一種高通量蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高通量蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理裝置，是一種集蛋白質(zhì)在線變性和還原、除鹽以及在線酶解的系統(tǒng)，包括：高溫變性和還原器，溶劑置換器以及酶反應(yīng)器。蛋白樣品首先通過高溫變性和還原器實現(xiàn)在線、快速變性和還原，然后再通過溶劑置換器將變性劑和還原劑去除，最后通過酶反應(yīng)器在線酶解，酶解產(chǎn)生的肽段可以通過質(zhì)譜進行檢測。本發(fā)明的優(yōu)點是將蛋白質(zhì)的復(fù)雜樣品預(yù)處理過程進行了集成化。這種方法可以省去離線分析方法復(fù)雜的樣品處理步驟，大大縮短了樣品預(yù)處理時間，減少了樣品在離線處理過程中可能引入的樣品丟失和污染等問題，提高整個分析通量。此外，該系統(tǒng)與分離鑒定平臺也顯示出良好的兼容性，因此，在蛋白組研究中具有較好的實用性。
【專利說明】 一種高通量蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高通量蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理裝置，是一種集蛋白質(zhì)變性和還原、除鹽以及蛋白質(zhì)酶解的樣品預(yù)處理系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人類基因組全序列測定的完成，人類基因的注釋與功能確認已成為生命科學(xué)面臨的最重要任務(wù)之一。生命活動的功能執(zhí)行體是蛋白質(zhì)。對蛋白質(zhì)進行深入系統(tǒng)的研究不僅可以全景式地揭示生命活動的本質(zhì)，而且有些關(guān)鍵蛋白質(zhì)也是研究疾病機理和預(yù)防診治藥物等的直接靶體庫。因此，蛋白質(zhì)研究已成為新世紀最大的戰(zhàn)略資源之一，是國際生物科技的戰(zhàn)略制高點和競爭焦點。
[0003]凝膠電泳由于具有極高的分辨率和靈敏度，是目前最受生物學(xué)家關(guān)注的規(guī)?；鞍踪|(zhì)組分析方法。但是，該技術(shù)對于強酸性或強堿性蛋白質(zhì)、分子量極大或極小的蛋白質(zhì)、膜蛋白等都無法進行有效分析?；诙嗑S液相色譜-質(zhì)譜(“鳥槍法”)的蛋白質(zhì)分析方法具有較好的重現(xiàn)性，已經(jīng)成為目前常用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)。然而，無論是進行蛋白質(zhì)的定性還是進行定量分析、或者是翻譯后修飾分析，都需要對蛋白質(zhì)進行離線變性、還原、烷基化、除鹽以及酶解，另外蛋白質(zhì)定量還需要進行離線的同位素標記。這些步驟都采用離線處理的方法，不僅花費時間長，而且存在著樣品污染、丟失的可能性，嚴重影響了規(guī)?；鞍踪|(zhì)分析的結(jié)果。因此發(fā)展在線的樣品預(yù)處理方法和裝置具有非常重要的意義。
[0004]針對傳統(tǒng)樣品預(yù)處理方法存在的問題，我們發(fā)展了一種集蛋白變性、還原、除鹽以及在線酶解的樣品預(yù)處理系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以實現(xiàn)高通量、低損失的蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有很好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種集蛋白質(zhì)變性、還原、除鹽以及在線酶解于一體的樣品預(yù)處理系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以直接處理細胞、組織提取蛋白和分泌蛋白，不需要復(fù)雜和繁瑣的手工操作，同時整個處理過程保持高度的連續(xù)性和高通量性。
