專利名稱：一種快速測定三七愈傷組織中皂苷含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速測定三七愈傷組織中皂苷含量的方法。
背景技術(shù)：
三Al\_Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen]為五加科人參屬植物,根和根莖入藥，是云南的道地藥材。三七做為傳統(tǒng)中藥已有悠久的應(yīng)用歷史，清代藥學(xué)著作《本草綱目拾遺》中記載“人參補(bǔ)氣第一，三七補(bǔ)血第一，味同而功亦等，故稱人參三七，為中藥之最珍貴者”。三七具有活血和止血的雙重功效，是馳名中外的“云南白藥”的重要成分。三七主產(chǎn)于我國云南省文山州，均為栽培品，全世界98%的三七原藥材產(chǎn)于云南。
三七阜苷(saponins of Panax notoginseng, PNS)是三七的主要藥用成分，由多種達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂苷組成，未發(fā)現(xiàn)含有齊墩果酸型皂苷，這與人參和西洋參有顯著區(qū)另IJ。三七在防治心腦血管疾病方面表現(xiàn)出安全、可靠的療效，以三七皂苷為主要活性成分的藥品市場已達(dá)20億人民幣/年。三七為多年生草本植物，一般需種植3年以上方可入藥，較長的生長周期、苛刻的生境要求以及巨大的市場需求導(dǎo)致藥材供需矛盾日益凸顯。2012年的三七藥材價格已經(jīng)是2008年的5倍。傳統(tǒng)的藥材栽培已很難滿足日漸增加的市場需求，迫切需要采用現(xiàn)代生物技術(shù)手段解決三七藥材短缺問題。其中最有效而直接的方法就是通過體外培養(yǎng)三七愈傷組織獲得三七總皂苷。三七總皂苷含量測定的傳統(tǒng)過程為乙醇或甲醇粗提皂苷，然后過大孔樹脂進(jìn)行純化，除去多糖等雜質(zhì)，最后采用香草醛-冰乙酸顯色法，根據(jù)550 nm的吸光度值確定三七總皂苷的含量。該方法準(zhǔn)確可靠，但需要用到柱層析操作，費時費力。本發(fā)明簡化了三七皂苷含量測定方法，對粗提皂苷進(jìn)行直接顯色反應(yīng)，大大簡化了操作步驟。該檢測過程采用化學(xué)計量學(xué)方法綜合分析多波長數(shù)據(jù)，引入多波長為自變量，可排除雜質(zhì)干擾影響，實現(xiàn)三七愈傷組織中的三七總皂苷含量的測定。該法操作簡便，準(zhǔn)確性高，具有較好的實用性和可推廣性，國內(nèi)外未見相關(guān)研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測三七愈傷組織中皂苷含量的方法。該方法的操作步驟如下
1)三七愈傷組織的皂苷提取精確稱取干燥至恒重的三七愈傷組織粉末，置于洗凈的三角瓶中，按I g樣品加入50-70 mL甲醇，采用常規(guī)的有機(jī)溶劑提取法對三七愈傷組織粉末進(jìn)行常溫超聲波處理1-2 h，過濾，收集濾液，將濾液揮干后再用甲醇溶解，定容至超聲提取時溶液體積的二分之一，即得到提取液；
2)三七皂苷含量測定精確吸取上步獲得的提取液樣品300UL至帶塞的10 mL試管中(設(shè)3個重復(fù))，水浴(溫度低于55°C )揮干溶劑，加入新配制的香草醛-冰乙酸(1:20，v/V)溶液0. 2 mL,高氯酸0. 8 mL,混勻后60°C以下水浴加熱15 min (過程中適當(dāng)震蕩使其反應(yīng)充分)，立即用冰水冷卻，加入5mL冰乙酸，混勻靜置10 min后對顯色液進(jìn)行400-700 nm區(qū)間的吸光度掃描；
3)光譜數(shù)據(jù)分析和處理，采用化學(xué)計量學(xué)中的偏最小二乘法處理步驟2)中獲得的吸收光譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集范圍530-570 nm，基于可見光區(qū)的吸收光譜數(shù)據(jù)，建立測定三七總皂苷含量的回歸方程，應(yīng)用回歸方程計算樣品中三七總皂苷的含量。以上發(fā)明方法沒有復(fù)雜的樣品前處理和分離純化過程，可在短時間內(nèi)實現(xiàn)三七愈傷組織中三七皂苷含量的快速檢測，方便實用。當(dāng)提取液中皂苷含量大于5 mg/L時，該發(fā)明方法的檢測誤差可小于1%，表明該方法具有較高的測量準(zhǔn)確性，可滿足三七皂苷的含量檢測需求。目前，國內(nèi)外還未見有關(guān)三七愈傷組織中皂苷簡便、快速測定的相關(guān)報道。
具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容。實施例I :快速測定三七愈傷組織皂苷含量的方法，具體操作如下
1)三七愈傷組織的皂苷提取精確稱取干燥至恒重的三七愈傷組織粉末Ig，置于洗凈的100 mL三角瓶中，加入50 mL甲醇常溫超聲波處理lh，過濾，收集濾液，將濾液揮干后再用甲醇溶解，定容至25 mL,即得到提取液；
2)三七總皂苷含量測定精確吸取上步獲得的提取液樣品300UL至帶塞的10 mL試管中(設(shè)3個重復(fù))，水浴(溫度50 °C)揮干溶劑，加入新配制的香草醛-冰乙酸溶液(1:20，v/v)0. 2 mL，高氯酸0.8 mL，混勻后55 1水浴加熱15 min (過程中適當(dāng)震蕩使其反應(yīng)充分)，立即用冰水冷卻，加入5 mL冰乙酸,混勻靜置10 min后對顯色液進(jìn)行400-700 nm區(qū)間的吸光度掃描；
3)光譜數(shù)據(jù)分析和處理采用化學(xué)計量學(xué)中的偏最小二乘法處理步驟2)中獲得的吸收光譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集范圍545-555nm，基于可見光區(qū)的吸收光譜數(shù)據(jù)，建立測定三七總皂苷含量的回歸方程，本實施例中建立的回歸方程為
