專利名稱：基于已知e1查找特異性介導(dǎo)靶蛋白泛素反應(yīng)e2-e3的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體而言，特指一種從人體細(xì)胞眾多E3中查找出特異性識別靶蛋白泛素連接酶E3和調(diào)控靶蛋白泛素化反應(yīng)的E2/E3系統(tǒng)的方法。
背景技術(shù)：
在各種形式的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程中，泛素化修飾近年來引起了越來越廣泛的關(guān)注。與磷酸化修飾過程一樣，泛素化修飾過程也是一種可逆的共價修飾過程，它通過調(diào)節(jié)被修飾蛋白的穩(wěn)定性、功能活性狀態(tài)以及細(xì)胞內(nèi)定位等情況，在細(xì)胞生命活動的許多進(jìn)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。被多聚泛素化修飾(Poly-ubiquitination)的革巴蛋白一般會被蛋白酶體識別進(jìn)而被降解，此過程主要涉及三種關(guān)鍵的酶活化酶E1，結(jié)合酶E2和連接酶E3。蛋白質(zhì)被泛 素化修飾的作用機(jī)制為首先由El在ATP能量作用下通過其活性中心的Cys殘基與泛素的C端形成硫酯鍵活化單個游離的泛素，然后El將活化的泛素遞交給E2，最后由E3募集特異的底物和E2，并介導(dǎo)泛素從E2轉(zhuǎn)移到靶蛋白。由于蛋白酶體識別泛素化的蛋白并將其降解是一個非特異性的進(jìn)程，因此，E3在整個蛋白質(zhì)的降解過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，它決定了反應(yīng)的特異性。人類蛋白質(zhì)組中含有兩種El酶、50多種E2酶、600多種E3酶(Bhoj，V. G. & Chen, Z. J. , Nature, 2009，458:430-437)。E3 酶是泛素修飾途徑中決定底物特異性的關(guān)鍵酶，它可以分為兩大類，即含有HECT結(jié)構(gòu)域的E3酶(Zheng，N., Structure,2003，11: 5-6)和其它含有RING結(jié)構(gòu)域或類似RING結(jié)構(gòu)域的E3酶(Petroski, M. D.，et al. , Nat Rev Mol Cell Biol, 2005, 6: 9-20)。幾乎所有主要的DNA修復(fù)途徑、損傷避免機(jī)制和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)響應(yīng)等過程都或多或少地受到泛素化和(或)類泛素化修飾SUMO修飾途徑的調(diào)控。泛素化和SUMO參與多種DNA的修復(fù)過程,如跨損傷修復(fù)(Translesion synthesis),核苷酸切除修復(fù)(Nucleotideexcision),同源重組(Homologous recombination)等。作為一種最主要的聚合酶,DNA聚合酶δ (Pol δ )在各種形DNA修復(fù)過程中通過重新合成DNA (Re-synthesis of DNA)和缺口填補(bǔ)(Gap-filling)起著重要的作用(Branzei, D. &. Foiani, M. , Nat Rev MolCell Biol, 2008, 9: 297-308)。通過對人Pol δ進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Pol δ本身也是一個 DNA 損傷響應(yīng)的靶目標(biāo)(Zhang, S·，et al., J Biol Chem, 2007，282: 15330-40)。在體外培養(yǎng)的人細(xì)胞中，通過遺傳毒物處理或射線誘導(dǎo)而引起DNA損傷的情況下，Pol δ的小亞基ρ12在ATR/Chkl通路調(diào)控下以泛素化依賴的形式降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Pol δ由原來的四聚體形式Pol δ 4轉(zhuǎn)換為三聚體Pol δ 3以應(yīng)對DNA損傷(Meng，X.，et al.,Nucleic Acids Res, 2009，37: 647-657)。