[0006]為了實現(xiàn)該目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0007]1、采用高溫變性和還原器對蛋白質(zhì)樣品進行在線、不可逆以及快速的變性，變性劑可采用高濃度的鹽酸胍和尿素。
[0008]2、采用溶劑置換器去除變性后蛋白質(zhì)溶液中殘存的高濃度變性劑和還原劑，以確保后續(xù)高效的酶解反應(yīng)，采用的交換液為低濃度弱堿性緩沖溶液。
[0009]3、酶反應(yīng)器采用柱形式的酶反應(yīng)器，酶活高，同時耐壓性好，采用的固載材料為有機基質(zhì)的整體材料、有機-無機的整體材料、有機基質(zhì)的顆粒材料。固載的酶為胰蛋白酶。
[0010]4、酶解產(chǎn)生的多肽可以通過質(zhì)譜直接檢測或通過液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進行分析。
[0011]一種高通量蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理裝置，包括:依次串連的高溫變性和還原器，溶劑置換器以及酶反應(yīng)器；[0012]所述高溫變性和還原器包括管狀中空纖維膜、變性和還原反應(yīng)腔體；以中空纖維膜為蛋白質(zhì)傳輸載體，中空纖維膜固定于變性和還原反應(yīng)腔體中，中空纖維膜兩端穿過變性和還原反應(yīng)腔體側(cè)壁面伸出腔體外，于變性和還原反應(yīng)腔體上設(shè)有物料進口和出口 ；
[0013]所述溶劑置換器包括管狀中空纖維膜、緩沖液置換腔體；以中空纖維膜為蛋白質(zhì)傳輸載體，中空纖維膜固定于緩沖液置換腔體中，中空纖維膜兩端穿過緩沖液置換腔體側(cè)壁面伸出腔體外，于緩沖液置換腔體上設(shè)有物料進口和出口 ；
[0014]高溫變性和還原器上的中空纖維膜的物料流出端與溶劑置換器上的中空纖維膜的物料流入端相連通；
[0015]所述酶反應(yīng)器由柱溫箱和酶柱組成，酶柱被放置于柱溫箱中，溶劑置換器上的中空纖維膜的物料流出端與酶柱的物料入口相連，產(chǎn)物由酶柱的物料出口流出，蛋白質(zhì)通過酶柱被迅速切割成多肽，實現(xiàn)蛋白質(zhì)到多肽的快速轉(zhuǎn)化。
[0016]所述高溫變性和還原器由中空纖維膜，變性和還原反應(yīng)腔體，溫控系統(tǒng)以及溶劑輸送系統(tǒng)組成，以中空纖維膜為蛋白質(zhì)傳輸載體，并固定于變性和還原反應(yīng)腔體中，通過溶劑輸送系統(tǒng)將高濃度變性劑和還原劑輸送至變性和還原反應(yīng)腔體，并與蛋白質(zhì)充分混合，在溫控系統(tǒng)作用下加熱并完成變性還原反應(yīng)；
[0017]所述溫控系統(tǒng)由數(shù)顯控溫器，保溫石英棉、加熱套以及內(nèi)襯加熱管組成，其中內(nèi)襯加熱管被置于加熱套內(nèi)，加熱套被保溫石英棉包裹，以防止熱量擴散，加熱溫度通過熱電偶傳輸至數(shù)顯控溫器，并實時控制。
[0018]所述溶劑輸送系統(tǒng)溶劑輸送系統(tǒng)為液相色譜泵或蠕動泵，
[0019]其物料入口與溶劑儲存罐相連，其物料出口與變性和還原反應(yīng)腔體上設(shè)有物料進口相連；變性和還原反應(yīng)腔體上設(shè)有物料出口與溶劑收集容器相連。
[0020]液相色譜泵或蠕動泵的流量范圍0.lmL/min-5mL/min，溫控裝置的加熱溫度范圍25-100。。；
[0021]變性和還原反應(yīng)腔體的制作材料可以為石英管或耐高溫的玻璃管，內(nèi)徑尺寸為5-15mm ；
[0022]溶劑為20_50mM碳酸氫銨，變性劑的種類可以為鹽酸胍或尿素，濃度為4_8M。
[0023]所述溶劑置換器由中空纖維膜，緩沖液置換腔體以及強制對流系統(tǒng)組成，以中空纖維膜為蛋白質(zhì)傳輸載體，并固定于緩沖液置換腔體中，通過強制對流系統(tǒng)將低濃度弱堿性緩沖溶液輸送至緩沖液置換腔體，使蛋白質(zhì)溶劑與交換液發(fā)生置換，從而達到蛋白質(zhì)除鹽的目的；
[0024]所述強制對流系統(tǒng)由輸液泵或蠕動泵、儲液罐和連接管線組成，其物料入口通過連接管線與溶劑儲存罐相連，其物料出口與溶劑交換器腔體上設(shè)有物料進口相連；溶劑置換器腔體上設(shè)有物料出口與溶劑收集容器相連。
