專利名稱：一種人羊膜上皮細(xì)胞體外免疫調(diào)控淋巴細(xì)胞分子機(jī)制的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)及免疫學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種人類AECS體外免疫抑制作用分子機(jī)制的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
協(xié)同共刺激分子在T淋巴細(xì)胞的活化增殖中起到很重要的作用?！皡f(xié)同刺激信號(hào)”是1970年由Bretseher和Cohn在T細(xì)胞活性雙信號(hào)模型的基礎(chǔ)上提出的，即除了通過APC遞呈MHC處理過的抗原給抗原特異性T細(xì)胞提供第一個(gè)信號(hào)外，還需協(xié)同刺激分子作為輔助信號(hào)的協(xié)同作用，達(dá)到生理活化閾值后才能使T細(xì)胞產(chǎn)生正常的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。如果缺乏協(xié)同共刺激分子的第二信號(hào)，將會(huì)導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的無(wú)反應(yīng)性或特異性免疫耐受。B7家族是唯一能從APC單向傳送信號(hào)至T細(xì)胞的協(xié)同共刺激分子，PD-Ll是B7家族一個(gè)重要的負(fù)性協(xié)同刺激分子，抑制T細(xì)胞的活化增殖，在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。以往的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)驗(yàn)證了 AECS低表達(dá)HLA-DR，并對(duì)活化的T細(xì)胞具有抑制作用，但AECS是否表達(dá)與T細(xì)胞活化或抑制相關(guān)的協(xié)同刺激分子以及其中的機(jī)理，未見相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。以負(fù)性協(xié)同刺激分子ro-Ll為切入點(diǎn)，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)、免疫熒光染色、3H-TdR摻入法、ELISA等實(shí)驗(yàn)分析TO-Ll在AECS介導(dǎo)的T細(xì)胞體外增殖抑制作用中所扮演的角色，從而驗(yàn)證HH-PD-Ll分子通路是AECS體外調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫耐受的主要信號(hào)機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提出一種人類AECS體外免疫抑制作用分子機(jī)制的檢測(cè)方法，首先在體外分離及培養(yǎng)人AECS，應(yīng)用免疫熒光染色方法檢測(cè)AECS表面負(fù)性協(xié)同刺激分子I3D-Ll的表達(dá)，通過I3D-LlmAb阻斷實(shí)驗(yàn)，AECS與T細(xì)胞體外共培養(yǎng)觀察T細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期、細(xì)胞因子分泌情況等證實(shí)其對(duì)T淋巴細(xì)胞的抑制作用及內(nèi)在的分子機(jī)制，整個(gè)驗(yàn)證過程將包括如下步驟S1:羊膜上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定；選用剖宮產(chǎn)后的人羊膜，大小約15*15cm，分離、去除殘留的絨毛膜，PBS (Gibco BRL公司)，洗盡血跡后用O. 125%胰酶，37° C消化IOmin,重復(fù)4次，IOOOrpm,離心6min收集，用PBS洗3次后接種在含10%FBS+RPMI1640培養(yǎng)皿中，于37° C含5%C02空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3-4d進(jìn)行換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿至瓶底80% -90%時(shí)傳代，培養(yǎng)第二代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用于實(shí)驗(yàn)之前的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型，先將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用PBS液調(diào)整細(xì)胞濃度為IxlO6 / ml。分別加入下列鼠抗人單克隆抗體CD29. FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE、置 4° C 孵育 30min，PBS 洗 2 遍，直接進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。