專利名稱：一種豬Ⅰ型細環(huán)病毒TTSuV1抗體間接ELISA診斷試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸醫(yī)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒及其制備方法，建立TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒用于檢測豬血清中TTSuVl的抗體水平。
背景技術(shù)：
輸血傳播病毒(TransufsionTransmitted Viurs,TTV)是一類無囊膜，二十面體，單股負鏈環(huán)狀DNA病毒，電鏡觀察病毒顆粒直徑約為30 -32nm。TTV首次由日本學(xué)者從一例未知病原的非甲一非戊型輸血后肝炎病人的血清中發(fā)現(xiàn)，隨后人們在非靈長類以及豬、牛、羊、犬，貓、家禽等多種家養(yǎng)及野生動物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了 TTV的感染。2009年，國際病毒分類協(xié)會(ICTV)將豬的TTV劃分到指環(huán)病毒科(Anelloviridae)細環(huán)病毒屬(Iotatorquevirus),細環(huán)病毒屬進一步劃分為兩個種；豬I型細環(huán)病毒(Torque teno sus virus I , TTSuVl)和豬I型細環(huán)病毒(Torque teno sus virus II,TTSuV2)。作為一種較為新型的病毒，TTSuV2的致病機理知之甚少。2004年，McKeown對中國，愛荷華州，泰國，安大略，韓國，西班牙，魁北克和薩斯喀徹溫省這六個不同國家地區(qū)的154份豬血清進行檢測，TTSuV2陽性率可高達66. 2%(102/154)。Aramouni等證實了 TTSuVl與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)和豬皮炎腎病綜合征(PDNS)之間有一定的聯(lián)系并發(fā)現(xiàn)TTSuV2與其他已知的豬病原體協(xié)同感染可以導(dǎo)致疾病加重。近年來，關(guān)于TTSuVl和TTSuV2的報道逐漸增多，TTSuV2的感染具有廣泛性和普遍性，這一特點引起了諸多科研工作者的關(guān)注。因此，加強對TTSuV2的流行病學(xué)調(diào)查，確定其抗原性點，對TTSuV2的防治有十分重要的意義。目前，國內(nèi)外對TTSuVl和TTSuV2的流行病學(xué)報道中，較為注重TTSuV2的感染情況，TTSuV2的感染似乎在增強PMWS和TONS病癥方面起著更為重要的作用，目前已經(jīng)有報道建立了 TTSuV2抗體診斷的“阻斷ELISA法”。然而，在幾乎所有報道中，TTSuVl在豬血清中超過30%的檢出率(PCR方法)足以引起人們對TTSuVl危害的重視。國內(nèi)外逐漸建立了TTSuVl病毒核酸診斷(PCR)的方法，尚無關(guān)于TTSuVl抗體診斷(ELISA)試劑盒的報道。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒，建立的TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可以檢測豬血清中TTSuVl的抗體水平。本發(fā)明的另一目的在于提供一種豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒的制備方法。為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下一種豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒，其包括用酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白包被抗原包被的酶標(biāo)板，以及用TTSuVl唯一結(jié)構(gòu)蛋白ORFl作為免疫診斷抗原篩選出的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，其中用酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白的序列為SEQ ID NO:1。本發(fā)明中，所述的豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒，其還包括1)HRP標(biāo)記的兔抗豬二抗液兔抗豬二抗與HRP保護液按照體積比為1:2000-3000的比例稀釋，用量為100μ I ；2)抗體稀釋液0. 1%BSAL Og 加入 PBS 至 1000ml，用量為 100 μ I ；3)顯色液50mg TMB, IOmL DMSO, 9. 8g檸檬酸和1. 2ml 30%H202加蒸餾水定容至1000ml，用量為 100μ I ；4)終止液雙蒸水178. 3mL和98%的濃硫酸21. 7mL混合，用量為100 μ I。
