專利名稱：一種檢測內(nèi)毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種內(nèi)毒素的檢測方法，特別涉及ー種內(nèi)毒素的電化學(xué)檢測方法。
背景技術(shù)：
所有能引起熱原反應(yīng)的物質(zhì)稱為熱原，藥品中的熱原主要是細(xì)菌內(nèi)毒素。半個多世紀(jì)以來，熱原檢查法對保證注射用藥品安全發(fā)揮了重要作用。但隨著制藥エ業(yè)的發(fā)展，該方法已不完全適合許多品種的熱原檢查。為此，人們研究了ー種替代熱原檢查法的方法，這就是我們今天正在研究和擴(kuò)大應(yīng)用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是輸注藥品及器械質(zhì)量控制中的ー項(xiàng)重要指標(biāo)。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一，革蘭氏陰性菌破裂后，釋放出內(nèi)毒素，環(huán)境中內(nèi)毒素?zé)o處不在，具有廣泛的生物活性，以致熱居首。防止輸注用藥及器械的熱原污染，是十分重要的。目前檢測內(nèi)毒素的主要試劑是鱟試劑，基于鱟試劑的檢測方法包括凝膠法、顯色 法和濁度法。內(nèi)毒素與鱟試劑接觸后，能引發(fā)一系列的級聯(lián)反應(yīng)，最終激活鱟試劑中的凝固酶原，從而導(dǎo)致鱟試劑的凝固。凝膠法用于定性測試，顯色法和濁度法可以用于內(nèi)毒素的定量測定。顯色法和濁度法實(shí)驗(yàn)過程中都需要分光光度計(jì)，用時1-2小時，檢測容易受到樣品中顯色物質(zhì)的干擾，而且鱟試劑的凝固過程對光學(xué)測量有一定干擾，因此難以實(shí)現(xiàn)對內(nèi)毒素的精確檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測內(nèi)毒素的新方法，其能實(shí)現(xiàn)對內(nèi)毒素的快速、精確檢測，從而克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的一種檢測內(nèi)毒素的方法包括
在鱟試劑中加入具有氧化還原活性的物質(zhì)，再向鱟試劑中加入可能含有內(nèi)毒素的待測樣品，并對鱟試劑施加與所述具有氧化還原活性的物質(zhì)相應(yīng)的氧化還原電位，同時實(shí)時監(jiān)測通過鱟試劑的電流大小，進(jìn)而獲知待測樣品中內(nèi)毒素的濃度；
其中，加入所述鱟試劑中的內(nèi)毒素濃度與通過鱟試劑的電流的驟降時間點(diǎn)之間存在如下對數(shù)線性關(guān)系logT=klogC+h,其中T為電流驟降時間，C為內(nèi)毒素的濃度，k為直線斜率，h為Y軸截距，更確切的講，k和h為與鱟試劑種類和濃度相關(guān)的常數(shù)。作為較佳的實(shí)施方案之一，加入所述鱟試劑中的具有氧化還原活性的物質(zhì)的濃度為0. I 100 mM，尤其優(yōu)選為1-50 mM。作為較佳的實(shí)施方案之一，所述氧化還原電位的大小為-I. OV +1. 0V。作為可實(shí)施的方案之一，所述具有氧化還原活性的物質(zhì)可選自鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、釕或其配合物(六氨合釕等)、吩惡嗪衍生物(8- ニ甲基氨-2，3-苯并吩惡嗪、7- ニ甲基氨-1，2-苯并吩惡嗪等)，但不限于此。作為可實(shí)施的方案之一，所述鱟試劑可選自商品化凝膠法、濁度法、顯色法鱟試齊U，但不限于此。
進(jìn)ー步的，該方法還可包括如下步驟
在鱟試劑中加入具有氧化還原活性的物質(zhì)，并將鱟試劑的溫度調(diào)整至設(shè)定值，再向鱟試劑中分別加入一系列具有不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品，且保持所述鱟試劑溫度不變，并向所述鱟試劑施加與所述具有氧化還原活性的物質(zhì)相應(yīng)的氧化還原電位，同時實(shí)時監(jiān)測通過鱟試劑的電流大小，進(jìn)而繪制內(nèi)毒素濃度-電流驟降時間點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出加入所述鱟試劑中的內(nèi)毒素濃度與通過鱟試劑的電流的驟降時間點(diǎn)之間的對數(shù)線性關(guān)系。作為較佳的實(shí)施方案之一，該方法是在溫度為37. 0±1°C的條件下進(jìn)行的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)至少在于通過電化學(xué)過程直接反應(yīng)出鱟試劑凝固過程中粘度的改變，不受樣品顏色的干擾，使用相同的鱟試劑，采用本發(fā)明方法完成檢測用時比顯色法與濁度法減少10-25%，能快速、精確的實(shí)現(xiàn)對內(nèi)毒素的檢測，檢測靈敏度可達(dá) 0.01 EU/ml適于在藥品質(zhì)量控制、醫(yī)療器械熱原監(jiān)測等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。


