專利名稱：煙草及煙草制品中三種苯氧羧酸類農(nóng)藥殘留量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于煙草及煙草制品中農(nóng)藥殘留的理化檢驗技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及煙草及煙草制品中2，4-滴，2，4，5-涕和麥草畏等三種氯苯氧羧酸類農(nóng)藥殘留量的測定技術(shù)。
背景技術(shù)：
煙草作為吸食品，其農(nóng)藥殘留量問題已成為吸煙安全性問題中的重要組成部分，煙草及煙草制品農(nóng)藥殘留量指標(biāo)是各國在煙草制品質(zhì)量控制中的重要內(nèi)容，已成為國際市場煙葉評價和選購的重要因素，也是煙草國際貿(mào)易中進(jìn)行商品檢驗的重要內(nèi)容。苯氧乙酸類物質(zhì)是最早研制出來并投入使用的除草劑。由于其價格低廉、除草速度較快、除草譜較寬等優(yōu)點，在生產(chǎn)中一直發(fā)揮重要作用，廣泛用于小麥、玉米和水稻田防除闊葉雜草。然而，該類除草劑對作物的安全性受環(huán)境條件、作物生育期的影響較大，應(yīng)用不當(dāng)可能會產(chǎn)生較重 的藥害；同時，該類除草劑對闊葉作物敏感、飄移和揮發(fā)性強(qiáng)，易于對周圍闊葉作物發(fā)生藥害。在使用過程中，發(fā)現(xiàn)對人、畜有一定的內(nèi)分泌擾亂作用，隨著該類除草劑使用量及使用范圍的日益增大，其在作物中的殘留及對人類健康和環(huán)境造成的危害也越來越為人們所關(guān)注。研究和發(fā)展針對這類農(nóng)藥殘留物的檢測技術(shù)，是國際上關(guān)注的課題。我國和其他各國都制定了嚴(yán)格的殘留限量，如日本規(guī)定2，4，5-涕不得檢出，國際食品法典委員會，日本等制定的2，4-滴在大多農(nóng)產(chǎn)品中的限量為O. 05 mg/kg ο C0RESTA農(nóng)用化學(xué)品咨詢委員會(ACAC)在2008年制定的118種農(nóng)用化學(xué)品指導(dǎo)性殘留限量表中將麥草畏、2，4-滴和2，4，5-涕等有機(jī)氯除草劑農(nóng)藥的限量分別定為O. 20 mg/kg, O. 20 mg/kg和O. 05 mg/kg,目前我國煙草行業(yè)還沒有制定煙草有機(jī)氯除草劑殘留的限量標(biāo)準(zhǔn)。由于此類化合物極性較大、穩(wěn)定性差、不易氣化，需用重氮甲烷或三氟化硼丁醇衍生后才能用氣相色譜或氣質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行測定。YC/T 181-200中華人民共和國煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 181 一 2004煙草及煙草制品有機(jī)氯除草劑農(nóng)藥殘留量的測定氣相色譜法規(guī)定了煙草及煙草制品中2，4-滴，2，4，5-涕和麥草畏等3種氯苯氧羧酸類農(nóng)藥的測定方法，為該類農(nóng)藥殘留量的檢測提供了分析依據(jù)，但該法是經(jīng)過衍生化后用氣相色譜法測定。衍生化試劑重氮甲烷和三氟化硼丁醇毒性較強(qiáng)，且整個操作步驟較繁瑣、分析成本較高、單個樣品的檢測周期較長。未見煙草中此類農(nóng)藥檢測的其它文獻(xiàn)報道。關(guān)于對于土壤、水、大米、水稻和紡織品中苯氧羧酸類殘留測定的報道較多，而且苯氧羧酸類除草劑多殘留分析的報道多采用氣相色譜或氣質(zhì)聯(lián)用測定。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定煙草中的苯氧乙酸類除草劑未見報道。本實驗采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對煙草中3種苯氧羧酸類除草劑殘留進(jìn)行分析，并對樣品提取和分離等條件進(jìn)行了研究，建立了測定煙草中3種苯氧羧酸類除草劑多殘留的分析方法，方法簡便、快速、凈化效果較好，各項技術(shù)指標(biāo)均符合殘留檢測的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種采用基質(zhì)分散固相萃取煙草及煙草制品中農(nóng)藥殘留，無需衍生化等繁瑣過程，直接以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定煙草及煙草制品中2，4-滴，2，4，5-涕和麥草畏等三種苯氧羧酸類農(nóng)藥殘留量的測定方法，該方法能快速、準(zhǔn)確檢測煙草及煙草制品中三種苯氧羧酸類農(nóng)藥殘留量，測定結(jié)果準(zhǔn)確、測定干擾少。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
一種煙草及煙草制品中三種苯氧羧酸類農(nóng)藥殘留量的測定方法，用乙腈對樣品進(jìn)行浸提，再加入無水硫酸鎂和氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸二氫鈉振蕩促使其分層，隨后進(jìn)行分散固相萃取，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜直接測定煙草及煙草制品中2，4-滴，2，4，5-涕和麥草畏農(nóng)藥殘留量。具體步驟如下