優(yōu)選的方案中，上述豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒還包括pH 值為 7. 4,0. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12H20,8. Og NaCl，0.2g KCl，0.5mL 0. 05% (V/V)Tween-20,加雙蒸水定容至100ml的洗脫液。作為一個優(yōu)選的方案中，所述的豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒中，用酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋包被抗原包被的酶標(biāo)板的包被濃度為O. 25 I μ g/ml0一種豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒的制備方法，其包括以下步驟I)酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白包被抗原的制備a. TTSuVl ORFla序列獲取結(jié)合Genebank數(shù)據(jù)庫中TTSuVl序列信息,在病毒基因組序列保守區(qū)設(shè)計診斷引物SEQ ID N0:2和引物SEQ ID N0:3;應(yīng)用rTaq DNA聚合酶PCR擴增目的片段，PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，純化、測序獲得已測序列；然后在已測序列基礎(chǔ)上設(shè)計反向擴增引物SEQ ID N0:4和引物SEQ ID NO: 5，擴增包括TTSuVl ORFl全序列的病毒基因序列；應(yīng)用LA TaqDNA聚合酶PCR反向擴增目的片段，對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，純化、獲得TTSuVl ORFla蛋白；b. TTSuVl ORFla的酵母表達應(yīng)用Primer Premier5. O設(shè)計表達引物SEQ ID N0:6和引物SEQ ID N0:7，以TTSuVl陽性核酸為模板，應(yīng)用Kod plus高保真酶的PCR反應(yīng)，電泳、純化目的條帶后，雙酶切PCR產(chǎn)物及載體，連接，轉(zhuǎn)化E. col1:DH5a，提取重組質(zhì)粒pPICZ a -TTSuVl ORFla, Sac I單酶切線性化；將酵母菌X-33制備成感受態(tài)細胞，取80 μ L感受態(tài)細胞與5 10 μ g線性化的重組表達質(zhì)?；旌希D(zhuǎn)入0. 2cm電轉(zhuǎn)杯，電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化后的菌液用Iml冰浴山梨醇10倍稀釋后，涂布于基本葡萄糖培養(yǎng)基選擇平板上，置于30°C培養(yǎng)2 3d，在200-1000 μ g/ml濃度Zeocin的YPD平板上篩選具有高Zeocin抗性且生長良好的菌株作為表達株，接種單菌落于25ml BMGY培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)至OD6tltlnm 4. O ;離心、收集菌體，用100ml BMMY培養(yǎng)基重懸培養(yǎng),每日取樣Iml,并補加純甲醇于培養(yǎng)基至終濃度為0. 5%，誘導(dǎo)表達6d，取樣品離心收集上清作SDS-PAGE分析，以Ant1-HIS_antibody為第一抗體，Western Blotting篩選出步驟I) TTSuVl ORFla蛋白的高考貝子；c. TTSuVl ORFla純化取步驟2)中的篩選出的高考貝子，用50%硫酸銨沉淀上清中蛋白，溶解，應(yīng)用親和層析的方法純化酵母表達系統(tǒng)表達的重組TTSuVl ORFla在PBS中透析后，應(yīng)用BCA法進行定量，獲得酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白，序列為SEQ IDNO:1 ；
2)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的篩選a.構(gòu)建插入pET-21空載體的TTSuVl ORFl原核表達載體應(yīng)用PrimerPremier5. O 設(shè)計引物 SEQ ID N0:8 和 SEQ ID N0:9，以 TTSuVl 陽性核酸為模板，PCR擴增，回收純化PCR目的片段，雙酶切PCR產(chǎn)物及pET-21空載體、連接、轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α后挑取單克隆菌落，提取質(zhì)粒，將正確構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli =Rosetta(DE3)pLysS感受態(tài)細胞，鑒定出陽性克隆，陽性克隆接種2ml LA液體培養(yǎng)基，37°C，180rpm至菌液OD值達到O. 6時加入ImM IPTG，誘導(dǎo)6小時，離心收集菌泥，加入Loading buffer煮沸樣品，SDS-PAGE分析蛋白表達，應(yīng)用Western blotting驗證,獲得TTSuVl ORFl重組蛋白；