類似的研究也表明，pl2 和 Pol δ 的另外一個調(diào)節(jié)亞基ρ68也能被泛素化和SUMO修飾(Liu, G. &. Warbrick, E. , Biochem BiophysRes Commun, 2006, 349: 360-6),但到目前為止,對pl2被降解(下調(diào))的泛素修飾機(jī)制不清楚，其關(guān)鍵點(diǎn)在于，還沒有建立一個很好的方法從眾多的E3中確定出特異性識別和介導(dǎo)靶蛋白進(jìn)行泛素化修飾的連接酶E3，尋找E2/E3系統(tǒng)調(diào)控靶蛋白的泛素化修飾途徑成為一項令人“恐怖”的實驗。癌癥是一種由遺傳和表觀遺傳改變，以細(xì)胞異常增殖及轉(zhuǎn)移為特點(diǎn)的一大類疾病，而泛素修飾系統(tǒng)則由一系列能催化細(xì)胞內(nèi)靶蛋白泛素化的酶和底物蛋白所組成，對細(xì)胞內(nèi)的多種功能進(jìn)行調(diào)控，如果泛素修飾系統(tǒng)出現(xiàn)問題將引起人體內(nèi)的多種病理改變，如各種腫瘤的發(fā)生等。鑒于Pol S所具有的特殊生物學(xué)功能以及泛素蛋白修飾途徑在DNA修復(fù)機(jī)制中的關(guān)鍵性作用，闡明Pol δ小亞基ρ12降解的泛素化修飾機(jī)制，對理解多種疾病的發(fā)生機(jī)制和遺傳信息的調(diào)控表達(dá)有著重要意義，而查找出特異性識別靶蛋白Ρ12的Ε3和介導(dǎo)Ρ12泛素化修飾的Ε2/Ε3調(diào)控系統(tǒng)已成為目前制約我們了解ρ12降解的泛素化修飾機(jī)制的瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是建立體外泛素化分析手段，通過已知的泛素活 化酶El和以Hela SlOO餾分作為Ε3源，篩選出介導(dǎo)靶蛋白泛素反應(yīng)的結(jié)合酶Ε2 ;采用多重層析柱組合，結(jié)合質(zhì)譜分析，從人體細(xì)胞中查找特異性識別靶蛋白的泛素連接酶Ε3和調(diào)控靶蛋白泛素化修飾的Ε2/Ε3系統(tǒng)。通過這種方法，可以方便、準(zhǔn)確地查找出識別靶蛋白的底物識別因子一泛素連接酶Ε3 ;建立介導(dǎo)靶蛋白泛素化修飾的Ε2/Ε3調(diào)控系統(tǒng)，解除制約“闡明ρ12降解的泛素化修飾機(jī)制”的瓶頸。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)途徑來實現(xiàn)的
I.建立泛素化修飾反應(yīng)的體外(In vitro)分析系統(tǒng)和Ε2的確定泛素反應(yīng)的體外分析系統(tǒng)是以經(jīng)純化的GST融合蛋白作為基質(zhì)，GST為對照，反應(yīng)體系中還含有泛素，活化酶El,結(jié)合酶E2,連接酶E3,Ubiquitin aldehyde (抑制蛋白酶體泛素化水解和去泛素化酶的活性)，ATP能量再生系統(tǒng)。E2的確定過程是將以上反應(yīng)混合物于反應(yīng)緩沖液中30°C下反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)完成后，用Glutathione珠回收GST融合蛋白(靶蛋白)或GST的耦合物，SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜后，以抗泛素的抗體Western Blot檢測祀蛋白-泛素I禹合物,從待選的多種E2中篩選出在已知El情況下介導(dǎo)靶蛋白多泛素化反應(yīng)最強(qiáng)的、與未知E3配對的E2。上述反應(yīng)體系中，所述的基質(zhì)(靶蛋白)是經(jīng)純化后的帶GST標(biāo)簽的DNA聚合酶Pol δ小亞基ρ12的融合蛋白。所述的泛素是從BostonBiochem公司購買的商業(yè)化人源泛素蛋白(Ubiquitin)。所述的活化酶El是從BostonBiochem公司購買的商業(yè)化人源重組UBEl(Ubiquitin El Enzyme)。所述的結(jié)合酶E2是從BostonBiochem公司購買的商業(yè)化人源重組UbcH5c、UbcH2、UbcH3 (Cdc34)以及 UbcH13/Uevla 復(fù)合物(以 UbcH13 表示)。所述的連接酶E3是指在上述的反應(yīng)體系中，以BostonBiochem公司購買的商業(yè)化Hela細(xì)胞SlOO餾分作為E3源。所述的ATP能量再生系統(tǒng)是指從BostonBiochem公司購買的商業(yè)化ERS (EnergyRegeneration System)。所述的反應(yīng)緩沖液是40mM Tris-HCl, pH 7. 