專利名稱：基于有機染料-量子點復合物的pH比率熒光探針的制法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于檢測技術領域，具體涉及一種基于有機染料-量子點復合物的PH比率熒光探針的制備方法。
背景技術：
pH值的精確測量對于生理學、藥物學、環(huán)境學、生物學、化學等體系的研究具有重要意義，化學反應的進行或完成、細胞和細胞器的許多重要過程都與PH密切相關。現(xiàn)有的PH測定方法主要有電極法、指示劑法和熒光光譜法。電極法一般使用玻璃電極，由于存在電化學的干擾，可能的機械磨損等缺陷而不適用于活體的PH檢測。指示劑法一般使用酚酞、百里酚等PH指示劑，因顯色范圍寬，致使檢測靈敏度和準確度低。熒光光譜法是一種基于光學信號而建立的檢測方法，相比前兩種方法，PH熒光探針具有化學/光穩(wěn)定性好、靈敏度高，選擇性好，響應快、適當?shù)闹苄院退苄?，對細胞毒害作用小，可進行快速、實時、原位 檢測等優(yōu)點，受到很高的重視?，F(xiàn)有的研究中，普遍將單一的有機染料發(fā)展為pH熒光探針，其熒光性質隨pH的變化可用來指示目標介質中酸堿性的改變，但此類PH測定法，易受光漂白、探針分子濃度、探針分子微環(huán)境(如極性、pH、溫度、儀器等)、光化學穩(wěn)定性等因素的影響，進而干擾準確的定性與定量。為了克服以上缺陷，引入了比率熒光法，即加入第二個發(fā)色團以形成雙發(fā)射的熒光探針體系，避免了試劑濃度下的熒光波動和背景熒光的干擾?；诖耍琾H比率熒光探針的研究引起了科研工作者的廣泛興趣。相比有機染料，膠體半導體納米晶(或稱為量子點QDs)具有熒光質量高，激發(fā)光譜寬，發(fā)射光譜尺寸可調，量子產率高和光化學穩(wěn)定性好等優(yōu)點，使QDs熒光探針產生出顯著的靶向信號用于各種物質的定性和定量分析。截至目前，有關PH比率熒光探針的制備方法已有中國專利報道(公開號CN101993693A)，其中涉及了兩種有機染料分子和介孔二氧化硅模板，該探針的合成存在相對復雜、比較耗時、成本較高等問題，進而影響了其實際的應用價值。因此，獲得一種集靈敏度高、方法簡單、價格低廉等優(yōu)點于一體的PH探針體系已成為一項重要的研究課題，這也是亟待解決的關鍵技術問題。迄今為止，尚未見基于半導體量子點的pH比率突光探針，以及基于有機染料-量子點復合物的PH比率熒光探針的相關專利報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術存在的缺陷而提供一種方法簡單，快速、成本低的基于有機染料-量子點復合物的pH比率突光探針的制法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現(xiàn)一種基于有機染料-量子點復合物的pH比率熒光探針的制法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟(I)在N2氣氛，磁力攪拌及堿性水溶液中，氯化鎘、碲氫化納、巰基乙酸三者反應回流3 6小時，制備出巰基乙酸穩(wěn)定的碲化鎘量子點CdTe QDs ；
(2)在室溫和磁力攪拌下，將聚乙烯亞胺PEI水溶液逐滴加入碲化鎘量子點CdTeQDs溶液中，形成陽離子聚電解質聚乙烯亞胺PEI靜電吸附的碲化鎘量子點QDs ；(3)然后逐滴加入異硫氰酸熒光素FITC水溶液，以靜電吸附的方式形成碲化鎘異硫氰酸熒光素復合物(CdTe-FITC復合物)，并將其分散在磷酸緩沖液中(PBS，pH = 6 7)； (4)采用熒光光譜法測定碲化鎘異硫氰酸熒光素復合物中FITC與QDs的特征熒光峰強度比IFITC/IMTe，并擬合其與PH之間的關系，構建出基于該復合物的pH比率熒光探針。步驟(I)中所述的堿性水溶液是用IM的NaOH溶液調節(jié)pH為10 12，碲氫化納、氯化鎘、巰基乙酸三者的摩爾比為I : 2 : 4 I : 10 : 20，碲化鎘量子點最大熒光發(fā)射峰波長為550 600nm。 步驟(2)中所述的聚乙烯亞胺在碲化鎘量子點水溶液中的質量分數(shù)為O. I %。步驟(3)中所述的異硫氰酸突光素最大突光發(fā)射峰波長為520nm,異硫氰酸突光素與陽離子聚電解質聚乙烯亞胺靜電吸附的碲化鎘量子點的摩爾比為I : I 4 : I。步驟(3)中所述的磷酸緩沖液的pH 6 7。步驟(4)中所述的pH范圍為5. 8 8. 7，碲化鎘異硫氰酸熒光素復合物中的特征熒光峰強度比IFITC/IMTe與pH之間的呈線性關系。