b. TTSuVl標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的篩選制備TTSuVl ORFl重組蛋白，切膠純化、乳化后以5mg/頭的劑量免疫2月齡無TTSuVl病原(PCR檢測)的仔豬，I個月后以相同劑量重復(fù)免疫，15天后，采血進行Western Blotting和ELISA實驗，將實驗證明為陽性的血清為TTSuVl抗體參考陽性血清；利用酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白為固相包被物，對50份血清進行ELISA檢測，篩選出與參考陽性血清Western blotting和ELISA實驗反應(yīng)信號一致的血清為標(biāo)準(zhǔn)陽性血清；免疫學(xué)實驗無信號，且PCR檢測TTSuVl病原陰性的血清為標(biāo)準(zhǔn)陰性血清；3)確定抗原包被濃度和二抗稀釋度采用棋盤滴定法，先取陽性O(shè)D45tlnm值在I左右的，然后再從中找出陽性血清OD45tol值和陰性血清OD45tlnm值之比最高的反應(yīng)孔的抗原濃度和二抗稀釋度為最佳抗原包被濃度和二抗稀釋度；4)試劑盒的組裝按照確定好的包被濃度，用酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白包被酶標(biāo)板，將酶標(biāo)板I塊、標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清各I管、抗體稀釋液I瓶、酶標(biāo)二抗I瓶、底物顯色液I瓶、終止液I瓶、操作說明書一份組裝成ELISA試劑盒。上述制備方法中，步驟I)應(yīng)用rTaq DNA聚合酶PCR擴增目的片段具體程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸30s，設(shè)置35個循環(huán)，72°C延伸Smin ;擴增完成后用1. 0%的瓊脂糖凝膠對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳。上述制備方法中，步驟I)應(yīng)用LA Taq DNA聚合酶PCR反向擴增目的片段具體程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸120s，設(shè)置30個循環(huán)，72°C延伸8min ;擴增完成后用0. 8%的瓊脂糖凝膠對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳。上述制備方法中，步驟I) Kod plus高保真酶的PCR反應(yīng)的具體程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，52。。退火30s，68。。延伸45s,設(shè)置30個循環(huán)，68°C延伸8min。上述制備方法中，步驟2)PCR擴增的條件為94°C 5min ；94°C 30S，52°C 30S，68°C120S，30 個循環(huán)；68°C延伸 IOmin0上述制備方法中，步驟3)棋盤滴定法的具體步驟為將酵母表達的TTSuVlORFla重組蛋白在酶標(biāo)板上從左到右以起始濃度為4 μ g/ml按照在后的孔濃度為在先孔濃度的1/2的梯度濃度稀釋包被酶標(biāo)板，最后一列作為空白對照，每孔包被100μ 1，37°C放置I小時，用PBST洗板I次，每孔加入10%羔羊血清，37°C封閉I小時，陽性對照血清和陰性對照血清分別進行梯度稀釋，自上而下加入到酶標(biāo)板中，每孔加入100μ 1，最后一行為無血清對照，37°C反應(yīng)I小時，PBST洗滌3次，每孔加入100 μ I的HRP標(biāo)記兔抗豬二抗，37°C反應(yīng)I小時，PBST洗滌3次，每孔加入底物顯色液100 μ 1，避光顯色10分鐘，每孔加入100μ L終止液，于450nm處讀數(shù)儀讀取OD值，620nm作為參考波長。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于通過本發(fā)明的制備方法制備的豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒，TTSuVl抗體陽性血清中存在的TTSuVl ORFla重組蛋白可以競爭性抑制血清中抗體與固相包被抗原的結(jié)合，本發(fā)明的試劑盒對TTSuVl抗體的特異性較好，本發(fā)明的試劑盒批內(nèi)和批間的最大變異系數(shù)(CV)分別為6. 87%和11. 4%，均低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的15%，因此，本發(fā)明的試劑盒具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。下面結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明作進一步詳細說明。
