專利名稱：一種快速檢測(cè)沙門氏菌的熒光量子點(diǎn)篩選分離檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物食源性致病菌檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說是一種快速檢測(cè)沙門氏菌的熒光量子點(diǎn)篩選分離檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
近年來食品安全事故頻頻發(fā)生。國家食品衛(wèi)生監(jiān)督局的一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)顯示，在1994年至2003年間，由微生物細(xì)菌引起的食源性致病菌感染占食品中毒的37%到52%之間，其中沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌引起的食源性致病菌感染分別約占22%、6%、2%，而其中的鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌0157、福氏志賀氏菌是食源性致病菌中傳播最為廣泛的3種致病菌。許多食源性疾病大多都是由食源性致病菌引起的。而在細(xì)菌性食物中毒中發(fā)病率最高的是由沙門氏菌引起的食物中毒。沙門氏菌屬是腸桿菌科中重要的病原菌屬，是最常見的人畜共患疾病之一。沙門氏菌為革蘭氏陰性，其菌體大小為(O. 6 O. 9) X (I 3)微米，無芽胞，一般沒有莢膜，除雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌之外，通常具有周身鞭毛。潛伏期由數(shù)小時(shí)到1-2周，引起畏寒，發(fā)熱，惡心、嘔吐，腹痛和腹瀉等癥狀。常規(guī)的檢測(cè)方法，如經(jīng)典的微生物方法需要先對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，再選擇性增菌，而后分離培養(yǎng)，最后進(jìn)行生理生化鑒定和血清分型。由于操作煩瑣、靈敏度低、特異性差，且傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測(cè)方法從采樣到鑒定要4-7d，才能得出明確的診斷結(jié)果。顯然，這并不能滿足人們對(duì)有效的監(jiān)測(cè)、預(yù)防作用的期望。現(xiàn)在，沙門氏菌的檢測(cè)方法趨于多樣化，并不局限于微生物方法。通過物理、化學(xué)、生物等學(xué)科的結(jié)合，許多新型的檢測(cè)方法陸續(xù)誕生。如分子生物學(xué)方法，這是對(duì)病原微生物中的核酸物質(zhì)進(jìn)行特征鑒定。其中包括擴(kuò)增片段長度多態(tài)性技術(shù)(AFLP)、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)、核酸探針、基因芯片技術(shù)、噬菌體裂解試驗(yàn)；免疫學(xué)方法，這是以抗原和抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，再輔以免疫放大技術(shù)來鑒別細(xì)菌，通過病原體刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫球蛋白(抗體)的方法。其中包括酶聯(lián)免疫吸附、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附、免疫磁性分離技術(shù)、免疫熒光標(biāo)記、自動(dòng)酶標(biāo)免疫檢測(cè)儀、自動(dòng)酶標(biāo)免疫檢測(cè)儀；電阻抗法，它的檢出率和可靠性都非常高。這些方法具有操作簡便、快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。雖然提高了檢測(cè)的靈敏度，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，但是都存在一定的缺陷。例如ELISA對(duì)試劑的選擇性高，很難同時(shí)分析多種成分；對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)；分析分子量很小的化合物或很不穩(wěn)定的化合物有一定的困難。在致病菌的分子生物學(xué)檢測(cè)方法方面，由于檢樣中存在死的致病菌、特異性DNA或RNA片段存在同源性和檢樣中存在不可培養(yǎng)微生物的情況等問題，常常造成PCR檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)方法相比，陽性率變高的現(xiàn)象，除存在不可培養(yǎng)微生物的情況外，均屬于假陽性范疇。