所述的線性關系可應用于人體細胞膜模擬樣品(脂質體)溶液中pH的比率熒光探測。本發(fā)明的效果是選用CdTe QDs作為主要的熒光源，引入FITC作為輔助(或參比)發(fā)色團，以靜電吸附自組裝的方式形成FITC-CdTe復合物的雙發(fā)射(比率)熒光探針，克服了傳統(tǒng)單強度基探針的熒光信號難以準確獲得的難題。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明方法簡單，快速、成本低，制備產物可對生物樣品和復雜體系中的PH進行準確、靈敏、簡便、快捷的探測，為生物檢測、化學分析等領域的研究提供了一種新的發(fā)展方向。


圖I為基于FITC-CdTe復合物的pH比率熒光探針的制備過程示意圖；圖2為FITC-CdTe復合物溶液隨pH(5. 3 8. 7)演化的熒光發(fā)射光譜，其中的FITC、CdTe QDs摩爾濃度和激發(fā)波長分別為40nM、20nM和470nm ；圖3為采用本發(fā)明比率熒光探針方法(即IFnc/IcdTe或I52Q/I595與PH間的線性關系)測定脂質體溶液(ImM)中的pH，具體為設定的PH1與測定的pH2之間的關系及其線性擬合。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例I基于FITC-CdTe復合物的pH比率熒光探針的制備過程參見圖1，詳細的制備步驟如下首先采用超純水配置巰基乙酸穩(wěn)定的CMTe QDs溶液(50nM),即在N2氣氛,磁力攪拌及堿性水溶液中，氯化鎘、碲氫化納、巰基乙酸三者按摩爾比為I : 2 4混合，并通過IM的NaOH溶液調節(jié)pH為10 12，反應回流3 6小時，制備出巰基乙酸穩(wěn)定的碲化鎘量子點(CdTe QDs)，稱取一定量聚乙烯亞胺(PEI)溶于超純水，質量分數(shù)調節(jié)為1%。然后在室溫與緩慢磁力攪拌下，將PEI溶液逐滴加入QDs溶液中，通過靜電吸附形成PEI改性的QDs，其中的QDs摩爾濃度與PEI質量分數(shù)分別控制為40nM與O. I %。接下來稱取一定量FITC溶于超純水，濃度調節(jié)為80nM，在室溫和緩慢磁力攪拌下，將FITC溶液逐滴加入PEI改性的QDs溶液中，以靜電吸附的方式形成FITC-QDs復合物，其中的QDs與FITC摩爾濃度分別為30nM與60nM。最后采用IOmM磷酸緩沖液(PBS)調節(jié)復合物溶液pH，以獲得一系列具有不同pH的復合物樣品，其中的pH分別調節(jié)為5. 3,5. 9,6. 5,7. 0,7. 4,8. O和8. 7，QDs與FITC摩爾濃度分別為20nM與40nM。采用熒光光譜法測定每個復合物樣品的熒光發(fā)射光譜，所有待測樣品須在暗室孵化十分鐘，以使熒光增強反應達到穩(wěn)定，激發(fā)波長均為470nm，取6次測量的平均值為最終結果，參見圖2。配置一系列脂質體的PBS溶液，其中的脂質體與PBS的摩爾濃度分別設定為ImM與IOmM, pH分別調節(jié)為5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. O和8. 5，然后在室溫與緩慢磁力攪拌下加入等體積的復合物溶液，以形成均質的脂質體-復合物樣品溶液。采用本發(fā)明探針方法(即IFITC/IMTe與PH的線性關系)測定每個樣品的熒光發(fā)射光譜，并對測定的PH與設定的 PH進行擬合，以檢驗本發(fā)明pH比率熒光探針在生物樣品或復雜體系中的實際分析能力，參見圖3。實施例2首先采用超純水配置巰基乙酸穩(wěn)定的CMTe QDs溶液(50nM),即在N2氣氛,磁力攪拌及堿性水溶液中，氯化鎘、碲氫化納、巰基乙酸三者按摩爾比為I : 10 20混合，并通過IM的NaOH溶液調節(jié)pH為IO 12，反應回流3 6小時，制備出巰基乙酸穩(wěn)定的碲化鎘量子點(CdTe QDs)，稱取一定量聚乙烯亞胺(PEI)溶于超純水，質量分數(shù)調節(jié)為1%。然后在室溫與緩慢磁力攪拌下，將PEI溶液逐滴加入QDs溶液中，通過靜電吸附形成PEI改性的QDs，其中的QDs摩爾濃度與PEI質量分數(shù)分別控制為40nM與O. I %。接下來稱取一定量FITC溶于超純水，濃度調節(jié)為80nM，在室溫和緩慢磁力攪拌下，將FITC溶液逐滴加入PEI改性的QDs溶液中，以靜電吸附的方式形成FITC-QDs復合物，其中的QDs與FITC摩爾濃度分別為30nM與60nM。最后采用IOmM磷酸緩沖液(PBS)調節(jié)復合物溶液pH，以獲得一系列具有不同pH的復合物樣品，其中的pH分別調節(jié)為4. 9,5. 3,5. 5,5. 9,6. 0,6. 5,7. 0,7. 4,7. 5,8. O、
