專利名稱：一種食管癌免疫質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)及質(zhì)譜檢測(cè)，具體地說，涉及一種食管癌免疫質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
食管癌是常見的消化道惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2008年全球食管癌新發(fā)病例為 482300,死亡病例為406800。食管癌分為食管癌和食管腺癌,在我國，食管癌是食管癌的主 要類型，尤其是在北方地區(qū)。近年來，雖然對(duì)食管癌的治療取得了一些進(jìn)展，但是食管癌的 死亡率仍居高不下。究其原因，主要是其早期癥狀具有隱蔽性和非特異性，臨床發(fā)現(xiàn)和治療 的食管癌患者大多已屬中、晚期，早期食管癌與中、晚期食管癌的預(yù)后有很大差別，經(jīng)綜合 治療的早期食管癌患者5年生存率可達(dá)90%以上，而中、晚期患者只有25%-40%。因此，開展 食管癌的早期診斷早期治療是目前提高食管癌治療效果的有效途徑。而當(dāng)食管病變局限于 黏膜或黏膜下時(shí)，患者可能尚無感覺或僅有諸如輕微的梗噎感、胸骨后燒灼感等非特異性 癥狀，使早期診斷食管癌非常困難。
目前，國內(nèi)外常采用的食管癌檢測(cè)方法有脫落細(xì)胞學(xué)、內(nèi)鏡技術(shù)、標(biāo)志物檢查等方 法。食管上皮脫落細(xì)胞的獲取方法有食管拉網(wǎng)及毛刷，經(jīng)鹽水沖洗、沉淀后做涂片檢查。食 管拉網(wǎng)法是我國沈瓊教授發(fā)明的，其特異度可達(dá)99%，敏感度為44%-90%，但由于這一方法 使受檢者較為痛苦，難以作為普查手段在一般人群中開展，經(jīng)過半個(gè)多世紀(jì)的實(shí)踐發(fā)現(xiàn)， 在高發(fā)區(qū)食管拉網(wǎng)方法的受檢率越來越低。內(nèi)鏡檢查并進(jìn)行活檢是現(xiàn)今食管癌的主要確診 手段，且隨著其他技術(shù)與內(nèi)鏡的結(jié)合，產(chǎn)生了一些新的檢查方法，明顯提高了早期食管癌的 檢出率，但其依然存在明顯的缺陷，如可能會(huì)加重受檢者的不適，診斷結(jié)果依賴于操作者的 經(jīng)驗(yàn)和技巧等。運(yùn)用組織標(biāo)志物診斷食管癌，前提必然是要取得腫瘤組織或細(xì)胞，這只能通 過有創(chuàng)的、甚至繁瑣的操作才能達(dá)到，并不適合人群普查。所以，積極尋找創(chuàng)傷小、檢測(cè)方 便的食管鱗癌血清標(biāo)志物檢測(cè)方法成為當(dāng)今臨床診斷的熱點(diǎn)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種食管癌免疫質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種食管癌免疫質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒，其含有保藏號(hào) 為CGMCC No. 5269的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體和固相載體，所述單克隆抗體共價(jià)連 接于固相載體上。
其中，所述固相載體為包被蛋白G或蛋白A的瓊脂糖顆粒等。
優(yōu)選地，所述單克隆抗體可固定于固相載體上，如通過共價(jià)連接方式固定于包被 蛋白G或蛋白A的瓊脂糖顆粒上。
本發(fā)明選用的包被蛋白G或蛋白A的瓊脂糖顆粒(Protein GAgarose/Protein A Agarose)是免疫沉淀的基質(zhì),與包被蛋白G或蛋白A的磁珠(Protein G magnetic beads/ Protein A magnetic beads)相比，更具成本低的優(yōu)點(diǎn)。
進(jìn)一步地，本發(fā)明的食管癌免疫質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒中還含有洗脫液，所述洗脫液任選 pH 值 2. 7 的 O. lmol/1 甘氨酸-HCl 溶液、5% 乙酸或含 O. l%(v/v) TFA 的 50-70% (v/v) ACN 溶液中的一種。
本發(fā)明中，抗人食管癌多肽標(biāo)志物單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株AP0105，是以多肽標(biāo)志物抗原(序列為 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-Hi s-Gln的多肽，命名為多肽5)與載體蛋白匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)的偶聯(lián)物免疫原，免疫BALB/ C小鼠，然后篩選出的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明提供的抗人食管癌多肽標(biāo)志物單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株AP0105 (即，抗人原發(fā)性肝癌多肽標(biāo)志物單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株AP0105)現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路 I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏日期2011年9月27日，保藏號(hào)為 CGMCC No. 5269。