5, 2 mM DTT, 5 mM MgCl20所述的抗泛素的抗體是指從Cell Signaling Technology公司購買的商業(yè)化兔源抗泛素的多克隆抗體。2.基于已知El和通過上述技術(shù)途徑篩選出的E2對特異性識別靶蛋白的E3進(jìn)行查找人體細(xì)胞抽提液經(jīng)過4個不同性質(zhì)的層析柱，每一步層析后，運(yùn)用上述所建立的泛素反應(yīng)體外分析系統(tǒng)，對各洗脫餾分檢測E3的活性，合并含E3活性的洗脫餾分峰，再通過下一個層析柱，在最后一步層析后，對含E3活性餾分峰進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，確定出特異性識別靶蛋白的E3。上述技術(shù)方案中所述的人體細(xì)胞抽提液是指體外培養(yǎng)的大約2 X IO8Hela細(xì)胞在裂解緩沖液存在下經(jīng)超聲波裂解，4°C下進(jìn)行高速離心后所收集的上清液。所述的4個不同性質(zhì)層析柱是指免疫親和層析柱，由本實驗室采用抗DNA聚合酶Pol δ純化大亞基ρ125而制備的層析柱(中國發(fā)明專利，申請?zhí)?01010556585. 7)，該步層析目的是將Pol δ四亞基蛋白復(fù)合物與Ε3活性分開；其它的三個層析柱分別是PhenylSepharose疏水層析柱、Mono Q離子交換層析柱、Superdex 200分子篩層析柱。 所述的質(zhì)譜鑒定是指將Superdex 200分子篩層析柱后的含E3活性峰經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，用手術(shù)刀將膠均勻切割成多個條帶，每個條帶經(jīng)胰蛋白酶消化后，分別在4800 Plus MALDI T0F/T0F質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析，利用MASCOT搜索引擎在NCBInr數(shù)據(jù)庫中匹配，查找出特異性識別靶蛋白(Pol δ小亞基ρ12)的Ε3。所確定出的特異性識別祀蛋白Pol δ小亞基ρ12的Ε3是RingFingerProtein(C3HC4 type) 8，即 RNF8 ;介導(dǎo) pl2 泛素化修飾的 E2/E3 調(diào)控系統(tǒng)是UbcH13/Uevla/RNF8。3.對篩選出的E3是否特異性介導(dǎo)靶蛋白泛素化反應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步簽定將RNF8作為E3源取代技術(shù)途徑I所述的泛素化修飾反應(yīng)體外分析系統(tǒng)中的Hela細(xì)胞SlOO餾分，30°C下反應(yīng)60分鐘后的反應(yīng)物直接進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜，以抗泛素的抗體WesternBlot檢測靶蛋白-泛素耦合物，確定所篩選出的RNF8是否特異性介導(dǎo)靶蛋白(Pol δ小亞基Ρ12)的泛素化反應(yīng)。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)為利用4個不同性質(zhì)層析柱的組合，結(jié)合體外泛素化反應(yīng)分析系統(tǒng)，通過質(zhì)譜分析，從人體細(xì)胞數(shù)量眾多的Ε3中，方便、準(zhǔn)確的查找出特異性識別靶蛋白的Ε3和介導(dǎo)靶蛋白泛素化反應(yīng)的Ε2/Ε3系統(tǒng)，解除制約我們深入研究蛋白質(zhì)泛素化修飾機(jī)制的瓶頸；本發(fā)明所運(yùn)用的體外泛素化反應(yīng)分析系統(tǒng)所涉及到的泛素、EU Ε2、抗體等生物材料均為商業(yè)化產(chǎn)品，能夠方便地通過外購而獲得。本發(fā)明通過以下附圖和實施例作進(jìn)一步詳細(xì)闡述。


