專利名稱：Paa蛋白及由其制備的抗體與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及Paa蛋白及由其制備的抗體與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhage E. coli,EHEC)是毒力最強、致病性也最強的大腸桿菌，受到廣泛的關(guān)注。EHEC感染可使人患腹瀉、出血性結(jié)腸炎(HC)，還可引發(fā)溶血性尿毒綜合癥(HUS)及血栓性血小板減少紫癜(TTP)等嚴重并發(fā)癥，嚴重者可導(dǎo)致死亡，致死率達5% 10%。2011年4月，德國暴發(fā)了腸出血性大腸桿菌0104 :H4感染和溶血性尿毒綜合征(HUS)疫情，蔓延到歐洲和北美洲的16個國家。同年四、五月間，日本富山地區(qū)暴發(fā)了新感染疫情，血清型為0111，某些病例在引起HUS之后，出現(xiàn)了神經(jīng)癥狀，并發(fā)彌散型血管內(nèi)凝血和腦病。在EHEC中，致病性強、危害大的還有0157 :H7。自1975年被首次分離、1982年被確認為致病菌以來的20多年中，世界各地包括中國都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行。 1999年在我國江蘇、安徽兩省有過大規(guī)模暴發(fā)流行，患者超過2萬例，死亡177例。EHEC感染已經(jīng)成為歐美國家兒童腎衰的首位病因，對人們的健康構(gòu)成了巨大威脅。另外，作為一種重要的人獸共患病病原體，EHEC病原菌可長期駐留于牛、羊、豬、雞等家畜家禽的腸道中，造成動物的腹瀉，并污染畜禽的肉奶蛋制品以及水源和農(nóng)作物等，給農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的損失。因此，EHEC感染已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題。目前，臨床針對EHEC感染主要采取對癥治療，因為抗生素治療具有加劇病情的危險性而被謹慎使用，沒有可以使用的疫苗和特異治療藥物。疫苗被認為是應(yīng)對EHEC暴發(fā)流行和散發(fā)感染最簡單，經(jīng)濟，快捷的手段。如果能發(fā)現(xiàn)和獲得核心抗原或優(yōu)勢保護性抗原，就可以進一步發(fā)展為新型疫苗。黏附定植是細菌感染損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，細菌黏附于宿主上皮細胞導(dǎo)致A/E(Attaching and effacing, Α/E)病變。Tir、Intimin、Map、EspF、EspG、EspH、SepZ、EspB都是已被公認的由LEE編碼的效應(yīng)分子，都參與EHEC的Α/E損傷。但研究人員發(fā)現(xiàn)仍然存在另一些非LEE編碼的效應(yīng)分子。Paa (porcine attaching and effacing associated)為 753bp 基因編碼的27. 6kDa蛋白，序列分析發(fā)現(xiàn)paa基因編碼蛋白的氨基酸序列在0157 H7EDL933和Saikai中完全一致。染色體定位技術(shù)發(fā)現(xiàn)包含paa基因的區(qū)域位于染色體上,在yciD和yciE之間。Theresa等發(fā)現(xiàn)paa基因的EHEC缺失突變株會降低對hela細胞的黏附，同時也會降低某些細胞表面蛋白的分泌，這些蛋白有些對EHEC的分泌系統(tǒng)是不可或缺的，而這些分泌系統(tǒng)是EHEC黏附細胞的重要保障，所以Paa與EHEC的黏附有著某些關(guān)系。目前，多國科學(xué)家針對Paa蛋白的黏附功能和分子機制正展開研究，但迄今為止，還沒有從免疫學(xué)角度上證實Paa分子在細菌感染檢測、免疫防護方面的作用和功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供Paa蛋白的新用途。