S2 :免疫熒光染色法檢測(cè)AECS中TO-Ll表達(dá)；將以多聚賴氨酸處理的蓋玻片置于六孔培養(yǎng)板中，取2代細(xì)胞種于此六孔板中。I 2d后吸取培養(yǎng)基，加入4%的多聚甲醛固定細(xì)胞，用PBS沖洗后，加入抗人I3D-LlmAb后置于濕盒中4° C過夜，沖洗后再加入PE熒光二抗，置室溫Ih,最后加入Hoechst33258五分鐘。用50%甘油封片,用突光顯微鏡觀察。S3 =PD-LlmAb阻斷AECS對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用檢測(cè)；將2代的AECS用絲裂霉素(IOng / ml)處理，PBS洗三遍,接種于96孔板中IxlO4 /孔，每孔加入T細(xì)胞IxlO5 /孔，同時(shí)加入 PHA (50 μ g / ml)，實(shí)驗(yàn)分為 5 組T、T+PHA、T+PHA+AECS、T+PHA+AECS+antiPDLl、T+PHA+AECS+mlgG組；將細(xì)胞于37° C、5 % C02條件下培養(yǎng)72h。在結(jié)束前18h加入3H-TdRd U Ci /孔)，收集細(xì)胞,用β液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)cpm值,根據(jù)cpm值的大小,進(jìn)行分析比較。S4 =AECS與T細(xì)胞體外共培養(yǎng)及I3D-Ll阻斷實(shí)驗(yàn)；取二代AECS，用IOug / ml的絲裂霉素處理lh，胰酶消化，洗滌5遍，用含有10% FBS的LG-DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整濃度為1.OXlO5 /孔，接種于24孔培養(yǎng)板中。接種T細(xì)胞7xl06 / ml，加入PHA(30 μ g / ml)或和PD-LlmAbdOy g / ml)同時(shí)加入。實(shí)驗(yàn)分組為 T、T+AECS、T+PHA+AECS、T+PHA+AECS+PD_L1、T+PHA+AECS+mlgG、AECS。24h 后觀察細(xì)胞形態(tài)。S5 T細(xì)胞活性早期標(biāo)志⑶69的檢測(cè)；24h后收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，加入⑶4-FITC、⑶69-PE表記的抗體，進(jìn)行雙標(biāo)。4° C避光，30分鐘，PBS洗兩遍，上機(jī)檢測(cè)。S6 =AECS對(duì)活化T細(xì)胞周期影響的檢測(cè)；收集上述細(xì)胞，PBS洗滌后，70%酒精固定過夜。PBS洗三遍，加入細(xì)胞周期染液(PI50yg / ml、RNA酶50yg / ml) O. 5ml, 37° C孵育30min，流式細(xì)胞儀分析。S7 =AECS對(duì)活化T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌影響的檢測(cè)；將上述細(xì)胞上清收集并分裝保存，-20°C _80°C保存待檢。IFN- Y、IL-10的檢測(cè)采用ELISA法，步驟按照試劑盒說明書操作。所述實(shí)驗(yàn)流程中所使用的人外周血T淋巴細(xì)胞分離純化的步驟具體如下取健康人外周血(血 樣來(lái)自自愿者)用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，貼壁2h后，吸出富集的T細(xì)胞，再經(jīng)磁珠分選純化。純化后的T細(xì)胞純度達(dá)95%以上。本發(fā)明以免疫調(diào)控信號(hào)機(jī)制作為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)AECS在體外所表現(xiàn)出來(lái)的免疫抑制特性其內(nèi)在的分子機(jī)制作了探討，從而成功地明確了負(fù)性協(xié)同刺激分子ro-Ll—PDl分子信號(hào)通路是主要的調(diào)控位點(diǎn)，該發(fā)明為進(jìn)一步深入探討機(jī)體的復(fù)雜免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了很好的線索。