圖I.泛素化修飾體外反應(yīng)系統(tǒng)的建立和Ε2的確定。A :蛋白質(zhì)被泛素化修飾作用機(jī)制的示意圖。首先El類酶在ATP提供能量情況下激活泛素；泛素轉(zhuǎn)移至Ε2類酶；Ε3類酶具有特異性，可以識別出需破壞的目標(biāo)蛋白質(zhì)，與目標(biāo)蛋白質(zhì)接近的Ε2-泛素復(fù)合體將泛素轉(zhuǎn)移至目標(biāo)蛋白質(zhì)；Ε3類酶釋放出被泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)；重復(fù)以上過程，在被標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子尾端形成一小段多泛素分子鏈。B :在標(biāo)準(zhǔn)泛素化體外反應(yīng)系統(tǒng)中不同Ε2對ρ12多泛素反應(yīng)響應(yīng)的Western Blot分析。以人重組UBEl作為El，以Hela SlOO餾分作為E3源，以GST蛋白作為對照反應(yīng)，圖從左到右分別表示反應(yīng)中加入不同商品化的人源E2，其中，以UbCH13/Uevla復(fù)合物(圖中以UbcH13表示)介導(dǎo)pl2的泛素反應(yīng)信號最強(qiáng)。
圖2.依賴于UbcH13/Uevla介導(dǎo)pl2泛素化的E3分離純化流程示意圖。大約
2X IO8 Hela細(xì)胞抽提液經(jīng)過I.免疫親和層析柱、2. Phenyl S印harose疏水層析柱、3. MonoQ離子交換層析柱和4. Superdex 200分子篩層析柱4步層析，每一步層析后由所建立的泛素化分析系統(tǒng)檢測E3的活性，合并含E3活性的洗脫餾分，再通過下一個柱層析。在最后一步層析后，對含E3活性餾分峰進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，確定出特異性識別靶蛋白pl2的E3。圖3.免疫親和層析后E3活性檢測。A :免疫親和層析后的洗脫餾分WesternBlot分析。檢測到的人DNA聚合酶Pol δ的4個亞基如圖左的箭頭所示，圖下方的Be :細(xì)胞裂解離心后上清液(Before column), Ft :過柱后的上清液(Flow through), W :漂洗液(Wash)，泳道3-40 :洗脫的餾分，大部分Pol δ復(fù)合物已經(jīng)被分離。B: Ε3活性檢測的Western Blot分析。圖左數(shù)字表示標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker (KDa), Ck :標(biāo)準(zhǔn)泛素化體外反應(yīng)系統(tǒng)中以GST蛋白作為對照反應(yīng)，F(xiàn)t :標(biāo)準(zhǔn)泛素化體外反應(yīng)系統(tǒng)中以過柱后的上清液作為E3源，泳道15 :標(biāo)準(zhǔn)泛素化體外反應(yīng)系統(tǒng)中以第15洗脫餾分為E3源。介導(dǎo)pl2泛素化反應(yīng)的E3活性主要存在于Ft，被分離的Pol δ復(fù)合物15號洗脫峰中未檢測到Ε3的活性。 圖4. Phenyl Sepharose疏水層析后Ε3活性檢測的Western Blot分析。圖左數(shù)字表示標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker (KDa)，Ck :標(biāo)準(zhǔn)泛素化體外反應(yīng)系統(tǒng)中以GST蛋白作為對照反應(yīng)，圖上面數(shù)字表示層析后的不同餾分洗脫峰在標(biāo)準(zhǔn)泛素化體外反應(yīng)系統(tǒng)中作為E3源，以第50號餾分介導(dǎo)pl2泛素化反應(yīng)的E3活性最強(qiáng)。圖5. Mono Q離子交換層析后E3活性檢測的Western Blot分析。圖左數(shù)字表示標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker (KDa)，Ck :標(biāo)準(zhǔn)泛素化體外反應(yīng)系統(tǒng)中以GST蛋白作為對照反應(yīng)，圖上面數(shù)字表示層析后的不同餾分洗脫峰在標(biāo)準(zhǔn)泛素化體外反應(yīng)系統(tǒng)中作為E3源，以第9 一 12號餾分介導(dǎo)P12泛素化反應(yīng)的E3活性為最強(qiáng)。圖6. Superdex 200分子篩層析后E3活性檢測的Western Blot分析。圖左數(shù)字表示標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker (KDa)，Ck :標(biāo)準(zhǔn)泛素化體外反應(yīng)系統(tǒng)中以GST蛋白作為對照反應(yīng)，圖上面數(shù)字表示層析后的不同餾分洗脫峰在標(biāo)準(zhǔn)泛素化體外反應(yīng)系統(tǒng)中作為E3源，以第40號餾分介導(dǎo)P12泛素化反應(yīng)的E3活性為最強(qiáng)。