[0025]緩沖液置換腔體的制作材料可以為聚四氟管或玻璃管，內(nèi)徑尺寸2-10mm ;強制對流系統(tǒng)采用的緩沖溶液可以為碳酸氫銨或醋酸銨溶液，濃度范圍IO-1OOmM, pH范圍為
7.5~8.5。
[0026]制備酶反應(yīng)器的基質(zhì)材料為有機基質(zhì)的整體材料、有機-無機雜化的整體材料或有機基質(zhì)的顆粒材料；蛋白酶通過共價鍵合或物理吸附的方式，固定在材料表面，所述酶為胰蛋白酶，酶液濃度范圍為1-lOmg/mL ；[0027]柱溫箱的控溫范圍可以為25_40°C。
[0028]采用所述預(yù)處理裝置將蛋白質(zhì)變性和還原、除鹽以及蛋白質(zhì)酶解的樣品預(yù)處理過程集成化；
[0029]具體過程如下:蛋白質(zhì)樣品被注射進入高溫變性和還原器(A)中，在高溫變性和化學(xué)還原的同時作用下，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)被徹底破壞，蛋白質(zhì)鏈舒展，二硫鍵斷裂，為后續(xù)的蛋白質(zhì)完全酶解提供前提；變性后的蛋白質(zhì)樣品通入溶劑置換器，在強制對流作用力下，高濃度的變性劑和還原劑得以去除，為后續(xù)的蛋白質(zhì)酶解提供有利條件；最后蛋白質(zhì)樣品通過固定酶反應(yīng)器，實現(xiàn)在線酶解，酶解產(chǎn)生的肽段通過質(zhì)譜或液質(zhì)聯(lián)用平臺進行分離檢測。
[0030]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0031]1、樣品手工操作步驟減少，從而樣品損失、污染的可能性也將降低。
[0032]2、由于不需要離線酶解，系統(tǒng)的分析通量大大提高；
[0033]3、系統(tǒng)集成化、自動化程度高；
[0034]4、可以與分離鑒定技術(shù)在線聯(lián)用，為實現(xiàn)高通量的蛋白質(zhì)分析提供技術(shù)支撐。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1、樣品預(yù)處理系統(tǒng)裝置圖，包括高溫變性和還原器(A)，溶劑置換器(B)以及酶反應(yīng)器(C);其中(I):反應(yīng)腔體；(2):中空纖維膜；(3)變性劑與還原劑入口 ；(4):變性劑與還原劑出口 ；(5)溫控裝置；(6)置換腔體；(7)弱堿性緩沖溶液入口 ；(8)弱堿性緩沖溶液出口 ；(9):酶反應(yīng)器。
[0036]圖2、樣品預(yù)處理裝置處理肌紅蛋白的質(zhì)譜圖，a:活性肌紅蛋白；b:變性和還原后的肌紅蛋白；c:除鹽后的肌紅蛋白；d:肌紅蛋白酶解產(chǎn)物；e:肌紅蛋白酶解產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)殘留檢測。
[0037]圖3、樣品預(yù)處理裝置與液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)分析人血清低豐度蛋白質(zhì)，a:抗體柱分離人血清高、低豐度蛋白質(zhì)的色譜圖；b:經(jīng)樣品預(yù)處理裝置后，酶解產(chǎn)物的液相色譜-質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0038]實施例1
[0039]如圖1所示，該樣品預(yù)處理裝置由高溫變性和還原器A，溶劑置換器B以及酶反應(yīng)器C組成。
[0040]所述高溫變性和還原器包括管狀中空纖維膜、變性和還原反應(yīng)腔體；以中空纖維膜為蛋白質(zhì)傳輸載體，中空纖維膜固定于變性和還原反應(yīng)腔體中，中空纖維膜兩端穿過變性和還原反應(yīng)腔體側(cè)壁面伸出腔體外，于變性和還原反應(yīng)腔體上設(shè)有物料進口和出口 ；
[0041]所述溶劑置換器包括管狀中空纖維膜、緩沖液置換腔體；以中空纖維膜為蛋白質(zhì)傳輸載體，中空纖維膜固定于緩沖液置換腔體中，中空纖維膜兩端穿過緩沖液置換腔體側(cè)壁面伸出腔體外，于緩沖液置換腔體上設(shè)有物料進口和出口 ；
