專利名稱：一種快速測(cè)定膠原蛋白含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種膠原蛋白檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種快速測(cè)定膠原蛋白含量的方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白是一種生物性高分子物質(zhì)，主要存在于動(dòng)物組織中，是生物科技產(chǎn)業(yè)重要的原材料之一，其應(yīng)用領(lǐng)域包括生醫(yī)材料、化妝品、食品、保健品和科學(xué)研究。且隨著近年來(lái)人們生活水平的提高和保健意識(shí)的加強(qiáng)，膠原蛋白在化妝品、食品和保健品中的應(yīng)用逐年提高，因此膠原蛋白含量的檢測(cè)顯得尤為重要。目前膠原蛋白樣品的預(yù)處理方法主要是酸處理法，需要在高溫(11(T130°C)下水 解Γ24小時(shí)后才能進(jìn)行檢測(cè)，不僅反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，準(zhǔn)確度低，而且存在安全隱患，因此建立一種簡(jiǎn)單、快速、安全、準(zhǔn)確度高的膠原蛋白的檢測(cè)方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、準(zhǔn)確度低且存在安全隱患的技術(shù)問題，提供一種快速測(cè)定膠原蛋白含量的方法，該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，無(wú)任何安全隱患。本發(fā)明涉及一種膠原蛋白含量的測(cè)定方法，其原理是利用膠原蛋白能被堿性蛋白酶酶解成羥脯氨酸，而羥脯氨酸能被氯胺T氧化生成吡咯環(huán)的物質(zhì)，該吡咯環(huán)物質(zhì)被二甲基氨基苯甲醛顯色，生成紅色化合物。具體操作步驟如下
(1)羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備吸取lrng/mL的羥脯氨酸儲(chǔ)存液IOmL到IOOmL容量瓶中，用蒸餾水定容到IOOmL,濃度為100 μ g/mL,分別吸取3. 0,6. 0,9. O、12. O、15. OmL，用蒸餾水定容到IOOmL,配制成濃度分別為3. 0,6. 0,9. O、12. O、15. O μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)液；
(2)待測(cè)樣品預(yù)處理取樣品粉末5 20mg于具塞試管中，在70°C水浴中加熱30分鐘后加入堿性蛋白酶5mg,酶解I 3小時(shí)后,定容至IOOmL備用；
(3)空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其蛋白質(zhì)濃度為Omg/mL；
(4)分別吸取步驟(I)中的標(biāo)準(zhǔn)液和步驟(2)中的待測(cè)樣品lmL，加入ImL檸檬酸緩沖液和ImL氯胺T溶液在25°C水浴中氧化20分鐘后，加入高氯酸lmL，于25°C水浴中放置10分鐘，加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛lmL，65°C水浴顯色20分鐘，冷卻后測(cè)吸光度值，并換算出樣品中羥脯氨酸的濃度，從而得到樣品中膠原蛋白的含量。本發(fā)明的方法具有檢測(cè)方便、測(cè)量速度快、準(zhǔn)確度高且操作條件溫和等優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明的方法靈敏度高，可測(cè)到O. 05mg/mL ;精確度高，RSD ( 2%，很適合進(jìn)行食品、化妝品和保健品中膠原蛋白含量的快速檢測(cè)，具有廣泛的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :魚皮膠原蛋白粉中膠原蛋白含量的測(cè)定
(I)羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備吸取lmg/mL的羥脯氨酸儲(chǔ)存液IOmL到IOOmL容量瓶中，用蒸餾水定容到IOOmL,濃度為100 μ g/mL,吸取此溶液3. 0,6. 0,9. O、12. O、15. OmL,分別用蒸餾水定容到IOOmL,即得濃度分別為3. 0,6. 0,9. O、12. O、15. O μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；
(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取上述標(biāo)準(zhǔn)液lmL，加入ImL檸檬酸緩沖液和ImL氯胺T溶液在25°C水浴中氧化20分鐘后，加入高氯酸lmL，于25°C水浴中放置10分鐘，加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛lmL，65°C水浴顯色20分鐘，冷卻后測(cè)吸光度值，根據(jù)羥脯氨酸濃度與測(cè)得的相應(yīng)羥脯氨酸吸光度值之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(3)樣品中膠原蛋白含量測(cè)定取膠原蛋白樣品粉末20mg于具塞試管中，在70°C水浴中加熱30分鐘后加入堿性蛋白酶5mg,酶解3小時(shí)后,定容至IOOmL,取ImL水解液,按照輕脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定的吸光度 值與羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系確定待測(cè)樣品中膠原蛋白的含量。實(shí)施例2 :魚骨膠原蛋白粉中膠原蛋白含量的測(cè)定
樣品中膠原蛋白含量測(cè)定取膠原蛋白樣品粉末約IOmg于具塞試管中，在70°C水浴中加熱30分鐘后加入堿性蛋白酶5mg，酶解2小時(shí)后，定容至IOOmL,取ImL水解液，按照羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定的吸光度值與羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系確定待測(cè)樣品中膠原蛋白的含量。其余同實(shí)施例1。實(shí)施例3 :保健品膠原蛋白粉中膠原蛋白含量的測(cè)定
樣品中膠原蛋白含量測(cè)定取膠原蛋白樣品粉末約5mg于具塞試管中，在70°C水浴中加熱30分鐘后加入堿性蛋白酶5mg，酶解I小時(shí)后，定容至IOOmL,取ImL水解液，按照羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定的吸光度值與羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系確定待測(cè)樣品中膠原蛋白的含量。其余同實(shí)施例1。上述實(shí)施例只是為了說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制，所有在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)作出的變化、改型、添加或替換，都應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種快速測(cè)定膠原蛋白含量的方法，其特征在于取膠原蛋白樣品粉末5 20mg于具塞試管中，在70°C水浴中加熱30分鐘后加入堿性蛋白酶5mg，酶解I 3小時(shí)后，轉(zhuǎn)移至另一試管中，定容至IOOmL,取ImL水解液，按照羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法進(jìn)行測(cè)定，在560 nm處測(cè)吸光度，并換算出樣品羥脯氨酸的濃度，從而得到膠原蛋白的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速測(cè)定膠原蛋白含量的方法，其特征在于羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法為制備濃度分別為3. 0,6. 0,9. O、12. 0,15. Oug/mL的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液，分別吸取lmL，加入ImL檸檬酸緩沖液和ImL氯胺T溶液在25°C水浴中氧化20分鐘后，加入高氯酸lmL，于25°C水浴中放置10分鐘，加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛lmL，65°C水浴顯色20分鐘，冷卻后560 nm測(cè)吸光度值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速測(cè)定膠原蛋白含量的方法?，F(xiàn)有的檢測(cè)方法中樣品需要通過濃酸在高溫(110~130℃)下水解4~24小時(shí)后才能進(jìn)行檢測(cè)，不僅操作危險(xiǎn)，而且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度低。本發(fā)明的檢測(cè)方法是先將樣品在70℃水浴中保溫30分鐘，再加入堿性蛋白酶酶解1小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)。本方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確度高，大幅度的提高了工作效率，而且不存在任何安全隱患，具有廣泛的應(yīng)用和推廣價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N21/31GK103018185SQ20121051348
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者荊曉麗 申請(qǐng)人:青島艾華隆生物科技有限公司