8.3,8. 5和8. 7，QDs與FITC摩爾濃度分別為20nM與40nM。所有樣品須在暗室孵化十分鐘，以使熒光增強反應達到穩(wěn)定，然后采用熒光光譜法依次測定每個樣品的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長均為470nm，取6次測量的平均值為最終結果。配置一系列脂質體的PBS溶液，其中的脂質體與PBS的摩爾濃度分別設定為ImM與IOmM, pH分別調節(jié)為5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,8. 5和9. 0，然后在室溫與緩慢磁力攪拌下加入等體積的復合物溶液，以形成均質的脂質體-復合物樣品溶液。采用本發(fā)明探針方法(即IFITC/IMTe與PH的線性關系)測定每個樣品的熒光發(fā)射光譜，并對測定的PH與設定的PH進行擬合，以檢驗本發(fā)明pH比率熒光探針在生物樣品或復雜體系中的實際分析能力。實施例3首先采用超純水配置巰基乙酸穩(wěn)定的CdTe QDs溶液(IOOnM)，稱取一定量聚乙烯亞胺(PEI)溶于超純水，質量分數(shù)調節(jié)為1%。然后在室溫與緩慢磁力攪拌下，將PEI溶液逐滴加入QDs溶液中，通過靜電吸附形成PEI改性的QDs，其中的QDs摩爾濃度與PEI質量分數(shù)分別控制為80nM與O. 1%。接下來稱取一定量FITC溶于超純水，濃度調節(jié)為150nM，在室溫和緩慢磁力攪拌下，將FITC溶液逐滴加入PEI改性的QDs溶液中，以靜電吸附的方式形成FITC-QDs復合物，其中的QDs與FITC摩爾濃度分別為60nM與120nM。最后采用IOmM磷酸緩沖液(PBS)調節(jié)復合物溶液pH，以獲得一系列具有不同pH的復合物樣品，其中的pH分別調節(jié)為5. 3,5. 9,6. 5,7. 0,7. 4,8. O和8. 7，QDs與FITC摩爾濃度分別為40nM與80nM。所有樣品須在暗室孵化十分鐘，以使熒光增強反應達到穩(wěn)定，然后采用熒光光譜法依次測定每個樣品的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長均為470nm，取6次測量的平均值為最終結果。配置一系列脂質體的PBS溶液，其中的脂質體與PBS的摩爾濃度分別設定為2mM與IOmM, pH分別調節(jié)為5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. O和8. 5，然后在室溫與緩慢磁力攪拌下加入等體積的復合物溶液，以形成均質的脂質體-復合物樣品溶液。采用本發(fā)明探針方法(即IFITC/IMTe與PH的線性關系)測定每個樣品的熒光發(fā)射光譜，并對測定的PH與給定的PH進行擬合，以檢驗本發(fā)明pH比率熒光探針在生物樣品或復雜體系中的實際分析能力。實施例4·首先采用超純水配置巰基乙酸穩(wěn)定的CdTe QDs溶液(IOOnM)，稱取一定量聚乙烯亞胺(PEI)溶于超純水，質量分數(shù)調節(jié)為1%。然后在室溫與緩慢磁力攪拌下，將PEI溶液逐滴加入QDs溶液中，通過靜電吸附形成PEI改性的QDs，其中的QDs摩爾濃度與PEI質量分數(shù)分別控制為80nM與O. 1%。接下來稱取一定量FITC溶于超純水，濃度調節(jié)為150nM，在室溫和緩慢磁力攪拌下，將FITC溶液逐滴加入PEI改性的QDs溶液中，以靜電吸附的方式形成FITC-QDs復合物，其中的QDs與FITC摩爾濃度分別為60nM與120nM。最后采用IOmM磷酸緩沖液(PBS)調節(jié)復合物溶液pH，以獲得一系列具有不同pH的復合物樣品，其中的pH分別調節(jié)為 4. 9,5. 3,5. 5,5. 9,6. 0,6. 5,7. 0,7. 4,7. 5,8. 0,8. 3,8. 5 和 8. 7，QDs 與 FITC 摩爾濃度分別為40nM與80nM。所有樣品須在暗室孵化十分鐘，以使熒光增強反應達到穩(wěn)定，然后采用熒光光譜法測定每個樣品的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長均為470nm，取6次測量的平均值為最終結果。