專利名稱:一種生物標(biāo)記物-蚯蚓體內(nèi)cyp3a4活性的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物標(biāo)記物的檢測,具體地說是一種生物標(biāo)記物-蚯蚓體內(nèi)CYP3A4活性的測定方法。
背景技術(shù):
CYP3A4是細胞色素P450 (CYP)酶系的一類同工酶,即亞酶,屬于CYP酶系中含量最為豐富的酶之一,在人類肝臟和腸道的CYP系統(tǒng)中占據(jù)主要的地位,對許多外源物質(zhì)的代謝解毒發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,可參與大約38個類別共150多種藥物的代謝,約占全部藥物的50%,在臨床醫(yī)學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用(文獻I.冷欣夫,邱星輝.細胞色素P450酶系的結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用前景·科學(xué)出版社.2001:P2 ;文獻2.Belle,DJ,et al. (2002). Theeffects of an oral contraceptive containing ethinyloestradioI and norgestrelon CYP3A activity. British Journal of Clinical and Pharmacology. 53:p. 67-74.)。從環(huán)境科學(xué)的角度來看,CYP酶系是很多污染物的特異性誘導(dǎo)劑或抑制劑。利用生物代謝過程中CYP酶活性與污染物毒性之間顯著的響應(yīng)關(guān)系,可將CYP酶系作為生物標(biāo)記物,進行環(huán)境污染的早期診斷(文獻3. Andersson, T. and L. Forlin, RE⑶LATION OF THECYT0CHR0ME-P450ENZYME-SYSTEM IN FISH. Aquatic Toxicology,1992. 24(1-2):p. 1-19.文獻 4. Bucheli, T. D. and K. Fent, INDUCTION OF CYT0CHR0ME-P450AS A BIOMARKERFOR ENVIRONMENTAL ⑶ΝΤΑΜΙΝΑΤΙ0Ν IN AQUATIC E⑶SYSTEMS. Critical Reviews inEnvironmental Science and Technology, 1995. 25 (3) :p. 201-268. ) 在眾多的 CYP 亞酶中,環(huán)境科學(xué)家對CYPlAl的研究最為青睞,近年來進行了大量的研究,涉及的污染物包括多環(huán)芳烴(PAHs)、多氯聯(lián)苯(PCBs)、二噁英類(IODD)及重金屬等(文獻5. Ueng,Y.F. , et al. , Effects of cadmium and environmental pollution on metallothioneinand cytochrome P450in Tilapia. Bulletin of Environmental Contamination andToxicology, 1996. 57(1) :p. 125-131),主要采用EROD活性的方法對環(huán)境污染物誘導(dǎo)下魚類肝臟中CYPlAl活性的變化進行研究,以此作為生物標(biāo)記物監(jiān)測水生環(huán)境的污染狀況。如王詠等測定了 PAHs誘導(dǎo)下鯉魚肝微粒體EROD的活性變化,以此進行水體污染早期診斷的研究(文獻6.王詠,王春霞,徐靜波.多環(huán)芳烴化合物對鯉魚肝微粒體EROD的體外誘導(dǎo).環(huán)境科學(xué)學(xué)報.2000. 20 (增刊)p. 176-180)。而對CYP3A4的研究主要集中在藥物代謝及其相互作用的機理方面(文獻7. Afshar, M. and ff. Thormann, Capillaryelectrophoretic investigation of the enantioselective metabolism of propafenoneby human cytochrome P-450SUPERS0MES Evidence for atypical kinetics by CYP2D6andCYP3A4. Electrophoresis, 2006. 