專利名稱：大景深三維納米分辨成像方法、光學(xué)組件及成像系統(tǒng)的制作方法
大景深三維納米分辨成像方法、光學(xué)組件及成像系統(tǒng)技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于顯微成像技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種大景深三維納米分辨成像方法、光學(xué)組件及成像系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
細(xì)胞是生物體及生命活動的基本單元,對細(xì)胞的深入研究是揭開生命奧秘，改造生命和征服疾病的關(guān)鍵。在完整細(xì)胞下進(jìn)行分子成像，進(jìn)而獲取亞細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)甚至分子圖譜，并能在活體細(xì)胞下獲取這些結(jié)構(gòu)變化及分子動態(tài)過程的信息一直是細(xì)胞學(xué)研究的重要方向。同時(shí)，對完整細(xì)胞進(jìn)行納米分辨三維結(jié)構(gòu)和功能成像，在更高水平上認(rèn)識亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與細(xì)胞功能變化的關(guān)系和規(guī)律，是生命科學(xué)的迫切需求，也是對成像科學(xué)的重大挑戰(zhàn)。
近年來，遠(yuǎn)場納米分辨熒光顯微成像技術(shù)取得了較大的發(fā)展。目前最為突出的方法有兩種，一種是基于縮小有效激發(fā)光斑，通過直接減小點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的半高寬來提高分辨率，包括STED，GSD等；另一種則是基于單分子定位技術(shù)，包括STORM，PALM等。前者是通過受激態(tài)或基態(tài)耗盡的方式，壓縮熒光有效發(fā)射區(qū)域；后者則是利用熒光標(biāo)記本身的開關(guān)效應(yīng),通過稀疏激發(fā)、分時(shí)成像、質(zhì)心定位以及圖像合成來實(shí)現(xiàn)納米分辨成像，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)20nm 的橫向空間分辨率。
然而，利用單分子定位技術(shù)對直徑為10 μ m以上的細(xì)胞進(jìn)行納米分辨三維成像仍然存在很多問題。首先，單分子定位對于軸向分辨率并沒有提高，常常需要結(jié)合某些改進(jìn)軸向分辨率的方法，如柱面鏡像散法、雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)法(DH-PSF)、雙層平面探測法、虛擬空間超分辨顯微術(shù)(VVSRM)等，可實(shí)現(xiàn)橫向空間分辨率達(dá)20-30nm左右，軸向分辨率達(dá) 40-70nm的三維成像，目前，這些方法的成像深度只有2 μ m。另外，干涉光敏定位顯微技術(shù) (iPALM)可將三維的分辨率提高到20nm以內(nèi)，但成像范圍僅被限制在蓋玻片以下500nm的深度范圍內(nèi)，因此，這些方法的成像深度均較小。
細(xì)胞內(nèi)動態(tài)成像要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)追蹤多個(gè)分子，這要求成像手段在三維空間以納米定位精度快速探測十幾微米景深范圍內(nèi)的多個(gè)目標(biāo)分子。目前的單分子追蹤(SPT) 方法，既可以對樣品中只包含目標(biāo)分子的區(qū)域進(jìn)行局部探測，實(shí)現(xiàn)Inm精度的熒光成像 (FIONA);也可以采用寬場成像的方法，實(shí)現(xiàn)同時(shí)追蹤多個(gè)分子。雖然寬場探測的SPT方法已經(jīng)發(fā)展了圖像堆棧、離焦成像、用聚焦激光光束環(huán)繞粒子運(yùn)動、Fresnel粒子追蹤(FPT)， 以及柱面鏡像散等多種軸向分辨的方法，已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)三維的納米定位，但目前實(shí)現(xiàn)的成像深度僅僅為3 μ m左右，而一般完整細(xì)胞的厚度有十幾微米，因此，現(xiàn)有的方法仍不能滿足細(xì)胞內(nèi)多分子追蹤的大景深要求。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種大景深三維納米分辨成像方法，旨在解決傳統(tǒng)方法成像深度小，難以滿足分子定位的大景深要求的問題。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種大景深三維納米分辨成像方法，包括下述步驟