a、樣品的提取準(zhǔn)確稱取2g樣品(精確至O. 01 g)于50 mL具蓋離心管中，加入10 mL水，振蕩直至樣品被水充分浸潤；靜置10 min后移取10 mL乙腈至離心管中，加入200 μ L乙酸，然后將離心管置于渦漩混合振蕩儀上，以2000 rpm速率振蕩I min ;將離心管置于_18°C條件下保持10 min，然后向離心管中加入4 g無水硫酸鎂和I g氯化鈉，I g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸二氫鈉，立即于漩渦混合振蕩儀上，以2000 rpm速率振蕩2 min，然后以4000rpm速率離心10 min ；
b、樣品凈化移取上清液I.O mL于I. 5 mL離心管中，加入150 mg無水硫酸鎂及25mg PSA吸附劑，于漩渦混合振蕩儀上以2000 rpm速率振蕩2 min，以6000 rpm速率離心2min ;吸取上清液經(jīng)O. 45 μ m有機(jī)相濾膜過濾，移取200 μ L，加入800 μ L乙腈，用LC-MS/MS檢測；
C、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備分別稱取O. Olg三種農(nóng)藥(2，4-滴，2，4，5-涕和麥草畏)標(biāo)準(zhǔn)品到不同的IOmL容量瓶中，用乙腈稀釋并最終配制成具有濃度梯度的各種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液200 μ L和200 μ L空白樣品提取溶液，然后加入600 μ L乙腈，配制成基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；
d、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定吸取以上配制好的不同濃度的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；
e、農(nóng)藥殘留量測定結(jié)果的計算
以外標(biāo)法進(jìn)行農(nóng)藥殘留量的定量分析，即以農(nóng)藥的色譜峰面積與對其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)大于等于O. 999，對提取后的樣品進(jìn)行測定，測得檢出農(nóng)藥的色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣品中的2，4-滴，2，4，5-涕和麥草畏等農(nóng)藥的殘留量。所述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制方式如下分別稱取O. 01 g 2，4-滴、2，4，5_涕和麥草畏三種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品至不同的10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，制得1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；分別移取以上三種農(nóng)藥單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液I. O mL于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度；配得混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(IOyg /mL);分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液25 μ L，50 μ L,100 μ L，250 μ L , 500μ L及ΙΟΟΟμ L到6個10 mL容量瓶中，用乙腈定容；各標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度分別為 O. 025μ g/mL, O. 05 μ g/mL, 0. I μ g/mL, 0. 25 μ g/mL, 0. 5 μ g/mL,Ι.Ομ g/mL ;分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液200 μ L和200 μ L空白樣品提取溶液混合，并加入600 μ L 乙腈；各溶液濃度分別為 O. 005 μ g/mL, O. 01 μ g/mL, 0. 02 μ g/mL, 0. 05 μ g/mL,
0.I μ g/mL, 0. 2 μ g/mL。采用的液相色譜條件為色譜柱Atiantis dC18 (150 mmX2. I mm, 3 um,美國Waters公司);流動相流動相A為乙腈，流動相B為水(含O. I %甲酸)，等度洗脫，流動相A和流動相B比例為50 50，流速0. 3 mL/min ;柱溫30 V ;進(jìn)樣量5 μ L ;采用的質(zhì)譜條件掃描方式負(fù)離子掃描；電噴霧離子源(ESI);霧化氣流量為60 psi ;氣簾氣流量18 psi;輔助加熱氣流量為60 psi;離子化溫度500 V ;碰撞氣流量為10 psi; 4種氣體均為氮氣；停留時間為100 msec;電離電壓5500 V,負(fù)離子MRM模式采集。MRM參數(shù)見表I。表I質(zhì)譜條件
化細(xì)離子對神)去簇植 msmm
CWC￥1
2,4~mr2S5iVI97伊-30-14
