
全文摘要
廣東涼茶顆粒電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜的建立方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，涉及中藥制劑的質(zhì)量控制方法，具體是建立電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜以實(shí)現(xiàn)廣東涼茶顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)和來(lái)源區(qū)分的方法。方法包括(1)供試品溶液的配制；(2)質(zhì)譜條件電噴霧質(zhì)譜直接檢測(cè)，全掃描模式記錄質(zhì)譜輪廓圖，掃描質(zhì)量范圍m/z 100～1000；(3)測(cè)定直接電噴霧質(zhì)譜法得指紋圖譜；(4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜供試品指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》，均值法計(jì)算，生成標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；(5)主成分分析供試品指紋圖譜采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行主成分分析，進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)和來(lái)源區(qū)分。本發(fā)明的有益效果快速、高效、可靠的表征了廣東涼茶顆粒的質(zhì)量，有利于產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控；具有方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、靈敏度高、重復(fù)性好、滿(mǎn)足高通量分析的要求；可快速準(zhǔn)確地鑒別產(chǎn)品的真?zhèn)蝺?yōu)劣。
文檔編號(hào)G01N1/34GK102914587SQ201210389868
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者楊運(yùn)云, 鄧潔薇, 張中強(qiáng), 宋化燦, 范春林 申請(qǐng)人:中國(guó)廣州分析測(cè)試中心