27 (8):p.1526-1536 ;文獻 8. Araki, N. , et al. , HumanCYP3A4_introduced HepG2cells: In vitro screening system of new chemicals forthe evaluation of CYP3A4_inhibiting activity. Xenobiotica, 2008.38 (11):p.1355-1364 ;文獻 9. Boobis, A. R.,et al. , Interlaboratory comparison of the assessmentof P450activities in human hepatic microsomal samples. Xenobiotica, 1998. 28(5):p. 493-506 ;文獻 10.Choi,I.,et al. , Classification models for CYP450 3A4inhibitors and non-inhibitors. European Journal of Medicinal Chemistry,2009. 44(6) :p. 2354-2360 ;文獻 11. Falzoi,Μ·,et al.,Multiplex genotyping ofCYP3A4,CYP3A5,CYP2C9 and CYP2C19 SNPs using MALDI-T0F mass spectrometry. Pharmacogenomics, 2010. 11(4) :p. 559-571.),有關(guān)環(huán)境污染物對CYP3A4活性影響的研究至今未見報道。作為分布廣泛、含量如此豐富的一種CYP酶,準(zhǔn)確地評價CYP3A4活性與污染物之間的響應(yīng)關(guān)系將對環(huán)境污染的生態(tài)毒理研究具有重要的意義。有關(guān)土壤污染早期診斷的生物標(biāo)記物研究近年來受到越來越多的關(guān)注。與傳統(tǒng)毒理方法相比,生物標(biāo)記物可以提供污染物對生物體健康潛在影響的更為全面的生物相關(guān)信息(文獻 12. Calisij A. , M. G. Lionettoj and T. Schettinoj Biomarker responsein the earthworm Lumbricus terrestris exposed to chemical pollutants.Science of The Total Environment, 2011. 409(20) :p. 4456-4464.),因此,可以作為土壤污染監(jiān)測的敏感指標(biāo)起到早期的預(yù)警作用。蚯蚓在土壤中分布廣泛,約占土壤總生物量的 60%_80% (文獻 13. Saint-Denis,M.,et al.,Biochemical responses of theearthworm Eisenia fetida andrei exposedto contaminated artificial soil: effectsofbenzo (a)pyrene. Soil Biology&Biochemistry,1999. 31 (13):p. 1837-1846. ) 它能夠與土壤中的孔隙水直接接觸,進而與土壤中污染物的生物有效態(tài)直接接觸,因此常將其作為土壤生態(tài)毒理評價的模式生物(文獻14. van Gestelj C. A. Μ.,et al.,Effectsof metal pollution on earthworm communities in a contaminated floodplainarea:Linking biomarker, community and functional responses. EnvironmentalPollution,2009. 157(3) :p. 895-903 ;文獻 15. DJ,S.,W. JM,and V. G. C. A. M. , Asummaryof eleven years progress in earthworm ecotoxicology PED0BI0L0GIA,2003. 47:p.588-606.),對于土壤環(huán)境監(jiān)測具有重要的作用(文獻16. Manerikarj R. S.,A. A. Aptej andV. S. Gholej In vitro and in vivo genotoxicity assessment of Cr (VI) using cometassay in earthworm coelomocytes. Environmental Toxicology and Pharmacology,2008. 