圖7. RNF8作為E3介導(dǎo)pl2泛素化反應(yīng)的確認(rèn)。A :純化后用于pl2泛素化反應(yīng)的帶His標(biāo)簽的RNF8融合蛋白在考馬司亮藍(lán)染色的SDS-PAGE膠上的分析。泳道I :標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker (KDa)，泳道2 =Ni柱純化后的His_RNF8融合蛋白(用箭頭表示)。B 驗證RNF8作為E3介導(dǎo)pl2泛素化反應(yīng)的Western Blot分析。Mix表示泛素反應(yīng)的預(yù)配混合物，含泛素、El (UBE1)、E2 (UbcH13/Uevla)、Ubiquitin aldehyde，ATP 能量再生系統(tǒng)、40 mMTris-HCl, pH 7.5，2 mM DTT, 5 mM MgCl2。His_RNF8 融合蛋白以 RNF8 表示，圖左數(shù)字表示標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker (KDa)，用抗泛素的多克隆抗體檢測到的pl2多泛素耦合物以短線所指示，耦合了兩個泛素分子的P12用pl2-Ub2表示，以此類推。實施方式 實驗材料
泛素反應(yīng)體外分析系統(tǒng)所用的泛素Ubiquitin、活化酶E1、結(jié)合酶E2、作為E3源的Hela細(xì)胞SlOO懼分,Ubiquitin aldehyde、ATP能量再生系統(tǒng)等均購自BostonBiochem公司;回收GST融合蛋白的Glutathione珠購自GE Healthcare Bio-Sciences公司；查找特異性識別靶蛋白P12的鏈激酶E3技術(shù)方案中所采用的免疫親和層析柱為本實驗室所制備(中國發(fā)明專利，申請?zhí)?201010556585. 7), Phenyl Sepharose疏水層析柱、Mono Q離子交換層析柱和Superdex 200分子篩層析柱均購自Amersham Biosciences Corporation ;兔源抗泛素多克隆抗體為Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品；GST_pl2和His_RFN8融合蛋白為江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院制備并保持，也可參照文獻(xiàn)制備(李驍?shù)?，中國生物工程雜志，2012，32(5):12-18;21^叩，S·，et al. , Cell Cycle, 2008，7(21) : 3399-3404)；其它常用實驗材料和試劑均為國產(chǎn)。實施例一泛素化修飾體外反應(yīng)系統(tǒng)的建立和E2的確定
體外泛素化反應(yīng)采用15 PL的反應(yīng)體系，含10 μδ泛素，30 nM UBE I, 20 ng ofUbiquitin aldehyde, Ix ENS，300 ng GST_pl2 作為基質(zhì)，HeLa S-100 餾分作為 E3 源，以 500 nM UbcH5c、UbcH2、UbcH3(Cdc34)以及 UbcH13/Uevla 復(fù)合物分別作為 E2 ;反應(yīng)緩沖液為5 mM MgCl2, 40 mM Tris-HCl, pH 7.5，2 mM DDT，同時以GST作為對照實驗。在30°C條件下反應(yīng)60分鐘，反應(yīng)結(jié)束時加入800 PL的Pull-down緩沖液(IxPBS中含0.5%NP-40)終止反應(yīng),然后加入10 Glutathione Sepharose_4B球珠,室溫下?lián)u晃60分鐘；再用Pull-down緩沖液洗球珠6次；加入I x SDS-PAGE的上樣緩沖液，95°C保溫5分鐘， 樣品經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜。用抗泛素的多克隆抗體檢測到的、被球珠吸附下的P12多泛素耦合物如圖IB所示，在已知El (UBEl)，用HeLa S-100作為E3源，以UbcH13/Uevla復(fù)合物(圖中以UbcH13表不)介導(dǎo)pl2的多泛素反應(yīng)信號最強(qiáng)。實施例二 經(jīng)第一級免疫親和層析后各餾分E3活性的確定