本發(fā)明還提供所述多肽免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，該方法包括如下步驟將純化后的單克隆抗體與固相載體懸浮液混合，使得終濃度為O. 15 μ g/μ L-1. 5 μ g/μ L，在 4°C旋轉(zhuǎn)孵育15分鐘-2小時(shí)，放置l_5min，沉淀，移出上清液，用100-200 μ L PBS緩沖液 (O. Olmol/1、ρΗ7. 4)清洗所述固相載體2_5次，即得所述檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明還提供一種食管癌免疫質(zhì)譜檢測(cè)方法，該方法包括如下步驟利用上述檢測(cè)試劑盒從血清樣品中分離多肽標(biāo)志物抗原，用高通量的MALD1-T0F-MS檢測(cè)洗脫液中的所述多肽標(biāo)志物抗原，由此建立完整的多肽免疫質(zhì)譜檢測(cè)方法。
為了將所述檢測(cè)試劑盒中的與所述單克隆抗體原發(fā)生特異性結(jié)合的血清樣品中的多肽標(biāo)志物抗分離出來，使用洗脫液從所述固相載體上分離出所述多肽標(biāo)志物抗原。
具體地，所述食管癌免疫質(zhì)譜檢測(cè)方法包括如下步驟
I)結(jié)合單克隆抗體與瓊脂糖顆粒以共價(jià)鍵相互結(jié)合；
2)孵育將樣品與結(jié)合了抗體的瓊脂糖顆粒進(jìn)行孵育；
3)清洗經(jīng)過孵育，使得待分析物結(jié)合到抗體上，并清洗瓊脂糖，洗掉未與抗體結(jié)合的雜質(zhì)；
4)洗脫用洗脫液將待分析物洗脫下來；
5)檢測(cè)用MALD1-TOF MS檢測(cè)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
優(yōu)選地，所述食管癌免疫質(zhì)譜檢測(cè)方法包括如下步驟
I)取15-25 μ I固相載體，置于Eppendorf管中，加入1. 56 μ g-31.1yg單克隆抗體，4°C旋轉(zhuǎn)混合15分鐘-2小時(shí)，放置l_5min，移出上清液，用O. 01M、pH7. 4PBS緩沖液 100-200 μ L清洗所得固相載體沉淀2-5次；
2)取O. 48 μ g-24 μ g多肽標(biāo)準(zhǔn)品、10-50 μ L PBS，與步驟I)清洗后的所述固相載體混合，4°C旋轉(zhuǎn)混合8-12h ；
3)放置l_5min，移出上清液，用100-200 μ L PBS清洗沉淀2_5次；最后一次清洗時(shí)將其懸浮液移至另一干凈Eppendorf管中；以避免抗原非特異附著在管壁，降低檢測(cè)本底值；
4)加入5-10 μ L洗脫液，吸排混合l_5min ；
5)離心，取上清液，用MALD1-T0F-MS檢測(cè)，得到多肽標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜；
6 )用40_60 μ I血清樣品替代步驟2 )的多妝標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)步驟2 ) _5 ),用MALD1-TOF-MS檢測(cè)，測(cè)定血清樣品中的多肽標(biāo)志物抗原。
其中，步驟5)中采用的檢測(cè)條件為正離子檢測(cè)模式，離子源加速電壓為201^，隊(duì)激光器，激光波長337nm,能量2000,離子延遲提取時(shí)間(Pulse ion extraction, PIE) 390ns, 質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加2000次,使用peptide II standard kit (Bruker)離子峰校正(m/ z 700-m/z3500)，質(zhì)量掃描范圍 500_5000Da。
本發(fā)明的食管癌免疫質(zhì)譜檢測(cè)方法操作簡單，主要包括抗體固相化、多肽抗原孵育結(jié)合和質(zhì)譜檢測(cè)三個(gè)方面，即將包被蛋白G或蛋白A的瓊脂糖顆粒與本發(fā)明的單克隆抗體混合孵育，抗體與蛋白G或蛋白A親和結(jié)合后固相化，清洗，加入多肽抗原孵育，抗原與抗體特異性結(jié)合，清洗，洗脫液分離抗原，MALD1-T0F-MS檢測(cè)。
本發(fā)明中涉及的單克隆抗體針對(duì)多肽標(biāo)志物抗原的結(jié)合特異性強(qiáng)；采用免疫與質(zhì)譜技術(shù)連用，能實(shí)現(xiàn)食管癌高通量、高靈敏度、高精確度的檢測(cè)。此外，本發(fā)明方法屬于分子水平診斷技術(shù)，與腫瘤影像學(xué)相比操作簡單、成本低。
通過將血清多肽腫瘤早期診斷試劑盒與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合使用，可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)生物標(biāo)志群,是驗(yàn)證血清標(biāo)志物和應(yīng)用于臨床檢測(cè)的理想工具。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例2-4中多肽免疫質(zhì)譜檢測(cè)方法的流程圖。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例2-4中合成肽5標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖。
圖3本發(fā)明實(shí)施例4中食管癌確診血清樣本的質(zhì)譜圖。
圖4本發(fā)明實(shí)施例4中檢測(cè)食管癌血清樣本與正常血清的ROC曲線圖。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
實(shí)施例1多肽標(biāo)志物抗原單克隆抗體的制備方法