本發(fā)明提供的Paa蛋白在制備具有如下I) _3)中至少一種功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用I)預(yù)防和/或治療由病原菌EHEC感染或引發(fā)的疾??；2)降低病原菌EHEC對腸道感染損傷；3)降低病原菌EHEC在腸道定值力；所述Paa蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述應(yīng)用中,所述產(chǎn)品為疫苗或藥物。上述應(yīng)用中，所述腸道為人或動物腸道，在本發(fā)明的實施例中動物腸道為小鼠腸道；所述病原菌EHEC為EHEC 0157 :H7。 Paa蛋白作為靶標或檢測標志物在開發(fā)或制備診斷感染病原菌EHEC的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍；在上述應(yīng)用中，所述Paa蛋白的氣基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的另一個目的是提供一種產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為Paa蛋白；所述產(chǎn)品為具有如下I) -3)中至少一種功能的產(chǎn)品I)預(yù)防和/或治療由病原菌EHEC引發(fā)疾病；2)降低病原菌EHEC對腸道感染損傷；3)降低病原菌EHEC在腸道定值力。4)檢測病原菌EHEC的感染。由Paa蛋白作為抗原制備的抗體也是本發(fā)明保護的范圍；所述Paa蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。檢測Paa蛋白的產(chǎn)品在制備用于診斷病原菌EHEC產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍；所述病原菌EHEC具體為EHEC 0157 H7 ;上述檢測Paa蛋白的產(chǎn)品具體為上述的抗體。上述的抗體在制備提高宿主抗病原菌EHEC感染產(chǎn)品或提高宿主抗病原菌EHEC黏附產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍；上述應(yīng)用中，所述宿主具體為人或動物；宿主尤其具體為人或動物內(nèi)的細胞；所述病原菌EHEC具體為EHEC 0157 H7 ;在本發(fā)明的實施例中，用來證明提高宿主抗病原菌EHEC黏附是通過hela細胞作為宿主進行試驗的。本發(fā)明的第三個目的是提供一種產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為上述的抗體；所述產(chǎn)品為具有如下I) -3)中至少一種功能的產(chǎn)品I)用于檢測病原菌EHEC ；2)提高宿主抗病原菌EHEC感染；3)提高宿主抗病原菌EHEC黏附；其中宿主具體為人或動物；宿主尤其具體為人或動物內(nèi)的細胞；所述病原菌EHEC具體為EHEC 0157 H7 ;在本發(fā)明的實施例中，用來證明提高宿主抗病原菌EHEC黏附是通過hela細胞作為宿主進行試驗的。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明通過基因工程技術(shù)克隆獲取Paa蛋白的編碼基因、重組表達和純化Paa蛋白，體內(nèi)外評估Paa蛋白的免疫學(xué)功能等實驗研究,證實(I) Paa蛋白可被0157 :H7感染血清所特異的、高效的識別，是EHEC病原菌重要的核心抗原，可作為抗原試劑用于感染診斷；(2)Paa免疫的小鼠能夠減少腸道里EHEC的定植；(3)Paa蛋白免疫的小鼠可以抵制0157 H7攻毒，表明該蛋白可以作為針對EHEC弓丨發(fā)疾病的疫苗；(4) Paa蛋白可用來制備抗體或抗血清，該抗體或抗血清可以特異識別EHEC菌體蛋白，能夠作為抗體試劑檢測EHEC病原菌；(5)Paa蛋白的抗體或抗血清能夠拮抗EHEC病原菌對靶細胞的黏附效應(yīng)，有效干預(yù)病原菌在腸道的定植，從而顯著減低或幾乎完全抑制病原菌感染對機體造成的損傷；(6) Paa蛋白可激發(fā)機體產(chǎn)生特異應(yīng)答，具有高水平的免疫原性，通過誘導(dǎo)高效免疫效應(yīng)，抵抗病原菌感染所造成的損傷或死亡。


圖I為Paa的純化蛋白及WB印跡圖2為抗體效價隨免疫次數(shù)及間隔時間變化監(jiān)測圖3為免疫小鼠血清中IgA及IgG亞型的檢測·圖4為攻毒后小鼠排泄物中排菌量的檢測圖5為抗Paa抗血清的WB檢驗圖6為Paa抗血清對細胞的抗黏附率
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。部分材料如下I、載體與菌株EHEC 0157 :H7EDL933株可由ATCC提供，目錄號700927 ;公眾也可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所獲得，該菌株EDL933株記載在L. ff. Riley,R. S. Remis, S. D. Helgerson, H. B. McGee, J. G. Wells, B. R. Davis, R. J. Hebert, E.