具體實施例方式以下是本發(fā)明具體優(yōu)選的實施例。 實施例1豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒，其包括用酵母表達的TTSuVlORFla重組蛋白包被抗原包被的酶標(biāo)板，以及用TTSuVl ORFl作為免疫診斷抗原篩選出的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，其中用酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白的序列為SEQ IDNO: 1，酶標(biāo)板的包被濃度為包被濃度為O. 25 μ g/ml ;HRP標(biāo)記的兔抗豬二抗液12ml :即兔抗豬二抗IgM與HRP保護液按照體積比為1: 2000的比例稀釋；抗體稀釋液12ml ;顯色液12ml ;終止液12ml ;以及洗脫液12ml。實施例2豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒，其包括用酵母表達的TTSuVlORFla重組蛋白包被抗原包被的酶標(biāo)板，以及用TTSuVl ORFl作為免疫診斷抗原篩選出的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，其中用酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白的序列為SEQ IDNO: 1，酶標(biāo)板的包被濃度為包被濃度為O. 5 μ g/ml ；HRP標(biāo)記的兔抗豬二抗液12ml :即兔抗豬二抗IgM與HRP保護液按照體積比為1: 2500的比例稀釋；抗體稀釋液12ml ;顯色液12ml ;終止液12ml ;以及洗脫液12ml。實施例3豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒，其包括用酵母表達的TTSuVlORFla重組蛋白包被抗原包被的酶標(biāo)板，以及用TTSuVl ORFl作為免疫診斷抗原篩選出的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，其中用酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白的序列為SEQ IDNO: 1，酶標(biāo)板的包被濃度為包被濃度為I μ g/ml ；HRP標(biāo)記的兔抗豬二抗液12ml :即兔抗豬二抗與HRP保護液按照體積比為1: 3000的比例稀釋；抗體稀釋液12ml ;顯色液12ml ;終止液12ml ;以及洗脫液12ml。應(yīng)用實施例1應(yīng)用本發(fā)明所述的豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒檢測40份病豬血清(采自廣東增城某豬場)；操作步驟如下(I)將純化的TTSuVl ORFla重組蛋白用包被液稀釋到O. 5 μ g/ml，加到酶標(biāo)板上，每孔100μ 1，37。。放置I小時。用PBST洗板I次，每孔加入含10%羔羊血清的PBST，37°C封閉I小時；(2)將待檢血清樣品用PBST稀釋40倍，加到酶標(biāo)板上，每孔100 μ 1，設(shè)置陰性和陽性對照，37°C反應(yīng)I小時；(3光851'洗滌3次，每孔加入10(^1的HRP標(biāo)記兔抗豬二抗(3000倍稀釋)，37°C反應(yīng)I小時，PBST洗滌3次，每孔加入底物顯色液100 μ 1，避光顯色10分鐘，每孔加入100 μ I終止液，于450nm處讀數(shù)儀讀取OD值；結(jié)果如下表1:表1:40份豬血清的OD值·
權(quán)利要求
1.一種豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于其包括用酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白包被抗原包被的酶標(biāo)板，以及用TTSuVl ORFl作為免疫診斷抗原篩選出的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，其中用酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白的序列為SEQ ID NO:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于其還包括 DHRP標(biāo)記的兔抗豬二抗液兔抗豬二抗與HRP保護液按照體積比為1: 2000-3000的比例稀釋，用量為IOOiU ; 2)抗體稀釋液0.l%BSA1.0g加入PBS至1000ml，用量為100 U I ； 3)顯色液50mgTMB，IOmL DMS0，9. 8g檸檬酸和1. 2ml 30% H2O2加蒸餾水定容至1000ml，用量為 IOOu I ； 4)終止液雙蒸水178.3mL和98%的濃硫酸21. 7mL混合，用量為100 yl。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于其還包括 pH 值為 7.4，0. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 12H20，8. Og NaCl，0.2g KCl,0. 5mL 0. 05% (V/V) Tween-20，加雙蒸水定容至100ml的洗脫液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于用酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋包被抗原包被的酶標(biāo)板中，包被濃度為 0. 25 I u g/ml o