I)采用偶聯(lián)載體蛋白KLH的合成的多肽5作為免疫原免疫BALB/C小鼠；其中，多妝 5 的全長序列為Asn-Leu_Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln。
2)2周后檢測(cè)尾血滴度，達(dá)到1:1000以上后，取BALB/C小鼠脾細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞在PEG作用下進(jìn)行融合。
3)通過ELISA方法進(jìn)行篩選，用有限稀釋法對(duì)分泌抗體陽性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆純化。
4)篩選出10株針對(duì)合成肽5的雜交瘤細(xì)胞，其中一株敏感性較高(Ing/孔)，擴(kuò)增細(xì)胞系，制備并純化單抗腹水，檢測(cè)單抗的效價(jià)(I 200000)、滴度(O. 0005 μ g/ml)及亞型鑒定(IgG2b)等，得到抗多肽5的特異性單克隆抗體。將該雜交瘤細(xì)胞株命名為抗人原發(fā)性肝癌多肽標(biāo)志物單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株AP0105，并于2011年9月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 5269。
實(shí)施例2食管癌免疫質(zhì)譜檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的多肽免疫質(zhì)譜檢測(cè)方法的流程如圖1所示。具體為
I)取 25 μ L 包被蛋白 G 的瓊脂糖顆粒(Protein G Agarose, SantaCruz),置于O.6mL Eppendorf管中，加入7. 78 μ g AP0105，4°C旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速5r/min)，混合I小時(shí)，放置 3min,移出上清液,用 100 μ L PBS 緩沖液(O. 01mol/l、ρΗ7· 4)清洗 Protein G Agarose 3 次；
2)取24μ g合成肽5的多肽標(biāo)準(zhǔn)品(固相化學(xué)合成，北京中科亞光生物科技有限公司)、50yL PBS,與步驟I)清洗后的Protein G Agarose混合,4°C旋轉(zhuǎn)混合8h ;
3)放置 3min,移出上清液,用 200 μ L PBS 清洗 Protein G Agarose 3 次；最后一次清洗時(shí)將其懸浮液移至另一干凈的Eppendorf管中；
4)加入5 μ L含有0. 1%(v/v) TFA的70%(v/v) CAN溶液的洗脫液，吸排混合5min ；
5)離心，取上清液，用MALD1-T0F-MS檢測(cè)，檢測(cè)圖譜如圖2所示，多肽標(biāo)準(zhǔn)品峰明顯，與理論偏差小于0.1Da0
其中，檢測(cè)條件為正離子檢測(cè)模式，離子源加速電壓為20kV，N2激光器，激光波長 337nm,能量2000,離子延遲提取時(shí)間(Pulse ionextraction, PIE) 390ns,質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加 2000 次,使用 peptide II standard kit(Bruker)離子峰校正(m/z 700-m/z 3500)， 質(zhì)量掃描范圍50(T5000Da。
結(jié)果表明，經(jīng)本發(fā)明的方法檢測(cè)合成肽5標(biāo)準(zhǔn)品，得到的MALD1-TOF MS質(zhì)譜圖具有分辨率高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。
實(shí)施例3食管癌免疫質(zhì)譜檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的多肽免疫質(zhì)譜檢測(cè)方法的流程如圖1所示。具體為
I)取 15 μ L 包被蛋白 A 的瓊脂糖顆粒(Protein A Agarose, SantaCruz),置于 0.2mL Eppendorf 管中，加入1. 56 μ g APO105,4°C旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速 5r/min),混合 15 分鐘，放置 2min,移出上清液,用 100 μ L PBS 緩沖液(0. 01mol/l、ρΗ7· 4)清洗 Protein A Agarose 3 次；
2)取24 μ g合成肽5多肽標(biāo)準(zhǔn)品(固相化學(xué)合成，北京中科亞光生物科技有限公司)、50yL PBS,與步驟I)清洗后的Protein A Agarose混合,4°C旋轉(zhuǎn)混合8h ;
3)放置 2min,移出上清液,用 200 μ L PBS 清洗 Protein A Agarose 3 次；最后一次清洗時(shí)將其懸浮液移至另一干凈的Eppendorf管中；
4)加入5 μ L 5%乙酸洗脫液,吸排混合3min ；
5)離心，取上清液，用MALD1-T0F-MS檢測(cè)，檢測(cè)圖譜如圖2所示，從譜圖中可以看出多肽標(biāo)準(zhǔn)品峰明顯，與理論偏差小于0.1Da0
其中，檢測(cè)條件為正離子檢測(cè)模式，離子源加速電壓為20kV，N2激光器，激光波長 337nm,能量2000,離子延遲提取時(shí)間(Pulse ionextraction, PIE) 390ns,質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加 2000 次,使用 peptide II standard kit(Bruker)離子峰校正(m/z 700-m/z 3500)， 質(zhì)量掃描范圍50(T5000Da。
