專利名稱：含芳基硼酸香豆素類化合物及其在糖檢測中的應(yīng)用的制作方法
含芳基硼酸香豆素類化合物及其在糖檢測中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種含芳基硼酸香豆素類化合物及其在糖檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
哺乳動物細(xì)胞表面的糖主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。這些糖基化的生物分子與許多生理和病理過程密切相關(guān)，如細(xì)胞間的信息交流、胚胎早期發(fā)育、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)以及某些癌癥轉(zhuǎn)移等。通過在細(xì)胞上標(biāo)記對糖類化合物有特異性響應(yīng)的探針分子可以幫助研究上述生理或病理過程。硼酸因可與單糖分子中的二醇發(fā)生特異性共價鍵合常被用作糖識別單元。利用硼酸共價鍵合不同的發(fā)色團對糖進行特異性識別的熒光探針已諸見報道，但已有探針的發(fā)射波長大多較短，限制了它們在生物試樣中的應(yīng)用，因此發(fā)展具有長發(fā)射波長、高靈敏的糖探針具有較高的應(yīng)用價值。香豆素因其熒光量子產(chǎn)率高、穩(wěn)定性好、Stokes位移較大，是熒光探針分子設(shè)計時常用的發(fā)色團。如果擴大該熒光團的共軛體系、增加分子的電子推-拉作用，可以使得最大吸收和發(fā)射波長紅移，基于此本發(fā)明設(shè)計了新型的香豆素類熒光分子探針，通過將α，β-不飽和酮共軛連接在香豆素分子上以延長共軛體系，分子上吸電子的乙烯基酮基和給 電子的N，N-二乙基氨基組成的電子推拉體系也有利于發(fā)射和激發(fā)波長的紅移。將苯硼酸通過共價鍵連接至發(fā)色團上作為糖分子受體，與糖結(jié)合后探針分子的電子和能量狀態(tài)的改變將導(dǎo)致其光譜性質(zhì)的變化，從而實現(xiàn)對糖類化合物的檢測。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種含芳基硼酸香豆素類化合物及其在糖檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種含芳基硼酸香豆素類化合物，其結(jié)構(gòu)通式
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"CCCvJCtb^
O式中R為N，N- 二烷基氨基、羥基或者烷氧基。一種含芳基硼酸香豆素類化合物的合成方法，其具體步驟為(1)4-溴苯乙酮，雙(頻哪醇合)二硼，醋酸鉀以及1，Γ -雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀和溶劑加入到反應(yīng)器中，其中，4-溴苯乙酮與雙(頻哪醇合)二硼的摩爾比為1.0 : I. O 1.8 ;4_溴苯乙酮與醋酸鉀的摩爾比為1.0 2.0 3.0;[1，1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀與4-溴苯乙酮的摩爾量之比為I 3 100 ;4_溴苯乙酮，雙(頻哪醇合)二硼，醋酸鉀以及I，r -雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀的混合物與溶劑的固液比為I : 3 5(g/mL);加熱回流，TLC點板跟蹤反應(yīng)至原料消失；除去溶劑，硅膠柱提純，得淡黃色粘稠狀產(chǎn)物1，產(chǎn)率92. 5% ；所述的溶劑為二氧六環(huán)；(2)4_R基取代水楊醛，丙二酸二乙酯和溶劑加入到反應(yīng)器中，其中4-R基取代水楊醛與丙二酸二乙酯的摩爾比為I : 2 3 ;4-R基取代水楊醛與溶劑的固液比為I : 5 7(g/mL)，加熱回流13h ;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后向燒瓶中加入I : I的濃鹽酸和冰醋酸的混合酸，4-R基取代水楊醛與混合酸的固液比為I : 6 8(g/mL)，繼續(xù)攪拌回流7h ;將反應(yīng)液冷卻至室溫后倒入去離子水中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH至5左右，析出沉淀，抽濾，得茶綠色固體；粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱分離，得米黃色固體2，產(chǎn)率81. 