黃曲霉毒素g1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種用于檢測(cè)花生、谷物以及奶制品中黃曲霉毒素G1的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。本試劑盒是利用競(jìng)爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔上預(yù)包被黃曲霉毒素G1抗原。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，黃曲霉毒素G1抗體及酶標(biāo)記物，包被抗原和加入樣本中的黃曲霉毒素G1競(jìng)爭性地與黃曲霉毒素G1抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的抗原抗體，已結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物再與酶標(biāo)記物結(jié)合，洗去未結(jié)合的抗原、抗體，經(jīng)TMB底物顯色；加入反應(yīng)終止液，在450/630nm雙波長酶標(biāo)儀下進(jìn)行檢測(cè)，樣品中的黃曲霉毒素G1濃度與吸收光強(qiáng)度成反比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中黃曲霉毒素G1的含量。
【專利說明】黃曲霉毒素G1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種檢測(cè)黃曲霉毒素Gl的酶聯(lián)免疫分析試劑盒及檢測(cè)方法，屬于生物及食品安全檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，可用于對(duì)花生、谷物、奶制品中黃曲霉毒素Gl (AFGl)含量的檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉分泌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是一種能引起人畜各種損害的天然有毒化合物。黃曲霉毒素(AFT)目前已發(fā)現(xiàn)20余種，其中黃曲霉毒素BI為毒性及致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)。黃曲霉毒素Gl的毒性僅次于黃曲霉毒素BI，是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)。有研究表明，它比AFBl具有更強(qiáng)的誘發(fā)腎臟腫瘤的潛力。它是我國太行山南部食管癌、肺癌高發(fā)區(qū)(如河北省磁縣)居民飲食中的主要污染真菌毒素之一，其檢出率和含量均相當(dāng)高。
[0003]
【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)黃曲霉毒素Gl的酶聯(lián)免疫試劑盒，是由96或48孔的包被板(I)，黃曲霉毒素Gl標(biāo)準(zhǔn)品(2)，AFG1-BSA (3)，抗黃曲霉毒素Gl的單克隆抗體(4)，酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(5)，洗滌液(6)，顯色液A (7)，顯色液B (8)和終止液(9)所組成。
2.所述的酶標(biāo)記的羊抗兔抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體凍干品，洗滌液為含有吐溫的Tris-HCL緩沖液，顯色液A為含有過氧化氫的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，顯色液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，終止液為2 M的硫酸溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中的包被板(I)包被固相抗原，用50mmol/LpH9.6Na2CO3-NaHCO3的緩沖液將AFGl-BSA稀釋至10 mg/L作為包被液，96孔或48孔微孔板各加入100 μ L，37 °C下避光孵育2 h，棄去包被液，洗滌2次，加入150 μ L含3 %BSA的上述Na2CO3-NaHCO3緩沖液封閉，37 °C下避光孵育1.5 h，棄去封閉液，晾干，板條密封后置_20°C冷凍保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的試劑盒，其中的黃曲霉毒素Gl標(biāo)準(zhǔn)品(2)，從AFGl純品中稀釋得到，稀釋液為甲醇:水體積比為4:6，共6瓶，AFGl濃度分別為O ng/mL，0.025 ng/mL,0.1 ng/mL,0.25 ng/mL,0.5 ng/mL,1.5 ng/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的試劑盒檢測(cè)黃曲霉毒素Gl的方法，其特征是取包被的有AFGl-BSA的微孔包被板，加入AFGl標(biāo)準(zhǔn)品和處理好的樣品到各自的微孔中，加HRP-羊抗兔抗體，再加入AFGl抗體，輕輕振蕩反應(yīng)，洗滌液洗滌,加顯色液A和顯色液B，避光反應(yīng)后加終止液，在酶標(biāo)儀下測(cè)吸光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的AFGl含量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所 述的測(cè)黃曲霉毒素Gl的方法，其操作為:取包被有AFGl-BSA的微孔包被板，加入50 μ L的AFGl標(biāo)準(zhǔn)品和處理好的樣品到各自微孔中，加入50 μ L HRP-羊抗兔抗體，再加50 yL抗AFGl抗體，25 °C下避光反應(yīng)30 min，洗滴液洗板5次，25 °〇下避光反應(yīng)30 min，洗滌液洗板5次，加顯色液A和顯色液B，25 °C下避光反應(yīng)15 min，加終止液，在450/630 nm雙波長下測(cè)量吸光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的AFGl含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)黃曲霉毒素Gl的方法，其中的樣品處理方法為(I)谷物:取5 g粉碎樣品，加入25 mL樣品提取液，充分振蕩混勻5-10 min, 4000 r/min離心5min,或用定量分析濾紙過濾，取0.2 mL離心后的上清液或過濾后的濾液加入到I mL樣品稀釋液中進(jìn)行稀釋并充分混勻，取50 μ L稀釋后的樣品待測(cè)；(2)花生:取5 g粉碎的樣品，加入20 mL石油醚或正己烷和25 mL樣品提取液，充分振蕩混勻5-10 min，離心或靜置分層后去除上層液體，取0.2 mL下層液體加入到I mL樣品稀釋液中進(jìn)行稀釋并充分混勻，取50 μ L稀釋后樣品待測(cè)；(3)奶粉:取5 g奶粉于50 mL尚心管中，加入10 mL樣品提取液，劇烈振蕩5 min,過濾或4000 r/min離心5 min,取I mL上清,加入1.5 mL的去離子水和2.5 mL的石油醚或正己燒,振蕩搖勻,4000 r/min離心5 min,將下層液體轉(zhuǎn)移到另一潔凈離心管中，用于檢測(cè)
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103792359SQ201210435492
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月5日
【發(fā)明者】杜道林, 王永美 申請(qǐng)人:江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司