Y=1037. 7672+2215242. 4517x「2794868. 9232 x2-2740603. 4293x3+2034602. 7140 x4+4499565. 2244 x5_528134.5510 x6_4013518.1178 x7_1818522. 0241x8+1572072. 7991 x9+5058327. 3974 x10-3488339. 6909 X11
其中Y表示三七總皂苷的含量，X1-X11代表吸收光譜圖中545-555 nm波長范圍內(nèi)每間隔I nm的吸光度數(shù)值，例如X1和X11分別是545 nm和555 nm下的吸光度值，用該回歸方程對8個樣品中三七總皂苷含量進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如表I所示。表I樣品中三七總皂苷含量真實值和回歸方程預(yù)測值比較
擇號I真實值(Pg/mL)I預(yù)測值(Pg/mL)|預(yù)測相對誤差
1115.2~ 116.00.69%
287.2~86.9-0. 38%
396.9~96.90.01%
4101. 9— 101. 7-0. 17%
583.9~83.4-0. 58%
698. I~98.40.26%
7160.4— 160. I-0. 17%
8~丨54. 2丨54. 4|o. 34%如表I所示，選取545-555 nm下的吸光度數(shù)據(jù)，利用偏最小二乘法獲得回歸方程，預(yù)測值和真實值相對誤差小于1%，可以用該方程準(zhǔn)確測定體系中三七總皂苷的含量。
實施例2 :快速測定三七愈傷組織皂苷含量的方法，具體操作如下
I)三七愈傷組織的皂苷提取精確稱取干燥至恒重的三七愈傷組織粉末I g左右，置于洗凈的200 mL三角瓶中，加入70 mL甲醇常溫超聲波處理I h，過濾，收集濾液，將濾液揮干后再用甲醇溶解，定容至35 mL,得提取液。2)三七總皂苷含量測定精確吸取上步獲得的提取液樣品300 u L至帶塞的10mL試管中(設(shè)3個重復(fù))，水浴(溫度50 °C)揮干溶劑，加入新配制的香草醛-冰乙酸溶液(1:20, v/v)0. 2 mL，高氯酸0.8 mL，混勻后55 1水浴加熱15 min (過程中適當(dāng)震蕩使其反應(yīng)充分)，立即用冰水冷卻，加入5 mL冰乙酸，混勻靜置10 min后對顯色液進(jìn)行400-700nm區(qū)間的吸光度掃描；
3)光譜數(shù)據(jù)分析和處理。采用化學(xué)計量學(xué)中的偏最小二乘法處理步驟2)中獲得的吸收光譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集范圍530-544nm，基于可見光區(qū)的吸收光譜數(shù)據(jù)，建立測定三七總皂苷含量的回歸方程。本實施例中建立的回歸方程為
Y=555. 8740-14255. 8059xr6540. 6106x2+1675. 7567x3+9591. 2782x4+16293.1148x5+21311. 5804x6+23734. 2390x7+22819. 6828x8+18522. 4603x9+11054. 6866x10+1156. 1-087xn-10284. 7702x12-21796. 8781x13_33349. 2881x14_43911. 2139x15
其中Y表示三七總皂苷的含量，X1-X15代表吸收光譜圖中530-544nm波長范圍內(nèi)每間隔I nm的吸光度數(shù)值,例如X1和X15分別是530 nm和544 nm下的吸光度值。用該回歸方程對8個樣品中三七總皂苷含量進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如表2所示。表2樣品中三七總皂苷含量真實值和回歸方程預(yù)測值比較
權(quán)利要求
1.一種快速測定三七愈傷組織皂苷含量的方法，其特征在于該方法的操作步驟包括 1)采用常規(guī)的有機(jī)溶劑提取法對干燥至恒重的三七愈傷組織粉末進(jìn)行常溫超聲處理1-2 h，過濾，濾液揮干后用甲醇溶解，定容至超聲提取時溶液體積的二分之一，即得到提取液； 2)采用香草醛-冰乙酸顯色法對皂苷提取液直接進(jìn)行顯色反應(yīng)； 3)顯色液進(jìn)行400-700nm區(qū)間的吸光度掃描，數(shù)據(jù)采用化學(xué)計量學(xué)中的偏最小二乘法處理步驟2)中獲得的吸收光譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集范圍530-570 nm，根據(jù)不同波長條件下的吸光度值，建立基于多自變量的用于測定三七總皂苷含量的回歸方程，應(yīng)用回歸方程計算樣品中三七總皂苷的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述快速測定三七愈傷組織皂苷含量的方法，其特征在于有機(jī)溶劑為甲醇或乙醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速測定三七愈傷組織中皂苷含量的方法，該方法通過對三七愈傷組織的皂苷進(jìn)行提取，然后采用香草醛-冰乙酸顯色法對皂苷提取液直接進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后采集數(shù)據(jù)，并進(jìn)行光譜數(shù)據(jù)分析和處理，得到愈傷組織中皂苷含量；本發(fā)明方法操作簡便、效果良好，可以實現(xiàn)三七總皂苷含量的快速檢測，適用快速了解和認(rèn)識三七培養(yǎng)細(xì)胞中總皂苷的含量，也可推廣用于三七藥材中皂苷含量的測定。
文檔編號G01N1/28GK102967569SQ201210493888
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月28日
發(fā)明者葛鋒, 于鋼, 劉迪秋, 陳朝銀 申請人:昆明理工大學(xué)