通過下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。其中圖1為人類AECS體外培養(yǎng)形態(tài)的顯微放大圖；圖2為流式細(xì)胞儀測(cè)定AECS表面協(xié)同刺激分子的表達(dá)情況；圖3為I3D-LlmAb部分阻斷AECS對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)；圖4為I3D-LlmAb部分逆轉(zhuǎn)AECS對(duì)T細(xì)胞活化增殖的抑制效應(yīng)；圖5為TO-LlmAb部分逆轉(zhuǎn)AECS對(duì)活化T細(xì)胞周期的阻滯；圖6為I3D-LlmAb調(diào)節(jié)AECS對(duì)T細(xì)胞體外細(xì)胞因子的分泌；圖7為整個(gè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過程流程示意具體實(shí)施例方式本發(fā)明的一種人類AECS體外免疫抑制作用分子機(jī)制的檢測(cè)方法，其研究目的是進(jìn)一步了解人類羊膜細(xì)胞免疫調(diào)控能力及其可能的效應(yīng)機(jī)制，為該技術(shù)最終應(yīng)用于臨床、拓展其臨床應(yīng)用適應(yīng)癥提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)米用的材料和設(shè)備包括倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、C02培養(yǎng)箱(法國(guó)Jouan公司)、恒溫離心機(jī)(法國(guó)Jouan公司)、流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman. Coulter公司)、培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板(美國(guó)Cotingcostar公司)、β液體閃爍計(jì)數(shù)儀(瑞典Pharmacia, Uppsala公司)、LG—DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，胰蛋白酶(Sigma 公司)，DMEM(Gibco 公司)，鼠抗人 PD1、CD80、CD83、CD86、CD4、CD69 克隆抗體(eBioscienee公司),鼠抗人B7H3mAb、FO-LlmAb。(蘇大研究所研制)，(sigma公司),PI (sigma 公司)，IL 一 2ELISA 試劑盒(R&D 公司),IFN — 7ELISA 試劑(R&D 公司)，IL 一10ELISA試劑盒(R&D公司)，兔抗鼠PE熒光二抗(上海業(yè)力生物科技有限公司)、3H_TdR(中國(guó)科學(xué)院原子能研究所)，Hoechst33258 (Sigma公司)。本發(fā)明所述的羊膜上皮細(xì)胞體外免疫調(diào)控淋巴細(xì)胞分子機(jī)制檢測(cè)方法的具體步驟包括S1:羊膜上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定；選用剖宮產(chǎn)后的人羊膜，大小約15*15cm，分離、去除殘留的絨毛膜，PBS (Gibco BRL公司)，洗盡血跡后用O. 125%胰酶，37° C消化IOmin,重復(fù)4次，IOOOrpm,離心6min收集，用PBS洗3次后接種在含10%FBS+RPMI1640培養(yǎng)皿中，于37° C含5%C02空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3-4d進(jìn)行換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿至瓶底80% -90%時(shí)傳代，培養(yǎng)第二代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用于實(shí)驗(yàn)之前的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型，先將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用PBS液調(diào)整細(xì)胞濃度為IxlO6 / ml。分別加入下列鼠抗人單克隆抗體CD29. FITC、CD34 — FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE、置 4° C 孵育 30min，PBS 洗 2 遍，直接進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。S2 :免疫熒光染色法檢測(cè)AECS中TO-Ll表達(dá)；將以多聚賴氨酸處理的蓋玻片置于六孔培養(yǎng)板中，取2代細(xì)胞種于此六孔板中。I 2d后吸取培養(yǎng)基，加入4%的多聚甲醛固定細(xì)胞，用PBS沖洗后，加入抗人I3D-LlmAb后置于濕盒中4° C過夜，沖洗后再加入PE熒光二抗，置室溫Ih,最后加入Hoechst33258五分鐘。用50%甘油封片,用突光顯微鏡觀察。S3 =PD-LlmAb阻斷AECS對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用檢測(cè)；將2代的AECS用絲裂霉素(IOng / ml)處理，PBS洗三遍,接種于96孔板中IxlO4 /孔，每孔加入T細(xì)胞IxlO5 /孔，同時(shí)加入 PHA(50 μ g / ml)，實(shí)驗(yàn)分為 5 組T、T+PHA、T+PHA+AECS、T+PHA+AECS+antiPDLl、T+PHA+AECS+mlgG組；將細(xì)胞于37° C、5 % C02條件下培養(yǎng)72h。