創(chuàng)建具有雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)和離焦光柵多階成像性質(zhì)的光學(xué)模塊；通過所述光學(xué)模塊對待測分子進(jìn)行成像，獲得待測分子的雙螺旋圖像；通過所述雙螺旋圖像中雙螺旋旁瓣的中點(diǎn)在成像面上的位置確定待測分子的橫向位置；通過所述雙螺旋圖像中雙螺旋旁瓣的中心連線的旋轉(zhuǎn)角度及所述雙螺旋旁瓣的中點(diǎn)在成像面上的位置確定待測分子的軸向位置。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于大景深三維納米分辨成像的光學(xué)組件，包括沿光路傳輸方向依次設(shè)置的第一透鏡，用于將待測分子發(fā)出的熒光進(jìn)行準(zhǔn)直；光學(xué)模塊，具有雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)和離焦光柵多階成像性質(zhì)，用于將所述熒光轉(zhuǎn)換為具有雙螺旋及多階成像性質(zhì)的成像光束；第二透鏡，用于將所述成像光束輸出以用于成像。本發(fā)明的又一目的在于提供一種大景深超分辨熒光顯微成像探測系統(tǒng)，包括沿光路傳輸方向依次設(shè)置的探測物鏡，用于接收含有待測分子發(fā)出的熒光的光束；濾光片，用于對所述光束進(jìn)行濾波并輸出所述熒光；雙色鏡，用于對所述熒光進(jìn)行反射；管鏡，用于將反射的熒光聚焦并向成像組件輸出；成像組件，采用上述的光學(xué)組件，用于將所述熒光轉(zhuǎn)換為具有雙螺旋及多階成像性質(zhì)的成像光束；探測器，用于接收所述成像光束并進(jìn)行雙螺旋及多階成像。本發(fā)明創(chuàng)建了綜合雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)及離焦光柵多階成像雙重效應(yīng)的光學(xué)模塊，多階成像的景深較大，雙螺旋成像的分辨率較高且具有一定的景深，通過上述光學(xué)模塊成像時(shí)，一方面通過多階成像和雙螺旋成像大幅度擴(kuò)大了景深，另一方面通過雙螺旋成像顯著的提高了分辨率，本發(fā)明的成像景深可達(dá)十幾微米，既可用于完整細(xì)胞內(nèi)任意深度亞細(xì)胞的動態(tài)范圍成像，又可獲得多個(gè)運(yùn)動分子的動態(tài)功能圖像，對于在更高水平上認(rèn)識亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與細(xì)胞功能變化的關(guān)系和規(guī)律具有重要意義。


圖1是本發(fā)明第一實(shí)施例提供的大景深三維納米分辨成像方法的流程圖；圖2是不同深度的雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)成像的對照圖；圖3是雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)成像的強(qiáng)度與相位分布；圖4是雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)在不同軸向位置處的成像圖形；圖5是雙螺旋圖像兩個(gè)旁瓣中心連線的旋轉(zhuǎn)角度與Z軸位置的關(guān)系曲線圖；圖6是離焦光柵成像原理示意圖；圖7是本發(fā)明第一實(shí)施例提供的相位片的示意圖；圖8是利用圖7所示相位片進(jìn)行成像的效果圖；圖9是本發(fā)明第二實(shí)施例提供的用于大景深三維納米分辨成像的光學(xué)組件示意圖10是本發(fā)明第三實(shí)施例提供的一種大景深超分辨熒光顯微成像探測系統(tǒng)示意 圖；圖11是本發(fā)明第三實(shí)施例提供的另一種大景深超分辨熒光顯微成像探測系統(tǒng)示 意圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)現(xiàn)進(jìn)行更加詳細(xì)的描述實(shí)施例一:圖1示出了本發(fā)明第一實(shí)施例提供的大景深三維納米分辨成像方法的流程圖，為 了便于說明，僅示出了與本實(shí)施例相關(guān)的部分。參考附圖1，該方法主要包括下述步驟在步驟S101中，創(chuàng)建具有雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)和離焦光柵多階成像性質(zhì)的光學(xué)模 塊；在步驟S102中，通過光學(xué)模塊對待測分子進(jìn)行成像，獲得待測分子的雙螺旋圖 像；在步驟S103中，通過雙螺旋圖像中雙螺旋旁瓣的中點(diǎn)在成像面上的位置確定待 測分子的橫向位置；在步驟S104中，通過雙螺旋圖像中雙螺旋旁瓣的中心連線的旋轉(zhuǎn)角度及雙螺旋 旁瓣的中點(diǎn)在成像面上的位置確定待測分子的軸向位置。通過雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(DH-PSF)實(shí)現(xiàn)三維納米定位是基于一種被稱為自成像的 現(xiàn)象。DH-PSF是一種三維光學(xué)響應(yīng)，具有隨離焦量不斷旋轉(zhuǎn)的圓形不對稱橫截面輪廓，如 圖2所示。雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)主要通過位于拉蓋爾-高斯(Laguerre-Gauss,簡記為LG) 模式平面上特定直線上的LG光束模式的線性疊加構(gòu)成帶有旋轉(zhuǎn)和縮放的自成像光束，然 后將自成像光束的一個(gè)橫截面中的復(fù)合場作為光學(xué)模塊的光學(xué)傳遞函數(shù)，那么，光學(xué)模塊 的傳遞函數(shù)就是雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。該拉蓋爾-高斯光束模式為
權(quán)利要求
