一種藥物凝膠劑中蛋白含量的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測藥物凝膠劑中藥物蛋白含量的檢測方法，其特征在于從凝膠中釋放藥物蛋白時，先將凝膠稀釋或不經(jīng)稀釋，加入含有鈣離子的溶液作為釋放劑，鈣離子加入濃度范圍為：0.015mol/L-0.15mol/L。使凝膠迅速沉淀，同時使藥物蛋白從凝膠中全部釋放出來，以便更準(zhǔn)確測定藥品中藥物蛋白的含量和生物活性效價。此方法適用于以卡波姆作為其凝膠基質(zhì)的凝膠劑藥品中藥物蛋白含量的檢測，例如重組人堿性成纖維細胞生長因子凝膠劑中rh-bFGF含量的檢測。此方法簡單準(zhǔn)確、重復(fù)性強。
【專利說明】一種藥物凝膠劑中蛋白含量的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種藥物凝膠劑中蛋白含量的檢測方法，適用于以卡波姆為凝膠基質(zhì)的凝膠劑藥品中藥物蛋白含量的檢測，特別適用于檢測重組人堿性成纖維細胞生長因子(以下簡稱rh-bFGF)凝膠劑中rh-bFGF的含量。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有的藥物凝膠劑，特別是蛋白類及多肽類藥物的凝膠制劑，大多都是以卡波姆為凝膠基質(zhì)的凝膠劑。部分此類凝膠劑藥品中藥物蛋白含量非常微量，有的制劑每克凝膠只含有十幾微克的藥物蛋白。由于很難使束縛在三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的卡波姆水凝膠中微量的藥物蛋白全部釋放出來，因此在檢測此類凝膠劑藥物含量時無法準(zhǔn)確測定藥品中藥物蛋白的含量和生物活性。
[0003]目前檢測凝膠劑中活性蛋白含量的方法，大多是稱取一定量的藥物凝膠，加入無菌生理鹽水，以噴管輕輕吹打，室外溫放置30min左右，然后離心取上清，最后測定上清中藥物蛋白含量。
[0004]上述方法的缺點是:凝膠基質(zhì)卡波姆的膠體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，僅憑吹打不能使凝膠中的藥物蛋白完全釋放，同時釋放量難以控制，繼而導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確，重復(fù)性差，在藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中應(yīng)用受限。
[0005]由于此方法無法使微量的藥物蛋白從凝膠中全部釋放出來，所以此法在用于測定凝膠中含有蛋白尤其是微量蛋白時的蛋白含量時，結(jié)果更不可靠，無法滿足方法學(xué)研究的要求。
[0006]因此，發(fā)明一種既簡單又準(zhǔn)確的檢測凝膠劑中藥物蛋白含量的方法是十分必要的。
[0007]我們以“重組人堿性成纖維細胞生長因子(rh-bFGF)凝膠”為例，對藥物凝膠劑中蛋白含量的檢測方法進行了深入研究，發(fā)明了一種藥物凝膠劑中蛋白含量的檢測方法，適用于以卡波姆為凝膠基質(zhì)的凝膠劑藥品中藥物蛋白含量的檢測方法。
[0008]重組人喊性成纖維細胞生長因子(Recombinanthuman basic Fibroblast GrowthFactor,rh-bFGF)凝膠”是一種可以直接涂抹在因創(chuàng)傷(如手術(shù)傷、燒傷、燙傷、潰瘍)的損傷創(chuàng)面上，能促進創(chuàng)面組織愈合，縮短愈合時間的凝膠劑藥物。
[0009]喊性成纖維細胞生長因子(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)具有深層修復(fù)的功能，是廣泛存在在人體內(nèi)的一種蛋白，bFGF是由146個氨基酸組成的單鏈多肽，分子量為17KD。它是一種與組織創(chuàng)傷的愈合過程密切相關(guān)的內(nèi)源性活性因子，對組織創(chuàng)傷愈合、神經(jīng)損傷修復(fù)及血管再生有顯著的促進作用。北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司直接從中國人外周血白細胞中克隆出人bFGF的cDNA，并實現(xiàn)了 bFGF的基因克隆與表達，成功研制出重組人bFGF的各種臨床應(yīng)用劑型，作為組織創(chuàng)傷愈合藥物用于臨床多個專業(yè)科室。
[0010]卡波姆(Carbomer)水凝膠是一種新型水凝膠，具有無毒、黏附力強和應(yīng)用方便等優(yōu)點。卡波姆水凝膠膠體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可高壓蒸汽滅菌，不分解，粘度不變，對包裹的生物活性物質(zhì)有較強的耦合性，能夠較好地保持多肽或蛋白質(zhì)生物活性。
