專利名稱：傷寒、甲型副傷寒沙門菌熒光定量pcr檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
傷寒、甲型副傷寒沙門菌熒光定量PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌熒光定量PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
傷寒(typhoid fever)是由傷寒桿菌引起的急性傳染病，以持續(xù)菌血癥，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)受累，回腸遠(yuǎn)端微小膿腫及潰瘍形成為基本病理特征。副傷寒是甲、乙、丙型副傷寒桿菌引起的急性消化道傳染病?？梢蛩春褪澄镂廴景l(fā)生爆發(fā)流行。傷寒病與副傷寒均是我國法定乙類傳染病，也是世界性的主要公共衛(wèi)生問題之一。它們的病原傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌是腸桿菌科沙門菌屬，革蘭染色陰性，呈短桿狀，長I 3. 5 μ m，寬O. 5 O. 8 μ m，周有鞭毛，能活動，不產(chǎn)生芽胞，無莢膜。兼性厭氧，最適的生長溫度為35 37°C， Ph6.8 7.8。它們對營養(yǎng)的要求不高，普通培養(yǎng)基即可生長出圓形、光滑、濕潤、半透明邊緣整齊的菌落，但沙門菌經(jīng)人工傳代后會從光滑型菌落逐步過渡為粗燥型菌落。不發(fā)酵乳糖， 在SS瓊脂平板上形成的菌落中心呈黑色。
目前對于傷寒沙門菌引起的傷寒及甲型副傷寒沙門菌引起的副傷寒的診斷方法包括
I.血常規(guī)檢驗(yàn)白細(xì)胞數(shù)一般在(3飛)X 109/L，中性粒細(xì)胞減少，嗜酸性粒細(xì)胞減少或消失。嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)隨病情好轉(zhuǎn)而恢復(fù)正常，對傷寒的診斷與病情評估有一定參考價值，但不能檢出是否有傷寒桿菌和副傷寒桿菌存在。
2.病原菌培養(yǎng)血培養(yǎng)為最常用的確診依據(jù)。傷寒病程第廣2周的陽性率最高 (80°/Γ90%),第3周約為50%,第4周后不易檢出。可作為常規(guī)檢驗(yàn)的依據(jù)。
3.肥達(dá)(Widal)反應(yīng)通常在病后I周左右出現(xiàn)抗體，第Γ4周的陽性率可達(dá)70% 以上，效價亦較高，并可維持?jǐn)?shù)月。有少數(shù)患者抗體陽性較遲出現(xiàn)，或者抗體效價水平較低。 約有109Γ30%患者肥達(dá)反應(yīng)始終為陰性?！癘”抗原為傷寒沙門菌
4.和副傷寒甲、乙、丙桿菌的共同抗原，血清中檢出高效價“O”抗體不能區(qū)別四種不同的病原菌感染，但四者的鞭毛抗原(“H”、“A”、“B”、“C”)不同，可從四者的特異性抗體效價上升來判斷感染的菌種。對未經(jīng)免疫者，“O”抗體的凝集效價在1:80及“H”、“A”、“B”、 “C”抗體在1:160或以上時，可確定為陽性，有輔助診斷價值。通過每5 7日復(fù)檢I次，若效價逐漸上升，價值較大。若只有“O”抗體上升，而“H”、“A”、“B”、“C”抗體不上升，可能是發(fā)病早期；若相反，只有“H”、“A”、“B”、“C”抗體上升而“O”抗體不增高可能是因其他發(fā)熱性疾患所致的非特異性回憶反應(yīng)。沙門菌D群與A群有部分的共同抗原，后者的感染可產(chǎn)生 “O”與“H”抗體的交叉反應(yīng)。
5.其它檢查一些新的免疫學(xué)診斷方法，包括PCR檢測技術(shù)。常規(guī)PCR檢測相對于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法具有快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，但臨床常規(guī)應(yīng)用中還有效果不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)交叉污染等問題。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌熒光定量PCR 檢測試劑盒，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中對于傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌檢測的周期長、操作繁瑣、靈敏度低的問題。
本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌熒光定量PCR 檢測試劑盒，包含第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液及石蠟，該第一反應(yīng)液包含反應(yīng)緩沖液；針對傷寒沙門菌的引物對和特異性探針，該引物對序列為SEQ IDNO :1和SEQ ID N0:2，該特異性探針序列為SEQ ID NO :3，針對甲型副傷寒沙門菌的引物對和特異性探針，該引物對序列為SEQ ID NO :4和SEQ IDNO :5，該特異性探針序列為SEQ ID NO :6，該第二反應(yīng)液包含DNA 聚合酶O。
本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供本發(fā)明的傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌熒光定量PCR檢測試劑盒在傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌檢測中的應(yīng)用。
本發(fā)明的傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌熒光定量PCR檢測試劑盒利用熒光定量PCR技術(shù)，避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)法中操作周期長、步驟繁瑣等不足，具有快速準(zhǔn)確靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。而且本發(fā)明的試劑盒在用于傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌的應(yīng)用過程中可直接利用血液樣本進(jìn)行檢測，不需要DNA提取，縮短了檢測時間，避免樣本間交叉污染，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。


圖I是現(xiàn)有技術(shù)中突光定量PCR檢測結(jié)果示意圖2是本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒的PCR檢測陽性結(jié)果判定示意圖3是本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒的PCR檢測陰性結(jié)果判定示意圖4為本發(fā)明實(shí)施例3的PCR檢測陽性結(jié)果；
圖5為本發(fā)明實(shí)施例3的PCR檢測陰性結(jié)果。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