在結(jié)束前18h加入3H-TdRd U Ci /孔)，收集細(xì)胞,用β液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)cpm值,根據(jù)cpm值的大小,進(jìn)行分析比較。S4 =AECS與T細(xì)胞體外共培養(yǎng)及I3D-Ll阻斷實(shí)驗(yàn)；取二代AECS，用IOug / ml的絲裂霉素處理lh，胰酶消化，洗滌5遍，用含有10% FBS的LG-DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整濃度為1.OXlO5 /孔，接種于24孔培養(yǎng)板中。接種T細(xì)胞7xl06 / ml，加入PHA(30 μ g / ml)或和PD-LlmAbdOy g / ml)同時(shí)加入。 實(shí)驗(yàn)分組為 T、T+AECS、T+PHA+AECS、T+PHA+AECS+PD_L1、T+PHA+AECS+mlgG、AECS。24h 后觀察細(xì)胞形態(tài)。S5 T細(xì)胞活性早期標(biāo)志⑶69的檢測(cè)；24h后收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，加入⑶4-FITC、⑶69-PE表記的抗體，進(jìn)行雙標(biāo)。4° C避光，30分鐘，PBS洗兩遍，上機(jī)檢測(cè)。S6 =AECS對(duì)活化T細(xì)胞周期影響的檢測(cè)；收集上述細(xì)胞，PBS洗滌后，70%酒精固定過夜。PBS洗三遍，加入細(xì)胞周期染液(PI50yg / ml、RNA酶50yg / ml) O. 5ml, 37° C孵育30min，流式細(xì)胞儀分析。S7 =AECS對(duì)活化T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌影響的檢測(cè)；將上述細(xì)胞上清收集并分裝保存，-20°C _80°C保存待檢。IFN-Y ,IL-1O的檢測(cè)采用ELISA法，步驟按照試劑盒說明書操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析AECS培養(yǎng)結(jié)果原代培養(yǎng)的羊膜上皮細(xì)胞在接種12h內(nèi)開始緩慢貼壁生長(zhǎng)，48-72h首次換液后，出現(xiàn)形如鵝卵石外觀的細(xì)胞，7天左右細(xì)胞密集成簇分布，形態(tài)呈圓形、多角形，細(xì)胞輪廓分明，邊界清楚，折光性較強(qiáng)，核較大，胞漿中含有特征性的空泡狀脂肪滴，細(xì)胞增殖速度不快，原代培養(yǎng)至2w-3W左右,細(xì)胞形態(tài)逐漸增大,色澤變灰暗,傳代后的細(xì)胞增殖更慢，2-3代以后細(xì)胞不再擴(kuò)增。AECS表型分析流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示AECS不表達(dá)⑶80、⑶83、⑶86等協(xié)同刺激分子，AECS高表達(dá)ro-Ll。AECS對(duì)T細(xì)胞的體外增殖抑制作用及其I3D-Ll表達(dá)的相關(guān)性AECS對(duì)T細(xì)胞體外增殖具有明顯的抑制作用(p〈0. 05)。而在有ro-LlmAb的阻斷作用條件下，可部分逆轉(zhuǎn)AECS阻斷T細(xì)胞體外增殖的抑制效 應(yīng)(P〈0. 05)。PD-LlmAb部分逆轉(zhuǎn)AECS對(duì)活化T細(xì)胞周期的阻滯作用用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)在有AECS存在的情況下，對(duì)PHA激發(fā)的T細(xì)胞周期進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，當(dāng)T細(xì)胞被PHA所激發(fā)時(shí)GO / Gl期細(xì)胞數(shù)明顯下降，S期細(xì)胞數(shù)上升；當(dāng)AECS與被PHA活化的T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，GO / Gl期細(xì)胞數(shù)上調(diào)，S期細(xì)胞數(shù)下調(diào)；而在ro-LlmAb作用下，它能明顯削弱對(duì)T細(xì)胞周期的抑制作用。PD-LlmAb調(diào)節(jié)AECS對(duì)T細(xì)胞體外細(xì)胞因子的分泌作用=ELISA法檢測(cè)PHA作用下，活化T細(xì)胞在AECS存在下，并在antiro-LlmAb抑制作用下，細(xì)胞的培養(yǎng)上清中的IFN- Y的含量結(jié)果顯示，24小時(shí)后各組細(xì)胞上清的IFN- Y水平也有顯著性差異變化在PHA作用下活化T的細(xì)胞分泌，IFN-Y的分泌量明顯升高為430pg / ml，當(dāng)AECS存在時(shí)，細(xì)胞因子IFN-Y量繼續(xù)增高，上升至895pg / ml ο當(dāng)用抗體I3D-Ll阻斷時(shí)，IFN-Y，分泌量下降至503pg / ml，但是比活化T細(xì)胞量還要略高。