免疫磁性分離技術(shù)是將特異性抗體偶聯(lián)在磁性顆粒表面，與樣品中被檢致病菌發(fā)生特異性的結(jié)合，載有致病菌的磁性顆粒在外加磁場(chǎng)的作用下，向磁極方向聚集，棄去檢樣混合液，使致病菌不斷得到分離、濃縮。免疫磁性分離技術(shù)代替了常規(guī)的選擇性增菌培養(yǎng)過程，可特異有效地將目的微生物從樣品中快速的分離出來。因此，可用來建立一種致病性沙門氏菌快速分離檢驗(yàn)的體系。熒光半導(dǎo)體量子點(diǎn)有較長時(shí)間的熒光效應(yīng)和較寬的激發(fā)光譜，能被任何短于發(fā)射峰的波長有效激發(fā)，發(fā)出穩(wěn)定、均勻、狹窄的光譜。在同一波長光照下，不同尺寸的量子點(diǎn)有不同的發(fā)射峰。因其優(yōu)良的光化學(xué)穩(wěn)定性和光譜特性，免疫功能化量子點(diǎn)能對(duì)樣品中的目標(biāo)致病菌進(jìn)行特異性可視化標(biāo)記，并在熒光條件下進(jìn)行檢測(cè)。為了食品安全，為了尋求更簡便、快速、靈敏檢測(cè)食源性致病菌沙門氏菌，研發(fā)了一種快速檢測(cè)篩選沙門氏菌的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種以免疫功能化超順磁性納米粒子和免疫功能化的熒光量子點(diǎn)免疫識(shí)別目標(biāo)微生物，實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)食源性致病菌沙門氏菌的快速檢測(cè)沙門氏菌的方法。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種快速檢測(cè)沙門氏菌的熒光量子點(diǎn)篩選分離檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括沙門氏菌分離試劑、沙門氏菌檢測(cè)試劑、Buffer UBuffer 2 ；所述沙門氏菌分離試劑為分散有免疫功能化磁珠的磷酸鹽緩沖液，所述免疫功能化磁珠以Fe3O4核心，外層包裹二氧化硅的超順磁性納米磁珠顆粒，表面偶聯(lián)兔抗沙門氏菌多克隆抗體；所述沙門氏菌檢測(cè)試劑為分散有免疫功能化熒光量子點(diǎn)的磷酸鹽緩沖液，所述免疫功能化量子點(diǎn)為粒徑為5-10nm，發(fā)射峰為530nm的CdTe量子點(diǎn)顆粒表面偶聯(lián)兔抗沙門氏菌多克隆抗體；所述Buffer I含有pH=6. 0,0. OlM磷酸鹽緩沖液；所述Buffer 2含有pH=7. 2,0. OlM磷酸鹽緩沖液。所述沙門氏菌分離試劑的制備方法包括如下步驟(I)氨基化磁珠的制備將Fe3O4納米粒子分散于TritonX-100、環(huán)己烷和正己醇的混合體系中，用氨水調(diào)整體系的PH至8-10，滴加TEOS進(jìn)行水解，得表面包裹二氧化硅的磁性納米粒子，然后分散于甲醇和丙三醇的混合溶液(V甲醇^丙三醇=3:1)中，再加入AEAPS反應(yīng)5-6h，得表面修飾氨基的納米粒子，即氨基化磁珠；(2)連接抗體將氨基化磁珠分散到磷酸緩沖液(O. 01mol/mL,pH=7. 4)中，加入終濃度為1%的戊二醛，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3-4h后，用上述磷酸緩沖液洗去多余的戊二醛，加入沙門氏菌抗體繼續(xù)反應(yīng)3-4h后再加入4°C預(yù)冷的封閉液至終濃度為lmg/mL，4V反應(yīng)2h，固液分離，洗凈多余抗體，得到的免疫化功能磁珠，將得到的免疫化功能磁珠重新分散于上述緩沖溶液中，4°C保存?zhèn)溆?；所述封閉液為含10mg/mL牛血清白蛋白的緩沖液。所述沙門氏菌檢測(cè)試劑的制備方法包括如下步驟將表面修飾有羧基的CdTe量子點(diǎn)加入磷酸鹽緩沖液和交聯(lián)劑的混合溶液中，室溫下渦旋5-10min,再反應(yīng)15_20min以活化量子點(diǎn)上的自由羧基；加入保護(hù)劑，室溫渦旋15-20min，反應(yīng)60_70min ;與兔抗沙門氏菌多克隆抗體上的末端氨基交聯(lián)反應(yīng)生成酰胺鍵，得到免疫化的量子點(diǎn)，分散于磷酸鹽緩沖液(O. Olmol/mL，pH=7.2)中，O 4°C保存；兔抗沙門氏菌多克隆抗體與量子點(diǎn)的摩爾比為I :10至I 30 ;交聯(lián)劑為I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽；保護(hù)劑為N-羥基丁二酰亞胺。