4% ;所述的溶劑為乙醇與二氧六環(huán)，體積比為30 I ;R基為N，N-二烷基氨基、羥基或者烷氧基；(3)在N2保護下，向裝有POCl3的反應(yīng)器中滴加DMF，將由步驟2所得的米黃色固體2的DMF溶液緩慢滴加到上述試樣中，溶液顏色逐漸由橙黃色變?yōu)樯罴t色；加熱攪拌，在 60 70°C反應(yīng)15 25h ;將反應(yīng)液倒入冰水中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5左右，抽濾，得紅褐色固體，干燥；粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱分離，旋蒸去溶劑，得橙紅色結(jié)晶物3，產(chǎn)率61.0% ；(4)將由步驟3得到的橙紅色結(jié)晶物3，步驟I得到的淡黃色粘稠狀產(chǎn)物I以及溶劑加入到反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)液中滴加幾滴吡咯烷，其中橙紅色結(jié)晶物3與淡黃色粘稠狀產(chǎn)物I的摩爾比為I : I. 5 2. 5，橙紅色結(jié)晶物3和淡黃色粘稠狀產(chǎn)物I的混合物與二氯甲烷與無水乙醇混合溶劑的固液比為I : 10 20 (g/mL)，室溫反應(yīng)4天；旋干溶劑后產(chǎn)物用石油醚/乙酸乙酯的固液比為I : 100 200 (g/mL)的混合溶液洗滌，抽濾，得鮮紅色固體4，產(chǎn)率22. 0% ；所述溶劑為二氯甲烷與無水乙醇的混合液，體積比I : I;(5)在由步驟4得到的鮮紅色固體4和20%的鹽酸水溶液加入到反應(yīng)器中，固液比為I : 100(g/mL)，室溫攪拌，TLC點板跟蹤至原料消失；將反應(yīng)液倒入去離子水中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至2 3，有大量紅色沉淀析出，靜置、過濾，濾餅用水洗至中性后干燥，得紅色結(jié)晶物，粗產(chǎn)率77. 9% ;用硅膠柱對產(chǎn)物進一步提純得到純品目標(biāo)產(chǎn)物含芳基硼酸香豆素類化合物。一種含芳基硼酸香豆素化合物在糖檢測中的應(yīng)用，其具體步驟為(I)制備含芳基硼酸香豆素化合物的二甲基亞砜(DMSO)溶液，為儲備液I ;(2)制備葡萄糖、果糖、山梨醇糖、半乳糖和甘露糖的水溶液，分別為儲備液2、儲備液3、儲備液4、儲備液5和儲備液6 ；(3)準(zhǔn)確移取100 μ L儲備液I至IOmL容量瓶中，用pH = 7. 4的O. 05M磷酸緩沖溶液稀釋至刻度，再滴加儲備液2至上述溶液，使得糖的最終濃度為I 300mM，測定溶液在不同濃度糖存在時的紫外和熒光光譜，即為葡萄糖對芳基硼酸化合物的滴定曲線；以儲備液3、儲備液4、儲備液5或儲備液6代替儲備液2，重復(fù)上述操作，即為果糖、山梨醇糖、半乳糖和甘露糖對芳基硼酸化合物的滴定曲線。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是新型的熒光分子探針具有良好的水溶性，較大的Stokes位移，其發(fā)射波長616nm位于紅光區(qū)，有利于消除生物背景的干擾。在生理pH條件下(pH = 7. 4)，該探針對D-果糖和D-山梨醇具有較高的檢測靈敏度，對它們的檢測限分別為O. 05mM和O. ImM。

圖ID-果糖對探針CSP吸收(a)與發(fā)射(b)光譜的影響；I % DMS0_50mM磷酸緩沖溶液(pH = 7. 4)，[CSP] = ΙΟμΜ,熒光激發(fā)波長為465nm。圖2糖濃度對探針CSP熒光強度的影響；I % DMS0-50mM磷酸緩沖溶液，pH = 7. 4，[CSP] = 1(^11，激發(fā)波長為46511111，熒光發(fā)射波長為61611111。圖3 —種含芳基硼酸香豆素類化合物的結(jié)構(gòu)式。
具體實施方式以下提供本發(fā)明一種含芳基硼酸香豆素類化合物及其在糖檢測中的應(yīng)用的具體實施方式
。 實施例I
權(quán)利要求
1.一種含芳基硼酸香豆素類化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)通式
2.一種含芳基硼酸香豆素類化合物的合成方法，其特征在于，其具體步驟為 (1)4-溴苯乙酮，雙(頻哪醇合)二硼，醋酸鉀以及1，1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀和溶劑加入到反應(yīng)器中；加熱回流，TLC點板跟蹤反應(yīng)至原料消失；除去溶劑，硅膠柱提純，得淡黃色粘稠狀產(chǎn)物I ; (2)4-R基取代水楊醛，丙二酸二乙酯和溶劑加入到反應(yīng)器中，其中4-R基取代水楊醛與丙二酸二乙酯的摩爾比為I : 2 3 ;4-R基取代水楊醛與溶劑的固液比為I : 5 7(g/mL)，加熱回流13h ;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后向燒瓶中加入I : I的濃鹽酸和冰醋酸的混合酸，4-R基取代水楊醛與混合酸的固液比為I : 6 8 (g/mL)，繼續(xù)攪拌回流7h ;將反應(yīng)液冷卻至室溫后倒入去離子水中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH至5左右，析出沉淀，抽濾，得茶綠色固體；粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱分離，得米黃色固體2 ;R基為N，N- 二烷基氨基、羥基或者烷氧基； (3)在N2保護下，向裝有POCl3的反應(yīng)器中滴加DMF，將由步驟2所得的米黃色固體2的DMF溶液緩慢滴加到上述試樣中，溶液顏色逐漸由橙黃色變?yōu)樯罴t色；加熱攪拌，在60 70°C反應(yīng)15 25h ;將反應(yīng)液倒入冰水中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5左右，抽濾，得紅褐色固體，干燥；粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱分離，旋蒸去溶劑，得橙紅色結(jié)晶物3 ； (4)將由步驟3得到的橙紅色結(jié)晶物3，步驟I得到的淡黃色粘稠狀產(chǎn)物I以及溶劑加入到反應(yīng)器中，然后向反應(yīng)液中滴加吡咯烷，其中橙紅色結(jié)晶物3與淡黃色粘稠狀產(chǎn)物I的摩爾比為I : I. 5 2. 5，橙紅色結(jié)晶物3和淡黃色粘稠狀產(chǎn)物I的混合物與二氯甲烷與無水乙醇混合溶劑的固液比為I : 10 20 (g/mL)，室溫反應(yīng)4天；旋干溶劑后產(chǎn)物用石油醚/乙酸乙酯的固液比為I : 100 200 (g/mL)的混合溶液洗滌，抽濾，得鮮紅色固體4 ； (5)在由步驟4得到的鮮紅色固體4和鹽酸水溶液加入到反應(yīng)器中，室溫攪拌，TLC點板跟蹤至原料消失；將反應(yīng)液倒入去離子水中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至2 3，有紅色沉淀析出，靜置、過濾，濾餅用水洗至中性后干燥，得紅色結(jié)晶物；用硅膠柱對產(chǎn)物進一步提純得到純品目標(biāo)產(chǎn)物含芳基硼酸香豆素類化合物。
3.如權(quán)利要求2所述的一種含芳基硼酸香豆素類化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步驟⑴中，4-溴苯乙酮與雙(頻哪醇合)二硼的摩爾比為1.0 1.0 1.8;4_溴苯乙酮與醋酸鉀的摩爾比為1.0 2·0 3·0;[1，Γ -雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀與4-溴苯乙酮的摩爾量之比為I 3 100 ;4_溴苯乙酮，雙(頻哪醇合)二硼，醋酸鉀以及1，Ρ -雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀的混合物與溶劑的固液比為I : 3 5(g/mL)。
4.如權(quán)利要求2所述的一種含芳基硼酸香豆素類化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步驟(I)中，所述的溶劑為二氧六環(huán)。
5.如權(quán)利要求2所述的一種含芳基硼酸香豆素類化合物的合成方法，其特征在于，在所述的步驟(2)中，所述的溶劑為乙醇與二氧六環(huán)，體積比為30 I。
6.一種含芳基硼酸香豆素化合物在糖檢測中的應(yīng)用，其特征在于，其具體步驟為 (1)制備含芳基硼酸香豆素化合物的二甲基亞砜(DMSO)溶液，為儲備液I; (2)制備葡萄糖、果糖、山梨醇糖、半乳糖和甘露糖的水溶液，分別為儲備液2、儲備液.3、儲備液4、儲備液5和儲備液6 ； (3)準(zhǔn)確移取100μ L儲備液I至IOmL容量瓶中，用pH = 7. 4的O. 05M磷酸緩沖溶液稀釋至刻度，再滴加儲備液2至上述溶液，使得糖的最終濃度為I 300mM，測定溶液在不同濃度糖存在時的紫外和熒光光譜，即為葡萄糖對芳基硼酸化合物的滴定曲線；以儲備液3、儲備液4、儲備液5或儲備液6代替儲備液2，重復(fù)上述操作，即為果糖、山梨醇糖、半乳糖和甘露糖對芳基硼酸化合物的滴定曲線。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含芳基硼酸香豆素類化合物及其在糖檢測中的應(yīng)用，新型的熒光分子探針利用芳基硼酸與多元醇特異性結(jié)合的性質(zhì)，其與糖反應(yīng)前后化合物的光譜發(fā)生明顯變化，對D-果糖和D-山梨醇具有較高的檢測靈敏度，發(fā)射波長達620nm、位于紅光區(qū)，適用于生物體內(nèi)糖含量的檢測。
文檔編號G01N21/64GK102887914SQ201210396468
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者錢俊紅, 張凌怡, 柏紅艷, 張維冰, 田海玉, 孫倩 申請人:華東理工大學(xué)