圖I是本發(fā)明內(nèi)毒素檢測方法的工作原理示意圖，其中，內(nèi)毒素引發(fā)鱟試劑的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致鱟試劑聚集形成凝膠，且聚集過程中導(dǎo)致穩(wěn)態(tài)電流急劇降低。圖2a和圖2b分別是本發(fā)明一典型實(shí)施例中的時間-電流曲線圖和對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，在圖2a中，從右到左所示曲線分別對應(yīng)濃度為0. 05,0. 1,0. 2,0. 5、1、2、5、10 Eu mじ1的內(nèi)毒素，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2b所示，其中實(shí)驗(yàn)中實(shí)際測得的時間電流曲線100秒時的電流在圖2a中被定義為I。圖3a是以傳統(tǒng)濁度法所獲時間-吸光度曲線圖，圖3b所示系以傳統(tǒng)濁度法和本發(fā)明一典型實(shí)施例中內(nèi)毒素檢測方法所獲標(biāo)準(zhǔn)曲線對照圖，在圖3a中從右到左所示曲線分別對應(yīng)濃度為0. 1、0. 2、0. 5、1、2、5、10 Eu mじ1的內(nèi)毒素，在圖3b中上下兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線分別對應(yīng)傳統(tǒng)濁度法和本發(fā)明的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式如前所述，有鑒于現(xiàn)有技術(shù)中的諸多不足，本發(fā)明g在提供ー種新型的基于電化學(xué)的檢測鱟試劑凝固過程的方法用于內(nèi)毒素的測定。概括的講，本發(fā)明是通過電化學(xué)過程直接反應(yīng)出鱟試劑凝固過程中粘度的改變，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對樣品中所含內(nèi)毒素的檢測，且檢測結(jié)果不會受到樣品顏色的干擾，檢測精確度好、時間短。更為具體的講，參閱圖1，本發(fā)明通過在鱟試劑中加入具有氧化還原活性的物質(zhì)(如鐵氰化鉀、釕等)，對鱟試劑施加氧化還原電位，即可利用電化學(xué)工作站或者其他檢測設(shè)備，檢測到電流信號隨時間的改變，該電流在不加入內(nèi)毒素時是ー個穩(wěn)態(tài)電流(圖I下端左側(cè)曲線所示)。而當(dāng)內(nèi)毒素加入后，會引發(fā)鱟試劑的凝固反應(yīng)，使體系的粘度増加，并阻礙氧化還原物質(zhì)與電極之間的電子傳遞，這ー過程打破了電流的穩(wěn)態(tài)，電流會出現(xiàn)ー個急劇的減小過程(圖I下端右側(cè)曲線所示)。不同濃度的內(nèi)毒素加入體系后，引發(fā)鱟試劑凝固的快慢是不一樣的，對應(yīng)不同的電流急劇減小時刻，并且，本案發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素的濃度與內(nèi)毒素引起的電流驟降時間點(diǎn)之間存在對數(shù)線性關(guān)系，因此利用本發(fā)明方法可以實(shí)現(xiàn)內(nèi)毒素的快速精確檢測。
作為本發(fā)明的一個較優(yōu)實(shí)施方案，其所涉及的內(nèi)毒素的檢測方法可以包括如下步驟
(1)選取市售的任ー種商品化凝膠法、濁度法或顯色法鱟試劑備用；
(2)選取本領(lǐng)域習(xí)用的鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、釕或其配合物(六氨合釕等)、吩惡嗪衍生物(8- ニ甲基氨-2，3-苯并吩惡嗪、7- ニ甲基氨-1，2-苯并吩惡嗪等)中的任意ー種作為具有氧化還原活性的物質(zhì)備用；
(3)將所述具有氧化還原活性的物質(zhì)加入前述鱟試劑中，優(yōu)選使得其中具有氧化還原活性的物質(zhì)的濃度達(dá)到0. 1-lOOmM，并且，進(jìn)ー步優(yōu)選的，還可將形成的混合物預(yù)熱至設(shè)定溫度 37. 0±1°C ；