5.一種豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒的制備方法，其特征在于其包括以下步驟 I)酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白包被抗原的制備 a.TTSuVl ORFla序列獲取結(jié)合Genebank數(shù)據(jù)庫中TTSuVl序列信息,在病毒基因組序列保守區(qū)設(shè)計診斷引物SEQ ID N0:2和引物SEQ ID N0:3;應(yīng)用rTaq DNA聚合酶PCR擴增目的片段，PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，純化、測序獲得已測序列；然后在已測序列基礎(chǔ)上設(shè)計反向擴增引物SEQ ID N0:4和引物SEQ ID NO:5，擴增包括TTSuVl ORFl全序列的病毒基因序列；應(yīng)用LA Taq DNA聚合酶PCR反向擴增目的片段，對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，純化、獲得TTSuVl ORFla蛋白； b.TTSuVl ORFla的酵母表達應(yīng)用Primer Premier5. 0設(shè)計表達引物SEQ IDN0:6和引物SEQ ID NO:7，以TTSuVl陽性核酸為模板，應(yīng)用Kod plus高保真酶的PCR反應(yīng)，電泳、純化目的條帶后，雙酶切PCR產(chǎn)物及載體，連接，轉(zhuǎn)化E. col1:DH5a，提取重組質(zhì)粒pPICZa-TTSuVI ORFla, Sac I單酶切線性化；將酵母菌X-33制備成感受態(tài)細胞，取80mL感受態(tài)細胞與5 IOmg線性化的重組表達質(zhì)?；旌?，轉(zhuǎn)入0. 2cm電轉(zhuǎn)杯，電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化后的菌液用I ml冰浴山梨醇10倍稀釋后，涂布于基本葡萄糖培養(yǎng)基選擇平板上，置于30°C培養(yǎng)2 3 d，在200-1000mg/ml濃度Zeocin的YPD平板上篩選具有高Zeocin抗性且生長良好的菌株作為表達株，接種單菌落于25 ml BMGY培養(yǎng)基，于30°C培養(yǎng)至OD6tltlnmM. 0 ;離心、收集菌體，用100 ml BMMY培養(yǎng)基重懸培養(yǎng),每日取樣lml,并補加純甲醇于培養(yǎng)基至終濃度為0. 5%，誘導(dǎo)表達6 d，取樣品離心收集上清作SDS-PAGE分析，以Ant1-HIS_antibody為第一抗體，Western Blotting篩選出步驟I) TTSuVl ORFla蛋白的高拷貝子； c.TTSuVl ORFla純化取步驟2)中的篩選出的高考貝子，用50%硫酸銨沉淀上清中蛋白，溶解，應(yīng)用親和層析的方法純化酵母表達系統(tǒng)表達的重組TTSuVl ORFla在PBS中透析后，應(yīng)用BCA法進行定量，獲得酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白，序列為SEQ ID NO:1 ； 2)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的篩選 a.構(gòu)建插入pET-21空載體的TTSuVlORFl原核表達載體應(yīng)用Primer Premier5. 0設(shè)計引物SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9，以TTSuVl陽性核酸為模板，PCR擴增，回收純化PCR目的片段，雙酶切PCR產(chǎn)物及pET-21空載體、連接、轉(zhuǎn)化E. col1:DH5a后挑取單克隆菌落，提取質(zhì)粒，將正確構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli =Rosetta(DE3) pLysS感受態(tài)細胞，鑒定出陽性克隆，陽性克隆接種2 ml LA液體培養(yǎng)基，370C，180 rpm至菌液OD值達到0. 6時加入ImMIPTG，誘導(dǎo)6小時，離心收集菌泥，加入Loading buffer煮沸樣品，SDS-PAGE分析蛋白表達，應(yīng)用Western blotting驗證,獲得TTSuVl ORFl重組蛋白； b.TTSuVl標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清的篩選制備TTSuVl ORFl重組蛋白，切膠純化、乳化后以5 mg/頭的劑量免疫2月齡無TTSuVl病原(PCR檢測)的仔豬，I個月后以相同劑量重復(fù)免疫，15天后，采血進行Western Blotting和ELISA實驗，將實驗證明為陽性的血清為TTSuVl抗體參考陽性血清；利用酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白為固相包被物，對50份血清進行ELISA檢測，篩選出與參考陽性血清Western