所述交聯(lián)劑在混合溶液中的濃度為10mg/mL至50mg/mL ;所述保護(hù)劑在混合溶液中的濃度為5mg/mL至20mg/mL。本發(fā)明還提供使用上述試劑盒快速檢測(cè)沙門氏菌的方法，包括如下步驟(I)取沙門氏菌分離試劑加入到根據(jù)中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 40-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》增菌處理后的樣品中，35-37°C振蕩2-3h，用Bufferl洗脫2_3次；(2)將經(jīng)步驟(I)處理后的反應(yīng)液與免疫功能化量子點(diǎn)混合，35_37°C振蕩2_3h，再用Buffer2洗脫3_4次；(3)按上海地方標(biāo)準(zhǔn)DB31/T455-2009《食品中沙門氏菌、志賀氏菌量子點(diǎn)抗體快速篩選法》對(duì)步驟(2)所得產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的方法通過免疫功能化超順磁性納米粒子與沙門氏菌發(fā)生特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)沙門氏菌的分離；通過免疫功能化的熒光量子點(diǎn)對(duì)沙門氏菌進(jìn)行特異性可視化標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)快速識(shí)別目標(biāo)菌。本發(fā)明方法中使用的磁珠、量子點(diǎn)和其它試劑均可事先制備，大大降低了檢測(cè)時(shí)間。


圖I為氨基化磁珠與抗體的連接示意圖。圖2為免疫量子點(diǎn)-沙門氏菌-免疫磁珠在可見光下的鏡檢圖。圖3為免疫量子點(diǎn)-沙門氏菌-免疫磁珠在紫外光激發(fā)下的鏡檢圖。圖4為空白對(duì)照組在可見光下的鏡檢圖。圖5為空白對(duì)照組在紫外光激發(fā)下的鏡檢圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說明實(shí)施例I免疫功能化磁珠(沙門氏菌分離試劑)的制備I)氨基化超順磁性納米磁珠的制備將TritonX-100、環(huán)己烷、正己醇先按4 1 1比例混合，攪拌均勻，用超聲使其形成透明穩(wěn)定的反相微乳液體系。加入2. 5g的Fe3O4粒子，再次用超聲使其分散均勻。將30mL濃氨水滴加到不斷攪拌的微乳液體系中，待濃氨水在體系中分散均勻之后，繼續(xù)向不斷攪拌的體系中緩慢滴加I. 5mLTE0S，整個(gè)加樣時(shí)間持續(xù)10h，靜置過夜。磁性分離后，用乙醇來洗滌納米粒子，收集表面包裹二氧化硅的磁性納米粒子(Si02/Fe304 MNPs)。隨后將制備得到的Si02/Fe304 MNPs分散于甲醇/丙三醇(V甲醇V丙三醇=3:1)混合溶液中。然后向攪拌體系加入5mL AEAPS,反應(yīng)5h后進(jìn)行離心分離，用乙醇和蒸餾水洗滌3 4次，得到了表面修飾氨基的納米粒子(NH2-Si02/Fe304 MNPs)。2)氨基化磁珠和兔抗沙門氏菌多克隆抗體的連接將O. 5mL氨基化納米磁珠分散到磷酸緩沖液中(O. 01mol/mL, pH=7. 4)，加入終濃度為1%的戊二醛，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h后，用上述磷酸緩沖液洗去多余的戊二醛。加入Img的沙門氏菌抗體繼續(xù)反應(yīng)3h后再加入4°C預(yù)冷的封閉液(含10mg/mL牛血清白蛋白的緩沖液)至終濃度為111^/1^，41反應(yīng)211。通過磁性分離洗凈多余的抗體，并將得到的免疫磁珠重新分散于緩沖溶液中(O. Olmol/mL, pH=7. 4)，4°C保存?zhèn)溆谩Ｃ庖吖δ芑孔狱c(diǎn)(沙門氏菌檢測(cè)試劑)的制備將60uL (2. 6*l(T5mol)的 CdTe 量子點(diǎn)(QDs)加入到磷酸緩沖溶液 PBS (O. Olmol/L，pH 7.2)和6mg EDC · HCL(最終濃度為20mg/mL)的混合液中，混合液室溫下渦旋5min，再反應(yīng)15-20min以便讓QDs上的自由羧基完全活化；將I. 5mg NHS (最終濃度為5mg/mL)加入到上面的混合液中，室溫渦旋15min，反應(yīng)60min ;在這步中，QDs上的自由羧基和NHS上的羥基酯化反應(yīng)生成半穩(wěn)定的具有胺活性的NHS (羥基丁二酰胺)-酯；