[0011]rh-bFGF凝膠采用卡波姆作為凝膠基質(zhì)?？ú匪z為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，藥物溶解在其中，這樣可以使rh-bFGF更加穩(wěn)定,藥物緩慢釋放，同時能吸收創(chuàng)面滲液，形成高度親水的凝膠劑，從而控制創(chuàng)面的分泌和細菌的感染，同時加快藥物的溶出，在一定程度上起到緩釋作用，使其作用更加持久，促進創(chuàng)面組織愈合，加快愈合速度，使rh-bFGF的作用更加直接有效。
[0012]當(dāng)前rh-bFGF凝膠劑中rh-bFGF生物活性效價的檢測方法原理為:重組人堿性成纖維細胞生長因子對小鼠的胚胎成纖維細胞生長具有刺激作用，故而可以用于重組人堿性成纖維細胞生長因子的生物活性測定。將一定量的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入同批次，同生長狀態(tài)的小鼠胚胎成纖維細胞中，培養(yǎng)一段時間，考察其生長狀態(tài)和參數(shù)，就可測定其效價。但是在實際操作中，測定的結(jié)果差異很大。經(jīng)分析，不能準(zhǔn)確測定的原因是，現(xiàn)有檢測方法不能使rh-bFGF從凝膠中全部釋放出來。
[0013]在含量檢測方面，由于rh-bFGF是一種細胞生長因子，在人體內(nèi)含量甚微，發(fā)揮藥效的劑量也很低，所以藥品制劑中每克rh-bFGF凝膠中含有的rh-bFGF很低(只有12 μ g左右)。
[0014]建立準(zhǔn)確測定蛋白多肽類藥物凝膠制劑中，蛋白質(zhì)及多肽藥物的含量及活性的方法，是當(dāng)前此類藥物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】的重要課題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明的目的在于提供一種檢測藥物凝膠劑中蛋白含量的檢測方法，其特征在于從凝膠中釋放藥物蛋白時，先將凝膠稀釋或不稀釋，加入含有鈣離子的溶液作為釋放劑，鈣離子加入濃度范圍為0.015mol/L-0.15mol/L。含有鈣離子的溶液使凝膠迅速沉淀，同時使藥物蛋白從凝膠中全部釋放出來，能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確測定凝膠劑藥品中藥物蛋白的含量和生物活性效價。此方法適用于以卡波姆作為凝膠基質(zhì)的凝膠劑藥品中藥物蛋白含量的檢測，特別適用于檢測rh-bFGF凝膠劑中rh-bFGF含量的檢測。
[0016]本發(fā)明的關(guān)鍵在于，在保持藥物蛋白的生物活性的基礎(chǔ)上，找出使藥物蛋白從凝膠中全部釋放出來的方法。
[0017]本發(fā)明的解決方案:
[0018]首先我們對卡波姆凝膠進行了外觀形貌觀察、溶脹性能的測試，發(fā)現(xiàn)成膠前溶液有一定流動性，而當(dāng)加入帶有三乙醇胺的混合溶液后成為膠體流動性明顯減弱。這是由于三乙醇胺的加入使成膠前溶液的pH值增加，卡波姆分子的羧基開始離子化，負電荷的相互排斥使卡波姆分子鏈逐漸彌散伸展，使其粘度增加成為膠體。
[0019]接著我們做了干凝膠在不同電解質(zhì)溶液中的溶脹性試驗，發(fā)現(xiàn)干凝膠在等物質(zhì)量的葡萄糖、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣溶液的溶脹率依次為葡萄糖> Na+ = K+ > Ca2+，干凝膠在不同電解質(zhì)的溶脹曲線見附圖1。
[0020]因為葡萄糖溶液分散于水凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，葡萄分子糖和水分子與凝膠分子形成氫鍵使其交聯(lián)度增加，溶脹率增加。理論上講，一價鈉、鉀離子吸附在凝膠中的羧基上，降低負電荷的相互排斥作用，使其溶脹率降低，但實驗結(jié)果表明:凝膠溶脹率僅有略微下降，可能與卡波姆的鈉、鉀絡(luò)合物仍舊可溶有關(guān)。二價鈣離子能與卡波姆生成絡(luò)合物，此絡(luò)合物不溶于水，使干凝膠幾乎不溶脹。溶脹初期僅部分鈣離子被吸附凝膠的表面，所以開始時凝膠溶脹率略有增加。隨著溶脹時間的增長，大量不溶性絡(luò)合物生成，溶脹曲線下降。當(dāng)加入氯化鈣溶液后，隨時間的增長，凝膠收縮成團。我們利用離心超濾對樣品進行濃縮并除去小分子雜質(zhì)。離心超濾采用離心超濾管，其有一個類似于內(nèi)管和外管的兩個部分，內(nèi)管中是帶有一定分子量的超濾膜，當(dāng)高速離心時，分子量比它小的就漏到下面的管子(即外管)中了，分子量比它大的就截留在上面(即內(nèi)管中)。把離心超濾管中的溶液進行離心、超濾后再檢測濾液中的藥物蛋白的含量。