[0042]高溫變性和還原器上的中空纖維膜的物料流出端與溶劑置換器上的中空纖維膜的物料流入端相連通；[0043]所述酶反應(yīng)器由柱溫箱和酶柱組成，酶柱被放置于柱溫箱中，溶劑置換器上的中空纖維膜的物料流出端與酶柱的物料入口相連，產(chǎn)物由酶柱的物料出口流出，蛋白質(zhì)通過酶柱被迅速切割成多肽，實現(xiàn)蛋白質(zhì)到多肽的快速轉(zhuǎn)化。
[0044]所述高溫變性和還原器由中空纖維膜，變性和還原反應(yīng)腔體，溫控系統(tǒng)以及溶劑輸送系統(tǒng)組成，以中空纖維膜為蛋白質(zhì)傳輸載體，并固定于變性和還原反應(yīng)腔體中，通過溶劑輸送系統(tǒng)將高濃度變性劑和還原劑輸送至變性和還原反應(yīng)腔體，并與蛋白質(zhì)充分混合，在溫控系統(tǒng)作用下加熱并完成變性還原反應(yīng)；
[0045]所述溫控系統(tǒng)由數(shù)顯控溫器，保溫石英棉、加熱套以及內(nèi)襯加熱管組成，其中內(nèi)襯加熱管被置于加熱套內(nèi)，加熱套被保溫石英棉包裹，以防止熱量擴散，加熱溫度通過熱電偶傳輸至數(shù)顯控溫器，并實時控制。
[0046]所述溶劑輸送系統(tǒng)溶劑輸送系統(tǒng)為液相色譜泵或蠕動泵，
[0047]其物料入口與溶劑儲存罐相連，其物料出口與變性和還原反應(yīng)腔體上設(shè)有物料進口相連；變性和還原反應(yīng)腔體上設(shè)有物料出口與溶劑收集容器相連。
[0048]以0.lmg/mL肌紅蛋白為樣品(如圖2a所示)考察整個樣品預(yù)處理過程的連續(xù)性。首先以2μ L/min將肌紅蛋白推入高溫變性和還原器中，其中溫度為90°C，變性和還原劑為6M鹽酸胍和50mM二硫蘇糖醇(如圖2b所示);變性后的蛋白質(zhì)樣品通入溶劑置換器，交換液為50mM碳酸氫銨(pH 8.0),在強制對流作用力下，高濃度的變性劑和還原劑得以去除(如圖2c所示);最后蛋白質(zhì)樣品通過有機-無機雜化基質(zhì)固定酶反應(yīng)器(0.25mm 1.dX50mm),在室溫下實現(xiàn)在線酶解，酶解產(chǎn)生的肽段通過基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜進行檢測(如圖2d所示)，從圖中可以看出肌紅蛋白完全轉(zhuǎn)化成肽段(如圖2e所示)。
[0049]將該裝置與微柱液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)在線聯(lián)用，分析人血清低豐度蛋白質(zhì)組分。操作步驟如下:人血清樣品首先通過抗體柱去除高豐度蛋白質(zhì)(如圖3a所示)，收集的低豐度蛋白質(zhì)組分通入該裝置(操作過程同實施例1)，酶解產(chǎn)生的多肽通過C18預(yù)柱捕集，然后進行液質(zhì)分析，如圖3b所示。
【權(quán)利要求】
1.一種高通量蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理裝置，包括:依次串連的高溫變性和還原器(A)，溶劑置換器(B)以及酶反應(yīng)器(C); 其特征在于: 所述高溫變性和還原器包括管狀中空纖維膜、變性和還原反應(yīng)腔體；以中空纖維膜為蛋白質(zhì)傳輸載體，中空纖維膜固定于變性和還原反應(yīng)腔體中，中空纖維膜兩端穿過變性和還原反應(yīng)腔體側(cè)壁面伸出腔體外，于變性和還原反應(yīng)腔體上設(shè)有物料進口和出口 ； 所述溶劑置換器包括管狀中空纖維膜、緩沖液置換腔體；以中空纖維膜為蛋白質(zhì)傳輸載體，中空纖維膜固定于緩沖液置換腔體中，中空纖維膜兩端穿過緩沖液置換腔體側(cè)壁面伸出腔體外，于緩沖液置換腔體上設(shè)有物料進口和出口 ； 高溫變性和還原器上的中空纖維膜的物料流出端與溶劑置換器上的中空纖維膜的物料流入端相連通； 所述酶反應(yīng)器由柱溫箱和酶柱組成，酶柱被放置于柱溫箱中，溶劑置換器上的中空纖維膜的物料流出端與酶柱的物料入口相連，產(chǎn)物由酶柱的物料出口流出，蛋白質(zhì)通過酶柱被迅速切割成多肽，實現(xiàn)蛋白質(zhì)到多肽的快速轉(zhuǎn)化。