接下來120uL抗體(2mg/mL)加到體系中，渦旋至少2h，沒反應(yīng)的抗體分子最后通過超濾濃縮離心管去除掉，QDs和抗體通過強(qiáng)烈的共價(jià)鍵結(jié)合在一起，最后收集產(chǎn)品，O 4°C保存。實(shí)施例2用試劑盒對(duì)脫脂奶粉中的致病性沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)Buffer INaCl 8. 00g/L, Na2HPO4 I. 44g/L, KCl 0. 2g/L, KH2PO4 0. 24g/L, pH 值為 6. 0。Buffer 2NaCl 8. OOg/L, Na2HPO4 I. 44g/L, KCl 0. 2g/L, KH2PO4 0. 24g/L, pH 值為 7. 2。本實(shí)例包括以下步驟(I)根據(jù)中國國家標(biāo)準(zhǔn)的食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)(GB4789. 40-2010)，首先取IOOg奶粉到900mL的緩沖蛋白胨水中，分成兩份，一份作為實(shí)驗(yàn)組，加入預(yù)先培養(yǎng)好的沙門氏菌，另一份作為空白對(duì)照，不作處理。(2)分別取100 μ I免疫功能化磁珠加入到兩份2mL處理后的樣品中，于磁力架上35-37°C振蕩 2-3h，用 Bufferl 洗脫 2-3 次，(3)將(I)中200μ I處理后的反應(yīng)液與50μ I免疫功能化量子點(diǎn)混合，于磁力架上 35-37°C振蕩 2-3h，用 Buffer2 洗脫 3_4 次，(4)按上海地方標(biāo)準(zhǔn)DB31/T455-2009，將(3)中的最終產(chǎn)物，置于熒光顯微鏡下，先用低倍物鏡掃視整個(gè)標(biāo)本，再換較高倍物鏡繼續(xù)觀察，選擇蓋玻片上、中、下均勻分布的3個(gè)視野，記錄樣本中出現(xiàn)的綠色熒光亮度與菌量等情況。菌體量子點(diǎn)標(biāo)記情況表示如下+ :任一視野中可見綠色閃亮熒光，且菌體周圍及中心輪廓清晰。+/ (-):任一視野中綠色較弱熒光，且菌型尚可見；- 3個(gè)或以上視野無熒光，且菌型模糊；陽性及可疑陽性結(jié)果菌體綠色熒光亮度為+，菌體形態(tài)特征符合沙門菌，且任一視野中均能檢出有綠色熒光標(biāo)記的菌體；陰性結(jié)果3個(gè)或以上視野無紅色與綠色熒光，且菌形模糊為陰性。綠色一。表示樣本中不含沙門氏菌。(5)對(duì)陽性及可疑陽性進(jìn)行純(化)分離、生化學(xué)實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。
(6)報(bào)告結(jié)果。結(jié)果報(bào)告在加入沙門氏菌的實(shí)驗(yàn)組中，檢測(cè)結(jié)果為陽性，即菌體綠色熒光亮度為+，菌體形態(tài)特征符合沙門菌。從圖2、圖3中可以看出，被免疫磁珠分離出的沙門氏菌可被免疫量子點(diǎn)特異性結(jié)合。從圖4、圖5中可以看出，在未加入沙門氏菌的空白對(duì)照樣品中，檢測(cè)結(jié)果為陰性，即3個(gè)或以上視野無紅色與綠色熒光。綠色一。表示樣本中不含沙門氏菌。以上所述為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，但本發(fā)明不應(yīng)該局限于該實(shí)施例所公開的內(nèi)容。所以凡是不脫離本發(fā)明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發(fā)明保護(hù)的范圍?！?br> 權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)沙門氏菌的熒光量子點(diǎn)篩選分離檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括沙門氏菌分離試劑、沙門氏菌檢測(cè)試劑、Buffer 1> Buffer 2 ； 所述沙門氏菌分離試劑為分散有免疫功能化磁珠的磷酸鹽緩沖液，所述免疫功能化磁珠以Fe3O4核心，外層包裹二氧化硅的超順磁性納米磁珠顆粒，表面偶聯(lián)兔抗沙門氏菌多克隆抗體； 所述沙門氏菌檢測(cè)試劑為分散有免疫功能化熒光量子點(diǎn)的磷酸鹽緩沖液，所述免疫功能化量子點(diǎn)為粒徑為5-10nm，發(fā)射峰為530nm的CdTe量子點(diǎn)顆粒表面偶聯(lián)兔抗沙門氏菌多克隆抗體； 所述Buffer I含有pH=6. 0,0. OlM磷酸鹽緩沖液； 所述Buffer 2含有pH=7. 