25 (I) : p. 63-68 ;文獻 17. Reineckej S. A. and A. J. Reineckej The comet assay asbiomarker of heavy metal genotoxicity in earthworms. Archives of EnvironmentalContamination and Toxicology,2004. 46(2):p. 208-215 ;文獻 18. Massicotte,R.,etal.,Immunotoxicological response of the earthworm Lumbricus terrestrisfollowing exposureto cement kiln dusts. Ecotoxicology and Environmental Safety,2004. 59(1) :p. 10-16.)。目前,蚯蚓的毒理診斷試驗多利用其在不同污染狀態(tài)下生存、生長和繁殖等個體水平上的響應(yīng)(如蚯蚓急性致死率和慢性體重抑制率等)來反映環(huán)境狀況。然而,隨著生態(tài)毒理診斷研究的深入開展,這些指標(biāo)已不能滿足低劑量污染條件下毒理診斷的需要,尋求更為敏感的生物標(biāo)記物是土壤生態(tài)毒理學(xué)研究向細胞、分子水平發(fā)展的新的重要內(nèi)容,也是生態(tài)風(fēng)險評價的基本要素。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種生物標(biāo)記物-蚯蚓體內(nèi)CYP3A4活性的測定方法。為實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種生物標(biāo)記物-蚯蚓體內(nèi)CYP3A4活性的測定方法,I)將蚯蚓微粒體溶解在2 3ml保存緩沖液中混勻,待用;2)取20 30 μ I步驟I)的微粒體溶液并加入120 140 μ I反應(yīng)液和10 30 μ I底物液混勻,混勻后于25 35°C預(yù)熱5 lOmin,預(yù)熱后再加入20 40 μ INADPH溶液反應(yīng)2(T30min后加入10(Γ 20μ I預(yù)冷的甲醇終止反應(yīng);3)將步驟2)中的產(chǎn)物混合液混勻,在T5°C以400(T5000rpm離心l(T20min,上清
液用于測定產(chǎn)物含量。所述步驟3)離心收集的上清液用于測定產(chǎn)物含量,以單位時間內(nèi)每毫克微粒體蛋白生成的產(chǎn)物量表示酶活性大小(nmol/mgPr/min)。所述產(chǎn)物含量的測定是采用HPLC法,流動相為甲醇和水,按體積比為40:60 60:40,流速 Γ1. 5ml/min,檢測波長為 250 260nm。所述步驟I)中保存緩沖液組成為250mmol/L鹿糖,50mmol/L Tris pH7. 5, lmmol/L DTT, lmmol/L EDTA,20% 甘油。將蚯蚓微粒體溶解在2 3ml保存緩沖液中混勻,混勻后取出30(Γ500 μ I用于測定蛋白含量,其余部分于-7(T-80°C中保存待用。所述步驟2)中反應(yīng)液的組成為0. f0. 15mol/L磷酸鉀緩沖溶液(1^#04與K2HPO4) pH7. 4,4 5mmol/L 葡萄糖-6-憐酸,4 5mmol/LMgCl2,0. 5 lU/ml 葡萄糖-6-憐酸脫氫酶。所述步驟2)中底物液為0. 5 lmmol/L的睪酮溶液。所述睪酮用乙腈溶解,再用磷酸鉀緩沖溶液進行稀釋。本發(fā)明所具有的優(yōu)點本發(fā)明參考鼠肝微粒體CYP3A4的實驗方法,首次對蚯蚓體內(nèi)CYP3A4活性進行了嘗試測定,經(jīng)過大量的探索與改進,最終建立了蚯蚓體內(nèi)CYP3A4活性的測定方法;本發(fā)明簡單、快速、低耗、靈敏度高。CYP3A4在生物體內(nèi)分布廣泛、含量豐富,采用本發(fā)明方法可將蚯蚓體內(nèi)CYP3A4活性準(zhǔn)確測定,同時可以得出,蚯蚓體內(nèi)的CYP3A4活性可以被污染物誘導(dǎo),具有作為土壤污染生態(tài)毒理診斷的生物標(biāo)志物的潛能。
圖I為本發(fā)明實施例提供的底物睪酮和產(chǎn)物6 β -羥基睪酮的色譜圖(I為6 β -羥基睪酮;2為睪酮)。
具體實施例方式實施例I 利用本方法測定蚯蚓體內(nèi)CYP3A4活性,按如下步驟操作I)將實驗用蚯蚓用蒸餾水洗凈后用濾紙吸干,于20°C培養(yǎng)條件下在濕潤的濾紙上放置24h,使其排凈體內(nèi)的物質(zhì)。將排凈體內(nèi)物質(zhì)后的體蚯蚓在4°C甘油溶液(20%)中浸泡IOmin后,以內(nèi)臟為試驗材料進行蚯蚓微粒體蛋白含量的測定。內(nèi)臟用大量0. 15mol/L KCl溶液清洗,直至洗脫液為無色。洗凈后,濾紙吸干并轉(zhuǎn)移到2ml保存緩沖液中,采用玻璃組