大約2X IO8個體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞，經(jīng)超聲裂解、4°C下高速離心后，取上清液為細(xì)胞裂解抽提液(所用的細(xì)胞裂解緩沖液為20 mM Tris-Cl, pH7. 8，0.5 mM EGTA, I mMEDTA, I mM MgCl, 50 mM NaCl, 10% Glycerol,蛋白酶抑制劑)。經(jīng)過如圖2所示的技術(shù)路線示意圖，通過4個層析柱組合來鑒定未知的E3。檢測各步層析洗脫餾分的E3活性，然后合并各E3活性峰并再通過下一個層析柱，在最后一步層析后，對含E3活性餾分峰進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，確定出特異性識別靶蛋白P12的E3。以UBEl為El，以經(jīng)實施例一所確定的UbcH13/Uevla復(fù)合物為E2，通過所建立的泛素反應(yīng)體外分析系統(tǒng)，對經(jīng)第一級免疫親和層析分離后各餾分E3活性進(jìn)行檢測。如圖3A所示，經(jīng)免疫親和層析，DNA Pol δ四亞基蛋白復(fù)合物從第12餾分到第30餾分被洗脫，層析過程中所用的洗脫液為TGEE (40 mM Tris-Cl, pH7. 8, 10% Glycerol, 0. 5 mM EGTA,
I mM EDTA )中含 400 mM NaCl 和 30% ethylene glycol。如圖 3B 所示，以 GST_pl2 為底物的E3活性主要存在于Ft餾分(過柱后的上清液Flow through)，在Pol δ四亞基蛋白復(fù)合物的洗脫峰15號餾分中未檢測到Ε3的活性。Pol δ四亞基蛋白復(fù)合物和Ε3活性已經(jīng)被分開。實施例三經(jīng)第二級Phenyl Sepharose疏水層析分離后各懼分Ε3活性的確定 將實施例二中的 Ft 在透析液 TGEED (TGEE+1 mM DDT) /500 mM ammonium sulfate 中
進(jìn)行透析，透析過的Ft再經(jīng)過Phenyl Sepharose疏水層析分離,用TGEED中含500 mM到
OmM ammonium sulfate進(jìn)行梯度洗脫,然后對各洗脫懼分中的E3活性進(jìn)行檢測。如圖4所示，以GST-pl2為底物的E3活性主要存在于第50號餾分。合并40 — 60餾分并在TGEED透析液中進(jìn)行透析以去除ammonium sulfate。實施例四經(jīng)第三級Mono Q離子交換層析分離后各餾分E3活性的確定將實施例三中在TGEED透析液中透析過的Phenyl Sepharose柱第40 — 60洗脫懼分再經(jīng)過Mono Q離子交換層析，用TGEED中含0-500 mM NaCl進(jìn)行梯度洗脫，并對各洗脫餾分中的E3活性進(jìn)行檢測。如圖5所示，以GST-pl2為底物的E3活性主要存在于第9_12號餾分。實施例五經(jīng)第四級Superdex 200分子篩層析分離后各餾分E3活性的確定 合并Mono Q離子交換層析柱洗脫懼分9 一 15,將其濃縮到250 μ L,然后經(jīng)過Superdex
200分子篩層析(洗脫液為TGEED中含100 mM NaCl),并對各洗脫餾分中的E3活性進(jìn)行檢測。如圖6所示，以GST-pl2為底物的E3活性主要存在于第40號餾分。含E3活性峰的第40號餾分經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，用手術(shù)刀將膠均勻切割成多個條帶，每個條帶經(jīng)胰蛋白酶消化后，分別在4800 Plus MALDI T0F/T0F質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析，利用MASCOT搜索引擎在NCBInr數(shù)據(jù)庫中匹配，查找特異性識別靶蛋白(Pol δ小亞基ρ12)的Ε3。經(jīng)過比對，成功地獲得唯一能夠作為Ε3功能的蛋白Ring Finger Protein (C3HC4 type) 8,即RNF8?！?br> 實施例六RNF8作為E3介導(dǎo)pl2泛素化反應(yīng)的確認(rèn)