[0021]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)釋放蛋白時先把蛋白凝膠先溶解，然后再加入氯化鈣溶液，加入鈣離子可使凝膠迅速沉淀，I丐離子加入濃度范圍0.015mol/L-0.15mol/L。有利于蛋白的釋放。實驗結(jié)果顯示，樣品中的非蛋白物質(zhì)經(jīng)離心、超濾后基本上被濾出，凝膠中的蛋白釋放到濾液中的蛋白釋放量達99%以上。即使藥物蛋白從凝膠中全部釋放出來。
[0022]讓凝膠中藥物蛋白全部釋放出來的具體操作方法:
[0023]1、取一定量藥物凝膠劑加入4mL的0.9 %的NaCl水溶液混合均勻。
[0024]2、再加入ImL的0.15mol/mL的CaCl2溶液混合均勻，并放置10分鐘，使凝膠基質(zhì)收縮沉淀，使藥物蛋白從凝膠中全部釋放出來。
[0025]3、然后放入離心管用恒溫高速心機離心(溫度4°C，離心力3000g，IOmin)取上層清液。這時凝膠中的藥物蛋白就全部釋放在上清液中。
[0026]然后再用微量酶標(biāo)儀法檢測上清液中藥物蛋白的含量。
[0027]這樣準(zhǔn)確檢測上清液中藥物蛋白的含量和生物活性效價，就可用于準(zhǔn)確控制凝膠劑中蛋白含量和生物活性效價指標(biāo)。
[0028]本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果:
[0029]1、本發(fā)明檢測方法設(shè)計合理，簡單準(zhǔn)確、重復(fù)性強，可以用作凝膠劑中藥物蛋白含量的檢測。
[0030]2、本發(fā)明采用的試驗試劑、儀器，普通通用、容易掌握操作。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0031]圖1.為卡波姆凝膠在不同電解質(zhì)溶脹曲線。由圖可知干凝膠在等物質(zhì)量的葡萄糖、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣溶液的溶脹率依次為葡萄糖> Na+ = K+ > Ca2+。
[0032]圖2.為以rh-bFGF標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)、540nm光吸收值為橫坐標(biāo)，依據(jù)測得數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線
【具體實施方式】
[0033]實施例1
[0034]以檢測重組人堿性成纖維細胞生長因子(rh-bFGF)凝膠劑中rh-bFGF的含量為實施例。
[0035]bFGF凝膠劑是北京雙鷺?biāo)帢I(yè)最新上市的治療組織創(chuàng)傷愈合藥物新藥產(chǎn)品。rh-bFGF外用凝膠劑每支含5g rh-bFGF凝膠,每Ig含5000IU rh-bFGF。
[0036]1、其工藝處方為:
【權(quán)利要求】
1.一種檢測藥物凝膠劑中蛋白含量的檢測方法，其特征在于從藥物凝膠中釋放藥物蛋白時，先將凝膠稀釋或不經(jīng)稀釋，加入含有鈣離子的溶液作為釋放劑，同時使藥物蛋白從凝膠中全部釋放出來，以便更準(zhǔn)確測定藥品中藥物蛋白的含量和生物活性效價。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測藥物凝膠劑中蛋白含量的檢測方法，其特征在于:釋放劑為含有鈣離子的溶液。。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測藥物凝膠劑中蛋白含量的檢測方法，其特征在于:加入鈣離子濃度范圍為:0.015mol/L----0.15mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測藥物凝膠劑中蛋白含量的檢測方法，其特征在于:適用于以卡波姆作為凝膠基質(zhì)的凝膠劑藥品中蛋白含量的檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測藥物凝膠劑中蛋白含量的檢測方法，其特征在于:適用于凝膠劑藥品中蛋白含量的檢測，例如重組人堿性成纖維細胞生長因子凝膠劑中rh-bFGF含量的檢測 。
【文檔編號】G01N1/28GK103792113SQ201210429361
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月1日
【發(fā)明者】徐明波, 吳彥卓, 陳獻華, 徐霞, 王俊玲, 楊仲璠, 秦富景, 白福英, 倪娜, 趙紫嶺, 劉瓊 申請人:北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司, 徐霞, 北京雙鷺生物技術(shù)有限公司