5織研磨器將其細胞破碎。于低溫4°C超速離心機上以12800rpm離心30min,取上清液備用。取出400 μ I微粒體溶液,采用考馬斯亮藍染色法測定蛋白的含量,其余部分于-70°C中保存待用。其中,所用的保存緩沖液組成為250mmol/L蔗糖,50mmol/L Tris pH 7. 5, lmmol/L DTT, lmmol/L EDTA,20%甘油。保存緩沖液的作用為控制pH的變動在一定范圍內(nèi),防止酶失活;加入20%甘油的目的也是為了防止細胞色素P450酶系在制備時失活;此步驟中,于-70°C低溫冰箱中保存微粒體溶液的目的為可以避免酶活性在短期內(nèi)失活,保證測定時酶活性的穩(wěn)定。2)在離心管中依次加入120 μ I反應(yīng)液,30 μ I底物液及30 μ I步驟I)中的微粒體溶液混合均勻,混合后用槍頭抽吸后于25° C預(yù)熱5min,預(yù)熱后加入40 μ I NADPH溶液啟動反應(yīng),反應(yīng)20min后加入100μ I預(yù)冷的甲醇終止反應(yīng)。其中,反應(yīng)液的組成為0. lmol/L磷酸鉀緩沖溶液PH7. 4,4. 8mmol/L葡萄糖-6-磷酸,4. 8mmol/L MgCl2,0. 6U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。底物液為0. 6mmol/L的睪酮溶液,所述睪酮用乙腈溶解,再加入磷酸鉀緩沖溶液稀釋至所需濃度,溶劑含量不高于0. 1% (目的為避免過多的有機溶劑影響酶活性,含量小于0. 1%的有機溶劑對CYP3A4酶活性的影響可以忽略不計)。此步驟中,100%甲醇應(yīng)提前于-20°C預(yù)冷20min,其目的為使酶促反應(yīng)迅速停止,保證反應(yīng)終點的準(zhǔn)確性;槍頭抽吸混勻的目的為既可以使反應(yīng)液、底物及微粒體充分混勻,又避免儀器混勻時對酶活性的破壞。3)將步驟2)中的產(chǎn)物混合液于渦旋混合器中混勻5s,在低溫4°C離心機上以5000rpm離心lOmin,小心轉(zhuǎn)移上清液于進樣瓶中,即刻測定產(chǎn)物含量,產(chǎn)物含量的測定是采用 HPLC 法,采用 C18 反相色譜柱(5 μ m, 4. 6mm ID X 250mm, Vydac 201TP54,USA),流動相為甲醇和水,按體積比為50:50,流速I. 5ml/min,運行8min,柱溫為25°C,檢測波長為254nm,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)出峰時間為2min左右(參見圖I)。以單位時間內(nèi)每毫克微粒體蛋白生成的產(chǎn)物量表示酶活性大小(nmol/mgPr/min)。結(jié)果參見表1,其樣品編號為樣品組11,對照組10,其中對照組的操作條件與樣品組相同,對照組是指在無污染土壤的條件下培養(yǎng)的蚯蚓,樣品組是指在污染土壤中培養(yǎng)的蚯蚓。實施例2與實施例I不同之處在于將微粒體溶解在3ml保存緩沖液中混勻;于_80°C低溫冰箱中保存微粒體溶液;其它步驟及參數(shù)與實施例I相同。結(jié)果參見表1,其樣品編號為樣品組21,對照組20,其中對照組的操作條件與樣品組相同,對照組是指在無污染土壤的條件下培養(yǎng)的蚯蚓,樣品組是指在污染土壤中培養(yǎng)的蚯蚓。實施例3與實施例I不同之處在于在離心管中依次加入130 μ I反應(yīng)液,20 μ I底物液及25 μ I步驟I)中的微粒體溶液,槍頭抽吸混勻后于30°C預(yù)熱5min,加入30 μ I NADPH溶液啟動反應(yīng),反應(yīng)25min后加入100 μ I預(yù)冷的甲醇終止反應(yīng)。其它步驟及參數(shù)與實施例I相同。結(jié)果參見表1,其樣品編號為樣品組31,對照組30,其中對照組的操作條件與樣品組相同,對照組是指在無污染土壤的條件下培養(yǎng)的蚯蚓,樣品組是指在污染土壤中培養(yǎng)的蚯蚓。實施例4與實施例I不同之處在于在離心管中依次加入140 μ I反應(yīng)液,10 μ I底物液及20 μ I步驟I)中的微粒體溶液,槍頭抽吸混勻后于35°C預(yù)熱5min,加入20 μ I NADPH溶液啟動反應(yīng),反應(yīng)30min后加入120 μ I預(yù)冷的甲醇終止反應(yīng)。其它步驟及參數(shù)與實施例I相同。