如圖7A所示，由本實驗室制備并保存的、在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)并經(jīng)純化的帶His標(biāo)簽的RNF8作為E3，以代替實施例一中泛素化反應(yīng)體外系統(tǒng)中的Hela S100，30°C下反應(yīng)一小時，反應(yīng)結(jié)束后直接進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行的Western Blot分析結(jié)果如圖7B所示，RNF8能夠作為E3連接酶介導(dǎo)靶蛋白pl2發(fā)生多泛素化反應(yīng)，pl2的多泛素耦合物清晰可見，其介導(dǎo)P12泛素化修飾的E2/E3調(diào)控系統(tǒng)是UbcH13/Uevla/RNF8。綜上所述，利用本發(fā)明的技術(shù)路線，可以方便、準(zhǔn)確地從人細(xì)胞抽提物中確定出特異性識別靶蛋白的E3并介導(dǎo)靶蛋白進(jìn)行泛素化反應(yīng)的E2/E3系統(tǒng)。
權(quán)利要求
1.基于已知泛素活化酶El查找特異性介導(dǎo)靶蛋白泛素反應(yīng)結(jié)合酶E2和連接酶E3的方法，包括以下步驟 (1)建立泛素化修飾反應(yīng)的體外分析系統(tǒng)和E2的確定泛素反應(yīng)的體外分析系統(tǒng)是以經(jīng)純化的GST融合靶蛋白作為基質(zhì)，GST為對照，還包括泛素，一種已知的活化酶E1，結(jié)合酶E2，未知的連接酶E3，Ubiquitin aldehyde，ATP能量再生系統(tǒng)；E2的確定過程是將以上反應(yīng)混合物于反應(yīng)緩沖液中30°C下反應(yīng)60分鐘；反應(yīng)完成后，用Glutathione珠回收GST融合蛋白或GST的f禹合物,SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜后，以抗泛素的抗體Western Blot檢測革巴蛋白-泛素耦合物，從待選的多種E2中篩選出在已知El情況下介導(dǎo)靶蛋白多泛素化反應(yīng)最強(qiáng)的、與未知E3配對的E2 ； (2)對特異性識別靶蛋白的E3進(jìn)行查找人體細(xì)胞抽提液經(jīng)過免疫親和層析柱、Phenyl Sepharose疏水層析柱、Mono Q離子交換層析柱和Superdex 200分子篩層析柱4個不同性質(zhì)的層析柱，每一步層析后，運(yùn)用上述所建立的泛素反應(yīng)體外分析系統(tǒng)，對各洗脫餾分檢測E3的活性，合并含E3活性的洗脫餾分峰，再通過下一個層析柱，在最后一步層析后，對含E3活性餾分峰進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，確定出特異性識別靶蛋白的E3。
2.按照權(quán)利要求I所述方法，其特征在于在建立的泛素化反應(yīng)體外分析系統(tǒng)中所述的泛素活化酶El為商業(yè)化人源重組UBEl，未知的E3源為Hela細(xì)胞SlOO餾分。
3.按照權(quán)利要求I所述方法，其特征在于所述的用于篩選特異性介導(dǎo)靶蛋白泛素反應(yīng)的 E2 是 UbcH5c、UbcH2、UbcH3 (Cdc34)和 UbcH13/Uevla 復(fù)合物。
4.按照權(quán)利要求I所述方法，其特征在于所述的靶蛋白為人源DNA聚合酶δ小亞基Ρ12，并將其制備成帶GST標(biāo)簽的融合蛋白用作泛素化反應(yīng)體外分析系統(tǒng)中的基質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體而言，特指一種從人體細(xì)胞眾多E3中查找出特異性識別靶蛋白泛素連接酶E3和調(diào)控靶蛋白泛素化反應(yīng)的E2/E3系統(tǒng)的方法。該方法是先建立體外泛素化分析系統(tǒng)，通過已知的泛素活化酶E1和以HelaS100餾分作為E3源，篩選出介導(dǎo)靶蛋白泛素反應(yīng)的結(jié)合酶E2；再采用多重層析柱組合，結(jié)合質(zhì)譜分析，從人體細(xì)胞中查找特異性識別靶蛋白的泛素連接酶E3和調(diào)控靶蛋白泛素化修飾的E2/E3系統(tǒng)。通過這種方法，可以方便、準(zhǔn)確地查找出識別靶蛋白的底物識別因子－泛素連接酶E3；建立介導(dǎo)靶蛋白泛素化修飾的E2/E3調(diào)控系統(tǒng)。
文檔編號G01N33/68GK102936618SQ20121040158
公開日2013年2月20日 申請日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者張倩, 周亞竟, 陳慧卿, 陳克平, 麥維軍, 劉曉勇, 何遠(yuǎn)清, 李國輝, 張磊, 劉留, 樊曉婷, 宋惠芳 申請人:江蘇大學(xué)