實(shí)施例4食管癌免疫質(zhì)譜檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的多肽免疫質(zhì)譜檢測(cè)方法的流程如圖1所示。具體為
I)取 20 μ L 包被蛋白 G 的瓊脂糖顆粒(Protein G Agarose, SantaCruz),置于0.2mL Eppendorf管中，加入7. 78 μ g AP0105，4°C旋轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)速5r/min)，混合I小時(shí)，放置 3min,移出上清液,用 100 μ L PBS 緩沖液(0. 01mol/l、ρΗ7· 4)清洗 Protein G Agarose 3次；
2)取24 μ g合成肽5多肽標(biāo)準(zhǔn)品(固相化學(xué)合成，北京中科亞光生物科技有限公司)、50μ L PBS,與清洗后的Protein G Agarose混合，4°C旋轉(zhuǎn)混合8h ；
3)放置 3min,移出上清液,用 200 μ L PBS 清洗 Protein G Agarose 3 次；最后一次清洗時(shí)將其懸浮液移至另一干凈的Eppendorf管中；
4)加入5 μ L pH 2. 7的O. lmol/1甘氨酸-HCl溶液,吸排混合3min ；
5)離心，取上清液，用MALD1-T0F-MS檢測(cè)，圖2中的譜圖結(jié)果顯示，多肽標(biāo)志物峰值與理論偏差小于O. 2Da。譜圖中雜峰較少，顯示出目標(biāo)峰有較高特異性。
6)另取50 μ L臨床確診的食管癌血清72份，正常血清120份，按上述同法平行操作，用MALD1-TOF-MS檢測(cè)。食管癌血清的譜圖如圖3所示，可以看出，圖3所示的譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品圖2的譜圖相同，顯示出目標(biāo)峰有較高特異性。
結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)，如圖4的ROC曲線顯示，敏感度達(dá)到75. 0%，特異度達(dá)到95. 1%。
其中，檢測(cè)條件為正離子檢測(cè)模式，離子源加速電壓為20kV，N2激光器，激光波長 337nm,能量2000,離子延遲提取時(shí)間(Pulse ionextraction, PIE) 390ns,質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加 2000 次,使用 peptide II standard kit(Bruker)離子峰校正(m/z 700-m/z 3500)， 質(zhì)量掃描范圍50(T5000Da。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種食管癌免疫質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒，其特征在于，其含有保藏號(hào)為CGMCC No. 5269的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體和固相載體，所述單克隆抗體固定于所述固相載體上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述單克隆抗體通過共價(jià)連接方式固定于所述固相載體上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述固相載體為包被蛋白G或蛋白 A的瓊脂糖顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)試劑盒中還含有洗脫液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述洗脫液任選pH值2.7的 O. lmol/1甘氨酸-HCl溶液、5%乙酸或含O. 1%TFA的50_70%ACN溶液中的一種。
6.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟將純化后的單克隆抗體與固相載體懸浮液混合，使得終濃度為O. 15 yg/μ L-1. 5 yg/ μ L，在4 °C旋轉(zhuǎn)孵育15分鐘-2小時(shí)，放置l-5min，沉淀，移出上清液，用pH值7. 4的 O. Olmol/1 PBS緩沖液100-200 μ L清洗所述固相載體2_5次，即得所述檢測(cè)試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種食管癌免疫質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒含有保藏號(hào)為CGMCC No.5269的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體和固相載體，所述單克隆抗體固定于所述固相載體上。本發(fā)明所涉及的單克隆抗體針對(duì)多肽標(biāo)志物抗原的結(jié)合特異性強(qiáng)；采用免疫與質(zhì)譜技術(shù)連用，能實(shí)現(xiàn)食管癌高通量、高靈敏度、高精確度的檢測(cè)。此外，本發(fā)明屬于分子水平診斷技術(shù)，與腫瘤影像學(xué)相比操作簡單、成本低。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102998450SQ20121047943
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者魏開華, 肖漢族, 孫云波, 傅海媛, 侯利平, 黃亞娟, 宋純艷, 楊保安, 甄蓓, 徐淑芳, 張拓, 王東茂, 周曉明, 原劍 申請(qǐng)人:北京正旦國際科技有限責(zé)任公司, 湖南金健藥業(yè)有限責(zé)任公司