blotting和ELISA實驗反應(yīng)信號一致的血清為標(biāo)準(zhǔn)陽性血清；免疫學(xué)實驗無信號，且PCR檢測TTSuVl病原陰性的血清為標(biāo)準(zhǔn)陰性血清； 3)確定抗原包被濃度和二抗稀釋度 采用棋盤滴定法，先取陽性O(shè)D45tlnm值在I左右的，然后再從中找出陽性血清OD45tol值和陰性血清OD45tlnm值之比最高的反應(yīng)孔的抗原濃度和二抗稀釋度為最佳抗原包被濃度和二抗稀釋度； 4)試劑盒的組裝 按照確定好的包被濃度，用酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白包被酶標(biāo)板，將酶標(biāo)板I塊、標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清各I管、抗體稀釋液I瓶、酶標(biāo)二抗I瓶、底物顯色液I瓶、終止液I瓶、操作說明書一份組裝成ELISA試劑盒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒的制備方法，其特征在于步驟I)中應(yīng)用rTaq DNA聚合酶PCR擴增目的片段具體程序為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30 s，52°C退火30 s，72°C延伸30s，設(shè)置35個循環(huán)，72°C延伸8min ;擴增完成后用1.0%的瓊脂糖凝膠對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒的制備方法，其特征在于步驟I)中應(yīng)用LA Taq DNA聚合酶PCR反向擴增目的片段具體程序為.94°C預(yù)變性5min，94°C變性30 s，52°C退火30 s，72°C延伸120s，設(shè)置30個循環(huán)，72°C延伸8 min ;擴增完成后用0. 8%的瓊脂糖凝膠對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒的制備方法，其特征在于步驟I)中Kod plus高保真酶的PCR反應(yīng)的具體程序為94°C預(yù)變性.5min，94°C變性 30 s，52°C退火 30 s，68°C延伸 45s,設(shè)置 30 個循環(huán)，68°C延伸 8 min。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒的制備方法，其特征在于步驟2)中PCR擴增的條件為94°C 5min ；94°C 30 S，52°C 30 S，68°C.120 S，30 個循環(huán)；68°C延伸 10 min。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬I型細環(huán)病毒TTSuVl抗體間接ELISA診斷試劑盒的制備方法，其特征在于步驟3)中棋盤滴定法的具體步驟為將酵母表達的TTSuVl ORFla重組蛋白在酶標(biāo)板上從左到右以起始濃度為4 mg/ml按照在后的孔濃度為在先孔濃度的1/2的梯度濃度稀釋包被酶標(biāo)板，最后一列作為空白對照，每孔包被100 ml，37°C放置I小時，用PBST洗板I次，每孔加入10%羔羊血清，37°C封閉I小時，陽性對照血清和陰性對照血清分別進行梯度稀釋，自上而下加入到酶標(biāo)板中，每孔加入100ml，最后一行為無血清對照，37°C反應(yīng)I小時，PBST洗滌3次，每孔加入100 ml的HRP標(biāo)記兔抗豬二抗，37°C反應(yīng)I小時，PBST洗滌3次，每孔加入底物顯色液100 ml，避光顯色10分鐘，每孔加入100 ml終止液，于450nm處讀數(shù)儀讀取OD值，620nm作為參考波長。
全文摘要
本發(fā)明公開一種豬Ⅰ型細環(huán)病毒TTSuV1抗體間接ELISA診斷試劑盒及其制備方法，通過酵母表達的TTSuV1ORF1a重組蛋白包被抗原制備、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清篩選、確定抗原包被濃度和血清稀釋度、試劑盒的組裝等步驟建立TTSuV1抗體間接ELISA診斷試劑盒，用于檢測豬血清中TTSuV1抗體水平。TTSuV1ORF1a重組蛋白可以競爭性抑制血清中抗體與固相包被抗原的結(jié)合，本發(fā)明的試劑盒對TTSuV1抗體的特異性較好，試劑盒批內(nèi)和批間的最大變異系數(shù)(CV)分別為6.87%和11.4%，均低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的15%，使試劑盒具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
文檔編號G01N33/577GK102998453SQ20121048510
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月23日
發(fā)明者李中圣, 羅鈞, 陳善真, 趙焱 申請人:廣東現(xiàn)代農(nóng)業(yè)集團研究院有限公司