(4)再向前述鱟試劑中加入內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品或者待測樣品，并插入電極，向鱟試劑施加與前述具有氧化還原活性的物質(zhì)對應(yīng)的氧化還原電位(一般為-I. OV +1. 0V),并實(shí)時監(jiān)測通過該混合體系的電流，電流將在一定時間后(大約30s)進(jìn)入穩(wěn)態(tài)，即以較穩(wěn)定的速度緩慢 下降，當(dāng)鱟試劑在內(nèi)毒素引發(fā)下而發(fā)生凝固吋，穩(wěn)態(tài)打破，電流急劇減小。為確切探知加入鱟試劑中的內(nèi)毒素濃度與通過鱟試劑的電流的驟降時間點(diǎn)之間的關(guān)系，以下僅結(jié)合一典型實(shí)施例及相應(yīng)附圖作更為詳細(xì)的說明
本實(shí)施例中內(nèi)毒素的檢測方法包括
取30 ii L 50 mM Fe (CN)廣、150 y L LAL試劑、120 y L含有不同濃度內(nèi)毒素的樣品均勻混合，并將形成的混合體系的溫度調(diào)整至37. 0±1°C，再以碳電極作為工作電極、Ag/AgCl電極作為參比電極、鉬電極作為對電極插入該混合體系中，構(gòu)建三電極電化學(xué)體系，其后，以CHI 660D電化學(xué)工作站(產(chǎn)自CH設(shè)備公司，中國上海)配合前述電化學(xué)體系進(jìn)行試驗(yàn)，其中，測試電壓恒定為-0. 3V。前述樣品可采用濃度分別為0. 05、0. 1、0. 2、0. 5、1、2、5、10 Eu mじ1的一系列內(nèi)
毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品。藉由這些標(biāo)準(zhǔn)樣品，可以獲得如圖2a所示時間-電流曲線圖譜，而根據(jù)該圖譜，還繪制了如圖2b所示標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照該圖2b，顯然可以看到，加入所述鱟試劑中的內(nèi)毒素濃度與通過鱟試劑的電流的驟降時間點(diǎn)之間存在對數(shù)線性關(guān)系，線性回歸方程為1=2. 935-0. 3600x, R2=O. 9942，其中y是凝固開始時間的對數(shù)值，x是內(nèi)毒素濃度的對數(shù)值。又及，本案發(fā)明人還采用與本實(shí)施例相同的鱟試劑，利用傳統(tǒng)濁度法對濃度分別為0. 1、0. 2、0. 5、1、2、5、10 Eu mじ1的一系列內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行了檢測，并獲得如圖3a所示時間-吸光度曲線圖譜，并藉由該時間-吸光度曲線圖譜繪制了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(參閱圖3b中所示位于上方的曲線),并將之與本實(shí)施例所獲的前述標(biāo)準(zhǔn)曲線(參閱圖3b中所示位于下方的曲線)進(jìn)行了對比，顯然，可以看到，藉由本實(shí)施例的內(nèi)毒素檢測方法，可以更為精確快捷的實(shí)現(xiàn)對內(nèi)毒素的檢測，且完成同樣靈敏度的內(nèi)毒素測試，本發(fā)明方法耗時較之傳統(tǒng)方法減少10-25%。進(jìn)ー步，顯然，若要對待測樣品中的內(nèi)毒素濃度進(jìn)行檢測，則只需按照本實(shí)施例所示的方法進(jìn)行操作，井根據(jù)最終所獲通過鱟試劑的電流的驟降時間點(diǎn)等數(shù)據(jù)及前述圖2b所示標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可獲知待測樣品中的內(nèi)毒素濃度。例如，本案發(fā)明人曾以含有10%牛血清蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)進(jìn)行了試驗(yàn)，在應(yīng)用所述細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)培養(yǎng)細(xì)胞2天之后，向該細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中分別加入不同數(shù)量的內(nèi)毒素，并分別以本發(fā)明前述實(shí)施例的方法(以下簡稱“本發(fā)明方法”)及傳統(tǒng)濁度法進(jìn)行了測試，其結(jié)果參見下表I:
表I以本發(fā)明方法和傳統(tǒng)濁度法對細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中的內(nèi)毒素進(jìn)行的測試結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種檢測內(nèi)毒素的方法，其特征在于，它包括 在鱟試劑中加入具有氧化還原活性的物質(zhì)，再向鱟試劑中加入可能含有內(nèi)毒素的待測樣品，并對鱟試劑施加與所述具有氧化還原活性的物質(zhì)相應(yīng)的氧化還原電位，同時實(shí)時監(jiān)測通過鱟試劑的電流大小，進(jìn)而獲知待測樣品中內(nèi)毒素的濃度； 其中，加入所述鱟試劑中的內(nèi)毒素濃度與通過鱟試劑的電流的驟降時間點(diǎn)之間存在如下對數(shù)線性關(guān)系logT=klogC+h，其中T為電流驟降時間，C為內(nèi)毒素的濃度，k和h為與鱟試劑種類和濃度相關(guān)的常數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測內(nèi)毒素的方法，其特征在于，加入所述鱟試劑中的具有氧化還原活性的物質(zhì)的濃度為0. I 100 mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的檢測內(nèi)毒素的方法，其特征在于，加入所述鱟試劑中的具有氧化還原活性的物質(zhì)的濃度為1-50 mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測內(nèi)毒素的方法，其特征在于，所述氧化還原電位的大小為-I. OV +1.0V。
5.根據(jù)權(quán)利要求I中任一項(xiàng)所述的檢測內(nèi)毒素的方法，其特征在于，所述具有氧化還原活性的物質(zhì)至少選自鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、釕或其配合物和吩惡嗪衍生物中的任意一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測內(nèi)毒素的方法，其特征在于，所述釕的配合物包括六氨合釕，所述吩惡嗪衍生物包括8- ニ甲基氨-2，3-苯并吩惡嗪和/或7- ニ甲基氨-1，2-苯并吩惡嗪。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測內(nèi)毒素的方法，其特征在于，所述鱟試劑至少選自商品化凝膠法、濁度法、顯色法鱟試劑中的任意ー種。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測內(nèi)毒素的方法，其特征在于，該方法還包括如下步驟 在鱟試劑中加入具有氧化還原活性的物質(zhì)，并將鱟試劑的溫度調(diào)整至設(shè)定值，再向鱟試劑中分別加入一系列具有不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品，且保持所述鱟試劑溫度不變，并向所述鱟試劑施加與所述具有氧化還原活性的物質(zhì)相應(yīng)的氧化還原電位，同時實(shí)時監(jiān)測通過鱟試劑的電流大小，進(jìn)而繪制內(nèi)毒素濃度-電流驟降時間點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出加入所述鱟試劑中的內(nèi)毒素濃度與通過鱟試劑的電流的驟降時間點(diǎn)之間的對數(shù)線性關(guān)系。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的檢測內(nèi)毒素的方法，其特征在于，該方法是在溫度為37. 0±1°C的條件下進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測內(nèi)毒素的方法，包括在鱟試劑中加入具有氧化還原活性的物質(zhì)，再向鱟試劑中加入可能含有內(nèi)毒素的待測樣品，并對鱟試劑施加與所述具有氧化還原活性的物質(zhì)相應(yīng)的氧化還原電位，同時實(shí)時監(jiān)測通過鱟試劑的電流大小，進(jìn)而獲知待測樣品中內(nèi)毒素的濃度；其中，加入所述鱟試劑中的內(nèi)毒素濃度與通過鱟試劑的電流的驟降時間點(diǎn)之間存在對數(shù)線性關(guān)系。本發(fā)明通過電化學(xué)過程直接反應(yīng)出鱟試劑凝固過程中粘度的改變，不受樣品顏色的干擾，能快速、精確的實(shí)現(xiàn)對內(nèi)毒素的檢測，適于在藥品質(zhì)量控制、醫(yī)療器械熱原監(jiān)測等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。
文檔編號G01N27/26GK102866187SQ20121039667
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月18日
發(fā)明者劉濤, 繆鵬, 張春, 祁靜, 韓坤 申請人:蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所