本發(fā)明實(shí)施例提供一種傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌熒光定量PCR檢測試劑盒，包含第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液及石蠟，該第一反應(yīng)液包含反應(yīng)緩沖液；針對傷寒沙門菌的引物對和特異性探針，該引物對序列為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，該特異性探針序列為SEQ ID NO :3 ;針對甲型副傷寒沙門菌的引物對和特異性探針，該引物對序列為SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :5，該特異性探針序列為SEQ ID NO 6 ;該第二反應(yīng)液包含DNA聚合酶 O。
本發(fā)明實(shí)施例利用熒光定量PCR技術(shù)，其基本原理為在PCR反應(yīng)體系中引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光信號強(qiáng)度，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖，如圖I所示，Ct值為每個PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，而在曲線指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可據(jù)此進(jìn)行定量分析。
具體地，本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒中，第一反應(yīng)液中包含的反應(yīng)緩沖液含有25mM 的 MgCl2、不含續(xù)離子的 lOXbuffer、dNTPs。其中 dNTP 為 deoxy-ribonucleoside triphosphate (脫氧核糖核苷三磷酸)的縮寫，在本發(fā)明實(shí)施例中dNTP包括dATP、dGTP、 dTTP、dCTP，用于作為PCR反應(yīng)的原料。
具體地，本發(fā)明實(shí)施例的試劑盒中，第一反應(yīng)液中針對傷寒沙門菌的引物對SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2和特異性探針SEQ ID NO :3，以及針對甲型副傷寒沙門菌的引物對SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5和特異性探針SEQ IDNO 6序列如表I所示
表I針對傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌的引物對和特異性探針序列
權(quán)利要求
1.一種傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌熒光定量PCR檢測試劑盒，包含第一反應(yīng)液、 第二反應(yīng)液及石蠟，所述第一反應(yīng)液包含反應(yīng)緩沖液；針對傷寒沙門菌的引物對和特異性探針，所述針對傷寒沙門菌的引物對序列為SEQ IDNO :1和SEQ ID NO :2，所述針對傷寒沙門菌的特異性探針序列為SEQ ID NO :3 ;以及針對甲型副傷寒沙門菌的引物對和特異性探針，所述針對甲型副傷寒沙門菌的引物對序列為SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5，所述針對甲型副傷寒沙門菌的特異性探針序列為SEQ ID NO :6，所述第二反應(yīng)液包含DNA聚合酶O。
2.如權(quán)利要求I所述的傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述針對傷寒沙門菌的特異性探針SEQ ID NO :3和針對甲型副傷寒沙門菌的特異性探針SEQ ID NO :6的5’端連接有FAM或HEX，3’端連接有DABCYL或BHQ。
3.如權(quán)利要求I所述的傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)緩沖液含有25mM的MgCl2、不含鎂離子的IOXbuffer和dNTPs。
4.如權(quán)利要求I所述的傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述第二反應(yīng)液還包含顯色液。
5.如權(quán)利要求I所述的傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述第一反應(yīng)液和所述第二反應(yīng)液被所述石蠟隔開。
6.如權(quán)利要求I所述的傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述針對傷寒沙門菌的引物對SEQ ID NO 1和SEQ IDNO :2，所述針對傷寒沙門菌的特異性探針序列SEQ ID NO :3，以及針對甲型副傷寒沙門菌的引物對SEQ ID NO 4和 SEQ ID NO :5，所述針對甲型副傷寒沙門菌的特異性探針序列SEQ ID NO :6在與所述第一反應(yīng)液中其他組分混合前濃度為45-55 μ M0
7.如權(quán)利要求I所述的傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶O在與所述第二反應(yīng)液的其他組分混合前的濃度為40-44U/μ L。
8.如權(quán)利要求I至7中任一項(xiàng)所述的傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌熒光定量PCR檢測試劑盒在傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌檢測中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌檢測包括PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)條件為50-550C 2-5min ；94-95°C 2-3min ；94-95°C 5-10s,55-60°C 40-80s ;40 個循環(huán)。
10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌檢測包括利用全血直接進(jìn)行PCR反應(yīng)的步驟。
全文摘要
本發(fā)明適用于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，提供了一種傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌熒光定量PCR檢測試劑盒，該試劑盒包含第一反應(yīng)液、第二反應(yīng)液及石蠟，該第一反應(yīng)液包含反應(yīng)緩沖液，針對傷寒沙門菌的引物對SEQ ID NO1和SEQ ID NO2和特異性探針SEQ ID NO3，以及針對甲型副傷寒沙門菌的引物對SEQ ID NO4和SEQ ID NO5和特異性探針SEQ ID NO6；該第二反應(yīng)液包含DNA聚合酶O。本發(fā)明還提供了該試劑盒在傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明的檢測試劑盒縮短了檢測時間，避免樣本間交叉污染，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
文檔編號G01N21/64GK102978282SQ201210457269
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月14日
發(fā)明者盧柳燕, 吳成貢, 田仁鵬, 吳炳義 申請人:深圳市生科源技術(shù)有限公司