同時(shí)AECS自身也分泌部分IFN-Y，分泌量為86pg / ml ο在不同時(shí)相的檢測(cè)結(jié)果顯示，各組的IFN-γ隨著時(shí)間增加，分泌量增加。IL-10檢測(cè)結(jié)果顯示，AECS與PHA激發(fā)T細(xì)胞共培養(yǎng)體系中IL-10分泌量上調(diào)至130pg / ml，與無(wú)AECS存在時(shí)363pg / ml相比具有顯著性差別，而當(dāng)抗體I3D-Ll阻斷時(shí)，IL-10分泌下降，分泌量為176pg / ml，但還是比單純活化T細(xì)胞的分泌IL-10的量略高。在不同時(shí)相的檢測(cè)結(jié)果顯示，各組IL-10隨著時(shí)間增加，分泌量有所下降。，由此提示羊膜上皮細(xì)胞表達(dá)的負(fù)性協(xié)同刺激分子I3D-Ll參與了 AECS負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明并不局限于所述的實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍以權(quán)利要求書限定的范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種人類AECS體外免疫抑制作用分子機(jī)制的檢測(cè)方法，其包括下述步驟 S1:羊膜上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定； 52:免疫熒光染色法檢測(cè)羊膜上皮細(xì)胞中ro-Ll表達(dá)； 53=PD-LlmAb阻斷AECS對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用檢測(cè)； 54=AECS與T細(xì)胞體外共培養(yǎng)及I3D-Ll阻斷實(shí)驗(yàn)； 55T細(xì)胞活性早期標(biāo)志⑶69的檢測(cè)； 56=AECS對(duì)活化T細(xì)胞周期影響的檢測(cè)； 57=AECS對(duì)活化T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌影響的檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的一種人類AECS體外免疫抑制作用分子機(jī)制的檢測(cè)方法，其中所述步驟IAECS的分離及培養(yǎng)過程如下選用剖宮產(chǎn)后的人羊膜，大小約15*15cm，分離、去除殘留的絨毛膜，PBS (Gibco BRL公司)，洗盡血跡后用O. 125%胰酶，37° C消化IOmin,重復(fù)4次，IOOOrpm,離心6min收集，用PBS洗3次后接種在含10%FBS+RPMI 1640培養(yǎng)皿中，于37° C含5%C02空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
3.如權(quán)利要求1所述的一種人類AECS體外免疫抑制作用分子機(jī)制的檢測(cè)方法，其中所述步驟3開始使用的人外周血T淋巴細(xì)胞的分離純化方法如下取健康人外周血用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，貼壁后吸出富集的T細(xì)胞，再經(jīng)磁珠分選純化，純化后的T細(xì)胞純度達(dá)到95%以上。
全文摘要
本發(fā)明提出一種人胎盤來(lái)源的MSCs體外表現(xiàn)為抑制T細(xì)胞活性及增殖作用機(jī)制的檢測(cè)方法。鑒于協(xié)同共刺激分子在T細(xì)胞活化增殖中所起的重要作用，本發(fā)明大膽推測(cè)胎盤來(lái)源的MSCs體外表現(xiàn)出對(duì)T細(xì)胞負(fù)性調(diào)控作用可能系其高表達(dá)負(fù)性協(xié)同刺激分子PD-L1有關(guān)，首先通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PMSCS對(duì)活化T細(xì)胞具有明顯抑制作用，再以負(fù)性協(xié)同刺激分子PD-L1為切入點(diǎn)，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)、免疫熒光染色、3H-TdR摻入法、ELISA等實(shí)驗(yàn)分析PD-L1在PMSCS介導(dǎo)的T細(xì)胞體外增殖抑制作用中所扮演的角色，從而驗(yàn)證PD1-PD-L1分子通路是PMSCS體外調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫耐受的主要信號(hào)機(jī)制。
文檔編號(hào)G01N33/68GK103045711SQ20121050625
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月2日
發(fā)明者徐杰, 房文峰, 朱愛華 申請(qǐng)人:吳衛(wèi)江