結(jié)果參見表1,其樣品編號為樣品組41,對照組40,其中對照組的操作條件與樣品組相同,對照組是指在無污染土壤的條件下培養(yǎng)的蚯蚓,樣品組是指在污染土壤中培養(yǎng)的蚯蚓。實施例5與實施例I不同之處在于將步驟2)中的產(chǎn)物混合液于渦旋混合器中混勻5s,在低溫4°C離心機上以4000rpm離心15min,小心轉(zhuǎn)移上清液于進樣瓶中,即刻測定產(chǎn)物含量。其它步驟及參數(shù)與實施例I相同。結(jié)果參見表1,其樣品編號為樣品組51,對照組50,其中對照組的操作條件與樣品組相同,對照組是指在無污染土壤的條件下培養(yǎng)的蚯蚓,樣品組是指在污染土壤中培養(yǎng)的蚯蚓。表I不同條件下蚯蚓CYP3A4的活性
權(quán)利要求
1.一種生物標(biāo)記物-蚯蚓體內(nèi)CYP3A4活性的測定方法,其特征在于1)將蚯蚓微粒體溶解在2 3ml保存緩沖液中混勻,待用;2)取20 30μ I步驟I)的微粒體溶液并加入120 140 μ I反應(yīng)液和10 30 μ I底物液混勻,混勻后于25 35°C預(yù)熱5 lOmin,預(yù)熱后再加入20 40 μ INADPH溶液反應(yīng)2(T30min后加入10(Γ 20μ I預(yù)冷的甲醇終止反應(yīng);3)將步驟2)中的產(chǎn)物混合液混勻,在T5°C以400(T5000rpm離心l(T20min,上清液用于測定產(chǎn)物含量。
2.按權(quán)利要求I所述的生物標(biāo)記物-蚯蚓體內(nèi)CYP3A4活性的測定方法,其特征在于所述步驟3)離心收集的上清液用于測定產(chǎn)物含量,以單位時間內(nèi)每毫克微粒體蛋白生成的產(chǎn)物量表示酶活性大小(nmol/mgPr/min)。
3.按照權(quán)利要求2所述的生物標(biāo)記物-蚯蚓體內(nèi)CYP3A4活性的測定方法,其特征在于所述產(chǎn)物含量的測定是采用HPLC法,流動相為甲醇和水,按體積比為40:6(Γ60:40,流速I. 5ml/min,檢測波長為25(T260nm。
4.按權(quán)利要求I所述的生物標(biāo)記物-蚯蚓體內(nèi)CYP3A4活性的測定方法,其特征在于所述步驟I)中保存緩沖液組成為250mmol/L鹿糖,50mmol/L Tris pH 7. 5, lmmol/L DTT,lmmol/L EDTA,20% 甘油。
5.按權(quán)利要求I所述的生物標(biāo)記物-蚯蚓體內(nèi)CYP3A4活性的測定方法,其特征在于將蚯蚓微粒體溶解在2 3ml保存緩沖液中混勻,混勻后取出30(Γ500μ I用于測定蛋白含量,其余部分于-7(T-80°C中保存待用。
6.按權(quán)利要求I所述的生物標(biāo)記物-蚯蚓體內(nèi)CYP3A4活性的測定方法,其特征在于所述步驟2)中反應(yīng)液的組成為0. Γ0. 15mol/L磷酸鉀緩沖溶液pH7. 4,r5mmol/L葡萄糖-6-磷酸,4 5mmol/LMgCl2,0. 5 lU/ml葡萄糖_6_磷酸脫氫酶。
7.按權(quán)利要求I所述的生物標(biāo)記物-蚯蚓體內(nèi)CYP3A4活性的測定方法,其特征在于所述步驟2)中底物液為0. 5 lmmol/L的睪酮溶液。
8.按權(quán)利要求7所述的生物標(biāo)記物-蚯蚓體內(nèi)CYP3A4活性的測定方法,其特征在于所述睪酮用乙腈溶解,再用磷酸鉀緩沖溶液進行稀釋。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物標(biāo)記物的檢測,具體地說是一種生物標(biāo)記物-蚯蚓體內(nèi)CYP3A4活性的測定方法。具體為將蚯蚓微粒體溶解在2~3ml保存緩沖液中混勻,待用;取20~30μ微粒體溶液并加入120~140μl反應(yīng)液和10~30μl底物液混勻,混勻后于25~35℃預(yù)熱5~10min,預(yù)熱后再加入20~40μlNADPH溶液反應(yīng)20~30min后加入100~120μl預(yù)冷的甲醇終止反應(yīng);將產(chǎn)物混合液混勻,在3~5℃以4000~5000rpm離心10~20min,上清液用于測定產(chǎn)物含量。本發(fā)明測定方法簡單、快速、低耗、靈敏度高。
文檔編號G01N30/02GK102937629SQ20121043141
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月1日
發(fā)明者曹秀鳳, 宋玉芳 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所