1.一種大景深三維納米分辨成像方法，其特征在于，包括下述步驟 創(chuàng)建具有雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)和離焦光柵多階成像性質(zhì)的光學(xué)模塊； 通過所述光學(xué)模塊對待測分子進(jìn)行成像，獲得待測分子的雙螺旋圖像； 通過所述雙螺旋圖像中雙螺旋旁瓣的中點(diǎn)在成像面上的位置確定待測分子的橫向位置； 通過所述雙螺旋圖像中雙螺旋旁瓣的中心連線的旋轉(zhuǎn)角度及所述雙螺旋旁瓣的中點(diǎn)在成像面上的位置確定待測分子的軸向位置。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述光學(xué)模塊的雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)通過下述方法實(shí)現(xiàn) 通過位于拉蓋爾-高斯模式平面上特定直線上的拉蓋爾-高斯光束模式的線性疊加構(gòu)成帶有旋轉(zhuǎn)和縮放的自成像光束； 將自成像光束的一個(gè)橫截面中的復(fù)合光場作為所述光學(xué)模塊的光學(xué)傳遞函數(shù)，使所述光學(xué)模塊具有雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述拉蓋爾-高斯光束模式為
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述光學(xué)模塊的相位函數(shù)為 ①h_①db+①g 其中，Cdb為所述五種拉蓋爾-高斯光束模式等權(quán)重疊加后形成的復(fù)振幅的相位；
5.如權(quán)利要求4所述的萬法其特征在于，所述光學(xué)模塊為采用微細(xì)加工技術(shù)制作的相位片或采用空間光調(diào)制器實(shí)現(xiàn)。
6.一種用于大景深三維納米分辨成像的光學(xué)組件，其特征在于，包括沿光路傳輸方向依次設(shè)置的 第一透鏡，用于將待測分子發(fā)出的光束進(jìn)行準(zhǔn)直； 光學(xué)模塊，具有雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)和離焦光柵多階成像性質(zhì)，用于將所述光束轉(zhuǎn)換為具有雙螺旋及多階成像性質(zhì)的成像光束； 第二透鏡，用于將所述成像光束輸出以用于成像。
7.如權(quán)利要求6所述的光學(xué)組件，其特征在于，所述光學(xué)模塊的相位函數(shù)為
8.—種大景深超分辨熒光顯微成像探測系統(tǒng)，其特征在于，包括沿光路傳輸方向依次設(shè)置的 探測物鏡，用于接收含有待測分子發(fā)出的熒光的光束； 濾光片，用于對所述光束進(jìn)行濾波并輸出所述熒光； 雙色鏡，用于對所述熒光進(jìn)行反射； 管鏡，用于將反射的熒光聚焦并向成像組件輸出； 成像組件，采用權(quán)利要求6或7所述的光學(xué)組件，用于將所述熒光轉(zhuǎn)換為具有雙螺旋及多階成像性質(zhì)的成像光束； 探測器，用于接收所述成像光束并進(jìn)行雙螺旋及多階成像。
9.如權(quán)利要求8所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述光學(xué)組件中的光學(xué)模塊為通過微細(xì)加工技術(shù)制作的相位片。
10.如權(quán)利要求8所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述光學(xué)組件中的光學(xué)模塊為空間光調(diào)制器，所述系統(tǒng)還包括 偏振片，位于所述雙色鏡和管鏡之間，用于將所述熒光轉(zhuǎn)換為適用于所述空間光調(diào)制器的線偏振光。
全文摘要
本發(fā)明適用于顯微成像技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種大景深三維納米分辨成像方法，包括下述步驟創(chuàng)建具有雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)和離焦光柵多階成像性質(zhì)的光學(xué)模塊；通過光學(xué)模塊對待測分子進(jìn)行成像，獲得雙螺旋圖像；通過雙螺旋圖像中雙螺旋旁瓣的中點(diǎn)的位置確定待測分子的橫向位置；通過雙螺旋圖像中雙螺旋旁瓣的中心連線的旋轉(zhuǎn)角度及雙螺旋旁瓣的中點(diǎn)位置確定待測分子的軸向位置。本發(fā)明將雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)及離焦光柵多階成像的雙重效應(yīng)相結(jié)合，既擴(kuò)大了景深，又提高了分辨率，該方法可用于完整細(xì)胞內(nèi)任意深度亞細(xì)胞的動態(tài)范圍成像，可獲得多個(gè)運(yùn)動分子的動態(tài)功能圖像，對于在更高水平上認(rèn)識亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與細(xì)胞功能變化的關(guān)系和規(guī)律具有重要意義。
文檔編號G01N21/64GK102980875SQ20121046780
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者于斌, 陳丹妮, 牛憨笨, 李恒 申請人:深圳大學(xué)