2.按照權(quán)利要求1所述的預(yù)處理裝置，其特征在于: 所述高溫變性和還原器由中空纖維膜，變性和還原反應(yīng)腔體，溫控系統(tǒng)以及溶劑輸送系統(tǒng)組成，以中空纖維膜為蛋白質(zhì)傳輸載體，并固定于變性和還原反應(yīng)腔體中，通過溶劑輸送系統(tǒng)將高濃度變性劑和還原劑輸送至變性和還原反應(yīng)腔體，并與蛋白質(zhì)充分混合，在溫控系統(tǒng)作用下加熱并完成變性還原反應(yīng)； 所述溫控系統(tǒng)由數(shù)顯控溫器,保溫石英棉、加熱套以及內(nèi)襯加熱管組成,其中內(nèi)襯加熱管被置于加熱套內(nèi)，加熱套被保溫石英棉包裹，以防止熱量擴散，加熱溫度通過熱電偶傳輸至數(shù)顯控溫器，并實時控制； 所述溶劑輸送系統(tǒng)溶劑輸送系統(tǒng)為液相色譜泵或蠕動泵， 其物料入口與溶劑儲存罐相連，其物料出口與變性和還原反應(yīng)腔體上設(shè)有物料進口相連；變性和還原反應(yīng)腔體上設(shè)有物料出口與溶劑收集容器相連。
3.按照權(quán)利要求2所述的預(yù)處理裝置，其特征在于: 液相色譜泵或蠕動泵的流量范圍0.lmL/min-5mL/min,溫控裝置的加熱溫度范圍25-100。。； 變性和還原反應(yīng)腔體的制作材料可以為石英管或耐高溫的玻璃管，內(nèi)徑尺寸為5-15mm ； 溶劑為20-50mM碳酸氫銨,變性劑的種類可以為鹽酸胍或尿素,濃度為4-8M。
4.按照權(quán)利要求1所述的預(yù)處理裝置，其特征在于: 所述溶劑置換器由中空纖維膜，緩沖液置換腔體以及強制對流系統(tǒng)組成，以中空纖維膜為蛋白質(zhì)傳輸載體，并固定于緩沖液置換腔體中，通過強制對流系統(tǒng)將低濃度弱堿性緩沖溶液輸送至緩沖液置換腔體，使蛋白質(zhì)溶劑與交換液發(fā)生置換，從而達到蛋白質(zhì)除鹽的目的； 所述強制對流系統(tǒng)由輸液泵或蠕動泵、儲液罐和連接管線組成，其物料入口通過連接管線與溶劑儲存罐相連，其物料出口與溶劑交換器腔體上設(shè)有物料進口相連；溶劑置換器腔體上設(shè)有物料出口與溶劑收集容器相連。
5.按照權(quán)利要求4所述的預(yù)處理裝置，其特征在于: 緩沖液置換腔體的制作材料可以為聚四氟管或玻璃管，內(nèi)徑尺寸2-10_ ;強制對流系統(tǒng)采用的緩沖溶液可以為碳酸氫銨或醋酸銨溶液，濃度范圍IO-1OOmM, pH范圍為7.5-8.5。
6.按照權(quán)利要求1所述的預(yù)處理裝置，其特征在于: 制備酶反應(yīng)器的基質(zhì)材料為有機基質(zhì)的整體材料、有機-無機雜化的整體材料或有機基質(zhì)的顆粒材料；蛋白酶通過共價鍵合或物理吸附的方式，固定在材料表面，所述酶為胰蛋白酶，酶液濃度范圍為1-lOmg/mL ； 柱溫箱的控溫范圍可以為25-40°C。
7.—種權(quán)利要求1所述預(yù)處理裝置的應(yīng)用，其特征在于: 采用權(quán)利要求1所述預(yù)處理裝置將蛋白質(zhì)變性和還原、除鹽以及蛋白質(zhì)酶解的樣品預(yù)處理過程集成化； 具體過程如下:蛋白質(zhì)樣品被注射進入高溫變性和還原器(A)中，在高溫變性和化學(xué)還原的同時作用下，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)被徹底破壞，蛋白質(zhì)鏈舒展，二硫鍵斷裂，為后續(xù)的蛋白質(zhì)完全酶解提供前提；變性后的蛋白質(zhì)樣品通入溶劑置換器(B)，在強制對流作用力下，高濃度的變性劑和還原劑得以去除，為后續(xù)的蛋白質(zhì)酶解提供有利條件；最后蛋白質(zhì)樣品通過固定酶反應(yīng)器(C)，實現(xiàn)在線酶解，酶解產(chǎn)生的肽段通過質(zhì)譜或液質(zhì)聯(lián)用平臺進行分離檢測?！?br> 【文檔編號】G01N30/06GK103852527SQ201210517241
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月5日
【發(fā)明者】張麗華, 袁輝明, 戴忠鵬, 蔣好, 楊開廣, 張玉奎 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所