253 JOTSS-O-30-14
Zj 4,5-嫌221J/162JT-HS-15
219J/ld 840-15
老草畏218則74_S*35-7JS
-3575
*定星1 子
本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有技術(shù)樣品處理方法的不足，針對煙草樣品優(yōu)化了樣品前處理方法和儀器檢測條件，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)良效果
⑴本發(fā)明方法樣品前處理過程簡單，大大縮短了每個煙草樣品的萃取前處理時間。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《YC/T 181-2004煙草及煙草制品有機(jī)氯除草劑農(nóng)藥殘留量的測定氣相色譜法》，該標(biāo)準(zhǔn)方法采用二氯甲烷萃取，以三甲基親氧化硫溶液甲酯衍生化，氣相色譜-質(zhì)譜測定，其前處理過程復(fù)雜費時，不利于高通量樣品快速檢測。本發(fā)明方法將煙末用乙腈進(jìn)行浸提，再加無水硫酸鎂、氯化鈉等促使其分層，最后取萃取液進(jìn)行分散固相萃取。該方法提高萃取效率，又能對煙草中的色素及煙草植物組織的其他共萃物(脂肪酸、葉綠素等)起到較好的吸附凈化作用，避免了樣品濃縮、凈化、衍生 等過程造成的待測農(nóng)藥組分損失，又使實驗操作更加簡單、快捷。⑵行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《YC/T 181-2004煙草及煙草制品有機(jī)氯除草劑農(nóng)藥殘留量的測定氣相色譜法》使用的衍生化試劑對人體健康有害，從而限制了它們的使用；本發(fā)明無需衍生化從而使前處理過程變得比較簡單。(3)本發(fā)明方法具有操作準(zhǔn)確、靈敏度高及重復(fù)性好的優(yōu)點。① 本發(fā)明方法的檢測限
將不同濃度的2，4-滴，2，4，5-涕和麥草畏農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入LC-MS/MS，以3倍信噪比(S/N = 3)計算檢測限(L0D)，檢測限在O. 007 μ g/g-0. 02 μ g/g之間。② 本發(fā)明方法的重復(fù)性和加標(biāo)回收率
在煙草樣品中加入2，4-滴，2，4，5-涕和麥草畏農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后進(jìn)行前處理和LC - MS/MS分析，并按照加標(biāo)量和測定值計算其回收率，結(jié)果見表2。由表2可以看出，三種農(nóng)藥的回收率在95 % — 110. O %之間，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD )小于8%，說明本發(fā)明方法的回收率高，重復(fù)性好。
權(quán)利要求
1.一種煙草及煙草制品中三種苯氧羧酸類農(nóng)藥殘留量的測定方法，其特征在于用乙腈對樣品進(jìn)行浸提，再加入無水硫酸鎂與氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸二氫鈉振蕩促使其分層，隨后進(jìn)行分散固相萃取，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜直接測定煙草及煙草制品中2，4-滴，2，4, 5-涕和麥草畏農(nóng)藥殘留量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的煙草及煙草制品中三種苯氧羧酸類農(nóng)藥殘留量的測定方法，其特征在于該測定方法具體步驟如下 a、樣品的提取準(zhǔn)確稱取2g樣品于50 mL具蓋離心管中，加入10 mL水，振蕩直至樣品被水充分浸潤；靜置10 min后移取10 mL乙腈至離心管中，加入200 μ L乙酸，然后將離心管置于渦漩混合振蕩儀上，以2000 rpm速率振蕩I min ;將離心管置于-18 1條件下保持10 min,然后向離心管中加入4 g無水硫酸鎂和I g氯化鈉，I g朽1檬酸鈉和O. 5 g朽1檬酸二氫鈉，立即于漩渦混合振蕩儀上，以2000 rpm速率振蕩2 min，然后以4000 rpm速率離心 10 min ； b、樣品凈化移取上清液I.O mL于I. 5 mL離心管中，加入150 mg無水硫酸鎂及25 mg PSA吸附劑，于漩渦混合振蕩儀上以2000 rpm速率振蕩2 min，以6000 rpm速率離心2min ;吸取上清液經(jīng)O. 45 μ Lm有機(jī)相濾膜過濾，移取200 μ L，加入800 μ L乙腈，用LC-MS/MS檢測； C、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備分別稱取O. Olg 2，4-滴，2，4，5-涕和麥草畏標(biāo)準(zhǔn)品到不同的IOmL容量瓶中，用乙腈稀釋并最終配制成具有濃度梯度的各種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液200 μ L和200 μ L空白樣品提取溶液，然后加入600 μ L乙腈，配制成基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液； d、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定吸取以上配制好的不同濃度的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀； e、農(nóng)藥殘留量測定結(jié)果的計算 以外標(biāo)法進(jìn)行農(nóng)藥殘留量的定量分析，即以農(nóng)藥的色譜峰面積與對其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)大于等于O. 