S.Olcott, L. M. Johnson, N. T. Hargrett, P. A. Blake, M. L. Cohen, Hemorrhagic colitisassociated with a rare Escherichia coli serotype, N. Engl, J. Med. 308 (1983)681685.中。pEASY-Tl 載體、E. coli DH5a、E.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細胞購自 TransGen 公司，pET_22b (+)購自 Novagen。2、試劑與培養(yǎng)基NdeI和XhoI限制性核酸內(nèi)切酶及T4連接酶購自NEB公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG抗體及HRP標記的組氨酸抗體購自Pierce公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgGl抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG2a、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG2b抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG3抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgA抗體均購自Sigma公司；PCR所用的Taq酶以及DNAmarker (DL2000)購自TransGen公司；質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自北京博邁德公司；其他化學(xué)試劑均為化學(xué)純或分析純；鎳柱購自GE公司。
EHEC 0157 :H7 細菌培養(yǎng)采用 Luria-Bertani (LB, OxoidLTD, Basingstok,Hampshire, England)液體培養(yǎng)基及LB平板。工程菌培養(yǎng)均采用含氨芐青霉素終濃度100 μ g/ml的LB液體培養(yǎng)基及LB平板。3、生化與分子生物學(xué)試劑山梨醇麥康凱基礎(chǔ)瓊脂及山梨醇麥康凱瓊脂添加劑購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；DEME培養(yǎng)基購自GIBCO公司；標準胎牛血清購自Biochrom公司；雙抗購自Hyclone 公司。4、配制方法LB培養(yǎng)基的配制方法(IL) :Nacl IOg ;酵母粉5g ;蛋白胨10g。表1SDS-PAGE分離膠與濃縮膠的配制方法
權(quán)利要求
1.Paa蛋白在制備具有如下I) -3)中至少一種功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用 O預(yù)防和/或治療由病原菌EHEC感染或引發(fā)的疾病； 2)降低病原菌EHEC對腸道感染損傷； 3)降低病原菌EHEC在腸道定值力； 所述Paa蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)品為疫苗或藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述腸道為人或動物腸道；所述病原菌EHEC 為 EHEC 0157 :H7。
4.Paa蛋白作為靶標或檢測標志物在開發(fā)或制備診斷感染病原菌EHEC的產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述Paa蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
5.一種產(chǎn)品，其活性成分為Paa蛋白；所述Paa蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2； 所述產(chǎn)品為具有如下I)-4)中至少一種功能的產(chǎn)品 1)預(yù)防和/或治療由病原菌EHEC引發(fā)疾?。? 2)降低病原菌EHEC對腸道感染損傷； 3)降低病原菌EHEC在腸道定值力。
4)檢測病原菌EHEC的感染。
6.由Paa蛋白作為抗原制備的抗體；所述Paa蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
7.根據(jù)權(quán)利要6所述的抗體，其特征在于所述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。
8.檢測Paa蛋白的產(chǎn)品在制備用于診斷病原菌EHEC產(chǎn)品中的應(yīng)用；所述病原菌EHEC具體為EHEC 0157 H7 ;所述檢測Paa蛋白的產(chǎn)品具體為所述權(quán)利要求6或7所述的抗體。
9.權(quán)利要求6或7所述的抗體在制備提高宿主抗病原菌EHEC感染產(chǎn)品或提高宿主抗病原菌EHEC黏附產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述宿主具體為人或動物；所述病原菌EHEC具體為EHEC 0157 :H7。
10.一種產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求6或7所述的抗體； 所述產(chǎn)品為具有如下I)-3)中至少一種功能的產(chǎn)品 1)用于檢測病原菌EHEC； 2)提高宿主抗病原菌EHEC感染； 3)提高宿主抗病原菌EHEC黏附； 所述宿主具體為人或動物；所述病原菌EHEC具體為EHEC 0157 :H7。
全文摘要
本發(fā)明公開了Paa蛋白及由其制備的抗體與應(yīng)用。本發(fā)明提供Paa蛋白在制備具有如下1)-3)中至少一種功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用1)預(yù)防和/或治療由病原菌EHEC引發(fā)疾病；2)降低病原菌EHEC腸道感染損傷；3)降低病原菌EHEC在腸道定值力；所述Paa蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明通過基因工程技術(shù)克隆獲取Paa蛋白的編碼基因、重組表達和純化Paa蛋白，體內(nèi)外評估Paa蛋白的免疫學(xué)功能等實驗研究，Paa蛋白可被O157H7感染血清所特異的、高效的識別，是EHEC病原菌重要的核心抗原，可作為抗原試劑用于感染診斷；Paa蛋白免疫的小鼠可以抵制O157H7攻毒，表明該蛋白可以作為針對EHEC引發(fā)疾病的疫苗。
文檔編號G01N33/569GK102940875SQ20121042855
公開日2013年2月27日 申請日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者王慧, 李濤, 王琴, 韓燃 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所