配置一系列脂質體的PBS溶液，其中的脂質體與PBS的摩爾濃度分別設定為2mM與IOmM, pH分別調節(jié)為5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,8. 5和9. 0，然后在室溫與緩慢磁力攪拌下加入等體積的復合物溶液，以形成均質的脂質體-復合物樣品溶液。采用本發(fā)明探針方法(即IFITC/IMTe與PH的線性關系)測定每個樣品的熒光發(fā)射光譜，并對測定的PH與設定的PH進行擬合，以檢驗本發(fā)明pH比率熒光探針在生物樣品或復雜體系中的實際分析能力。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種基于有機染料-量子點復合物的PH比率熒光探針的制法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟 (1)在N2氣氛，磁力攪拌及堿性水溶液中，氯化鎘、碲氫化納、巰基乙酸三者反應回流3 6小時，制備出巰基乙酸穩(wěn)定的碲化鎘量子點； (2)在室溫和磁力攪拌下，將聚乙烯亞胺水溶液逐滴加入碲化鎘量子點溶液中，形成陽離子聚電解質聚乙烯亞胺靜電吸附的碲化鎘量子點； (3)然后逐滴加入異硫氰酸熒光素水溶液，以靜電吸附的方式形成碲化鎘異硫氰酸熒光素復合物，并將其分散在磷酸緩沖液中； (4)采用熒光光譜法測定碲化鎘異硫氰酸熒光素復合物中異硫氰酸熒光素與碲化鎘量子點的特征熒光峰強度比ΙΡΙΤ。/〗。-，并擬合其與PH之間的關系，構建出基于該復合物的pH比率熒光探針。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種基于有機染料-量子點復合物的PH比率熒光探針的制法，其特征在于，步驟(I)中所述的堿性水溶液是用IM的NaOH溶液調節(jié)pH為10 12，碲氫化納、氯化鎘、巰基乙酸三者的摩爾比為I : 2 : 4 I : 10 : 20，碲化鎘量子點最大熒光發(fā)射峰波長為550 600nm。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種基于有機染料-量子點復合物的PH比率熒光探針的制法，其特征在于，步驟(2)中所述的聚乙烯亞胺在碲化鎘量子點水溶液中的質量分數(shù)為O.1%。
4.根據(jù)權利要求I所述的一種基于有機染料-量子點復合物的PH比率熒光探針的制法，其特征在于，步驟(3)中所述的異硫氰酸熒光素最大熒光發(fā)射峰波長為520nm，異硫氰酸熒光素與陽離子聚電解質聚乙烯亞胺靜電吸附的碲化鎘量子點的摩爾比為I:I 4 I。
5.根據(jù)權利要求I所述的一種基于有機染料-量子點復合物的PH比率熒光探針的制法，其特征在于，步驟(3)中所述的磷酸緩沖液的pH 6 7。
6.根據(jù)權利要求I所述的一種基于有機染料-量子點復合物的PH比率熒光探針的制法，其特征在于，步驟(4)中所述的pH范圍為5. 8 8. 7，碲化鎘異硫氰酸熒光素復合物中的特征熒光峰強度比IFITC/IMTe與PH之間的呈線性關系。
7.根據(jù)權利要求6所述的一種基于有機染料-量子點復合物的pH比率熒光探針的制法，其特征在于，所述的線性關系可應用于人體細胞膜模擬樣品溶液中PH的比率熒光探測。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于有機染料-量子點復合物的pH比率熒光探針的制法，該方法具體包括以下步驟首先采用聚乙烯亞胺對巰基乙酸穩(wěn)定的量子點(CdTe)進行修飾，然后利用靜電相互作用將異硫氰酸熒光素(FITC)吸附在量子點表面，以靜電吸附的層層自組裝方式獲得FITC-CdTe復合物。其中，該復合物的熒光特征峰強度比率IFITC/ICdTe(或對應為I520/I595)與pH呈線性關系，可發(fā)展為一種新型的pH比率熒光探針。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明方法簡單，成本較低，發(fā)明探針的靈敏性高，可作為一種新型的比率熒光探針用于生物樣品和復雜體系pH的高效探測，對于發(fā)展其它類型的高質量熒光探針具有重要的參考價值。
文檔編號G01N21/64GK102863964SQ20121039600
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月17日 優(yōu)先權日2012年10月17日
發(fā)明者萬錒俊, 桂日軍, 李慧麗, 金輝 申請人:上海交通大學