999，對提取后的樣品進(jìn)行測定，測得檢出農(nóng)藥的色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得樣品中的2，4-滴，2，4，5-涕和麥草畏等農(nóng)藥的殘留量。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的煙草及煙草制品中三種苯氧羧酸類農(nóng)藥殘留量的測定方法，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制方式如下分別稱取O. 01 g 2，4-滴、2，4，5-涕和麥草畏三種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品至不同的10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，制得I. O mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；分別移取以上三種農(nóng)藥單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液I. O mL于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度；配得混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(10 Ug /mL);分別移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液25 μ L，50 μ L,100 μ L，250 μ L , 500yL及1000 μ L到6個10 mL容量瓶中，用乙腈定容；各標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度分別為 O. 025 μ g/mL, O. 05 μ g/mL, 0. I μ g/mL, 0. 25 μ g/mL, 0. 5 μ g/mL,1.0yg/mL ;分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液200 μ L和200 μ L空白樣品提取溶液混合，并加入600 μ L 乙腈；各溶液濃度分別為 O. 005 μ g/mL, O. 01 μ g/mL, 0. 02 μ g/mL, 0. 05 μ g/mL,0.I μ g/mL, 0. 2 μ g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的煙草及煙草制品中三種苯氧羧酸類農(nóng)藥殘留量的測定方法，其特征在于采用的液相色譜條件為色譜柱Atiantis dC18 (150 mmX2. I mm, 3 um,美國Waters公司);流動相A為乙腈，流動相B為水(含O. I %甲酸)，等度洗脫，流動相A和流動相B比例為50 50，流速:0. 3 mL/min ;柱溫30 °C;進(jìn)樣量:5 μ L ;采用的質(zhì)譜條件掃描方式負(fù)離子掃描；電噴霧離子源(ESI);霧化氣流量為60 psi ;氣簾氣流量18 psi ;輔助加熱氣流量為60 psi;離子化溫度500 V ;碰撞氣流量為 10 psi; 4種氣體均為氮氣；停留時間為100 msec;電離電壓5500 V,負(fù)離子MRM模式采集。
全文摘要
一種煙草及煙草制品中三種苯氧羧酸類農(nóng)藥殘留量的測定方法，其特征在于用乙腈對樣品進(jìn)行浸提，再加入無水硫酸鎂與氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸二氫鈉振蕩促使其分層，隨后進(jìn)行分散固相萃取，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜直接測定煙草及煙草制品中2,4-滴，2,4,5-涕和麥草畏農(nóng)藥殘留量。本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有技術(shù)樣品處理方法的不足，針對煙草樣品優(yōu)化了樣品前處理方法和儀器檢測條件，與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明方法具有如下優(yōu)良效果本發(fā)明方法樣品前處理過程簡單、快速，無需衍生化，并具有操作準(zhǔn)確、靈敏度高及重復(fù)性好的優(yōu)點。
文檔編號G01N30/02GK102854271SQ20121039457
公開日2013年1月2日 申請日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者楊飛, 唐綱嶺, 邊照陽, 范子彥, 李中皓, 張洪非, 李雪, 龐永強(qiáng), 胡清源 申請人:國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心