2,0. OlM磷酸鹽緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的沙門氏菌分離試劑的制備方法包括如下步驟 (1)氨基化磁珠的制備將Fe3O4納米粒子分散于TritonX-100、環(huán)己烷和正己醇的混合體系中，用氨水調(diào)整體系的PH至8-10，滴加TEOS進(jìn)行水解，得表面包裹二氧化硅的磁性納米粒子，然后分散于甲醇和丙三醇的混合溶液(V甲醇￥丙三醇=3:1)中，再加入AEAPS反應(yīng)5-6h，得表面修飾氨基的納米粒子，即氨基化磁珠； (2)連接抗體將氨基化磁珠分散到磷酸緩沖液(O.01mol/mL,pH=7. 4)中，加入終濃度為1%的戊二醛，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3-4h后，用上述磷酸緩沖液洗去多余的戊二醛，加入沙門氏菌抗體繼續(xù)反應(yīng)3-4h后再加入4°C預(yù)冷的封閉液至終濃度為lmg/mL，4°C反應(yīng)2h，固液分離，洗凈多余抗體，得到的免疫化功能磁珠，將得到的免疫化功能磁珠重新分散于上述緩沖溶液中，4°C保存?zhèn)溆茫凰龇忾]液為含10mg/mL牛血清白蛋白的緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的沙門氏菌檢測(cè)試劑的制備方法包括如下步驟 將表面修飾有羧基的CdTe量子點(diǎn)加入磷酸鹽緩沖液和交聯(lián)劑的混合溶液中，室溫下渦旋5-10min,再反應(yīng)15_20min以活化量子點(diǎn)上的自由羧基； 加入保護(hù)劑，室溫渦旋15-20min，反應(yīng)60_70min ;與兔抗沙門氏菌多克隆抗體上的末端氨基交聯(lián)反應(yīng)生成酰胺鍵，得到免疫化的量子點(diǎn)，分散于磷酸鹽緩沖液(O. Olmol/mL，ρΗ=7·2)中，O 4°C保存; 兔抗沙門氏菌多克隆抗體與量子點(diǎn)的摩爾比為I :10至I :30 ;交聯(lián)劑為I-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽；保護(hù)劑為N-羥基丁二酰亞胺。
4.權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，交聯(lián)劑在混合溶液中的濃度為lOmg/mL至50mg/mLo
5.權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，保護(hù)劑在混合溶液中的濃度為5mg/mL至20mg/mLo
6.一種使用權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述試劑盒快速檢測(cè)沙門氏菌的方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)取沙門氏菌分離試劑加入到根據(jù)中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.40-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》增菌處理后的樣品中，35-37°C振蕩2-3h，用Bufferl洗脫2_3次； (2)將經(jīng)步驟(I)處理后的反應(yīng)液與免疫功能化量子點(diǎn)混合，35-37°C振蕩2-3h，再用Buffer2 洗脫 3-4 次； (3)按上海地方標(biāo)準(zhǔn)DB31/T455-2009《食品中沙門氏菌、志賀氏菌量子點(diǎn)抗體快速篩選法》對(duì)步驟(2)所得產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)沙門氏菌的熒光量子點(diǎn)篩選分離檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明的試劑盒通過免疫功能化超順磁性納米粒子與沙門氏菌發(fā)生特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)沙門氏菌的分離；通過免疫功能化的熒光量子點(diǎn)對(duì)沙門氏菌進(jìn)行特異性可視化標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)快速識(shí)別目標(biāo)菌。本發(fā)明中使用的磁珠、量子點(diǎn)和其它試劑均可事先制備，大大降低了檢測(cè)時(shí)間。
文檔編號(hào)G01N33/533GK102928590SQ20121048008
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者趙渝, 姚玉婷, 李先富, 趙琨, 陶珊珊 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)