一種傅里葉變換紅外光譜測定微藻生物質(zhì)組成的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種傅里葉變換紅外光譜(FTIR)測定微藻生物質(zhì)組成的方法。微藻生物質(zhì)中油脂、蛋白質(zhì)和多糖的相對含量是評估微藻生物質(zhì)質(zhì)量的重要指標(biāo)，傳統(tǒng)化學(xué)方法需要對油脂、蛋白質(zhì)和多糖逐一分別進(jìn)行測定。本發(fā)明利用FTIR對微藻生物質(zhì)進(jìn)行測定，以蛋白質(zhì)酰胺I譜帶作為內(nèi)參比峰，計算油脂及多糖的相對含量。該方法實(shí)現(xiàn)了快速同時測定微藻細(xì)胞內(nèi)油脂、蛋白質(zhì)、多糖的相對含量，方法簡單，重復(fù)性好，樣品需求量少，彌補(bǔ)了化學(xué)測定方法繁瑣費(fèi)時等不足。
【專利說明】一種傅里葉變換紅外光譜測定微藻生物質(zhì)組成的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于海洋生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為利用傅里葉變換紅外光譜同時對微藻內(nèi)油脂和多糖的相對含量進(jìn)行快速評估的方法
【背景技術(shù)】
[0002]微藻具有種類多、光合作用效率高、生物產(chǎn)量高、生長周期短及自身油脂含量高等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是制備生物柴油最佳的生物質(zhì)能源原料之一。微藻細(xì)胞內(nèi)全組分含量的測定對微藻培養(yǎng)及調(diào)控具有指導(dǎo)意義，一般采用化學(xué)方法測定微藻細(xì)胞內(nèi)各組分含量。微藻中油脂含量是決定微藻生物柴油成本的重要指標(biāo)，傳統(tǒng)重量法測定微藻油脂含量需要藻粉量大，提取過程繁瑣，另外有機(jī)試劑的大量使用也會帶來環(huán)境和健康等問題；尼羅紅染色法可以快速測定細(xì)胞內(nèi)中性脂含量，應(yīng)用于富油藻株的篩選及培養(yǎng)過程中性脂含量測定，但培養(yǎng)條件、藻種、染色溫度及染色時間等都會影響熒光強(qiáng)度，不利于實(shí)驗室間進(jìn)行比較交流。多糖和蛋白質(zhì)含量的測定一般采用顯色的方法測定，樣品需經(jīng)過破碎，提取，顯色等步驟。化學(xué)方法測定細(xì)胞內(nèi)三大組分的含量測定過程較繁瑣，耗時較長。所以傳統(tǒng)化學(xué)方法不適于對微藻內(nèi)生物質(zhì)含量做快速評估。
[0003]傅里葉變換紅外光譜(FTIR)屬于分子光譜，是確定物質(zhì)組成的有力工具，以其快速，無損，微量測定的優(yōu)勢在物質(zhì)鑒定中得到廣泛應(yīng)用。細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂類、核酸、多糖等在FTIR中紅外區(qū)均有吸收，此區(qū)域光譜可同時提供各物質(zhì)特異的振動吸收光譜，而使得其可同時對微藻生物質(zhì)內(nèi)油脂、蛋白質(zhì)、多糖的含量進(jìn)行快速評估。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種利用傅里葉變換紅外光譜快速對微藻生物質(zhì)進(jìn)行評估的方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案內(nèi)容為:
[0006](I)樣品制備
[0007]將l_5mg待測藻粉與光譜純溴化鉀按1.0-3.0:100質(zhì)量比進(jìn)行研磨混合，取40-80mg混合樣品，紅外磨具進(jìn)行壓片。
[0008](2)樣品測定
[0009]傅里葉變換紅外光譜掃描條件:儀器分辨率McnT1 ;掃描波數(shù):4000-700(^1 ;累加掃描次數(shù)為16-64次。以溴化鉀壓片掃描譜圖作為背景譜圖，制備樣品掃描，得樣品紅外譜圖。
[0010](3)油脂、多糖相對含量計算
[0011]分別對油脂吸收譜帶(3002-2807011-1)、蛋白質(zhì)酰胺I吸收譜帶(1722-15850^1)及多糖吸收譜帶(1200-953(3!^1)進(jìn)行面積積分，以蛋白質(zhì)酰胺I帶作為內(nèi)參比峰計算油脂和多糖相對蛋白質(zhì)含量；
[0012]油脂相對含量為:油脂吸收峰面積/酰胺I帶面積；多糖相對含量為油脂吸收峰面積/酰胺I帶面積。
[0013]所述微藻生物質(zhì)是指微藻中的油脂、蛋白質(zhì)和多糖(可根據(jù)要求測定其中兩個或以上指標(biāo))。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下:
[0015]1.全組分同時測定:傅里葉變換紅外光譜掃描譜圖可同時獲得微藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、多糖、油脂的吸收峰，所以可同時對三種組分進(jìn)行分析，與傳統(tǒng)化學(xué)方法逐一測定且測定步驟繁瑣相比，節(jié)省時間。[0016]2、測定過程簡單:將收獲藻泥干燥，與溴化鉀研磨均勻，壓片。傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行掃描即可，掃描時間約為30s。
[0017]3、所需樣品量少:一般化學(xué)方法測定油脂需要IOOmg左右干藻粉，傅里葉變換紅外光譜全組分測定所需樣品量僅有l(wèi)_5mg。
[0018]4、測定結(jié)果準(zhǔn)確性高:在富油藻株篩選及調(diào)控培養(yǎng)監(jiān)控中傅里葉變換紅外光譜同時全組分測定結(jié)果同化學(xué)測定結(jié)果相一致。
[0019]附圖表說明
[0020]表1為微藻紅外光譜譜帶分配。
[0021]圖1為傅里葉變換紅外光譜測定篩選藻株油脂相對含量及多糖相對含量；注:圖1a為以脂吸收峰(3002-2807(31^1)面積/酰胺I面積A (Lipid/Amidel)計算總脂的相對含量；圖1b為以多糖吸收譜帶(1200-953(31^1)面積/酰胺I面積A (Carbo/Amide I)計算總糖的相對含量;1:紫球藻;2:H16 ；3:亞心形四爿藻；4:柵藻；5:H56 ；6:角毛藻；7:蛋白核小球藻。
[0022]圖2FT-1R測定微藻油脂及多糖相對含量與化學(xué)測定結(jié)果的線性關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的方法和結(jié)果進(jìn)行說明。
[0024]實(shí)施例1
[0025]所用藻株亞心型四月藻(Tetraselmis subcordiformis),柵藻(Scenedesmusobliquus),微藻樣品紅外譜圖各組分特征吸收見表1。3000-2800cm-l范圍為C-H伸縮振動，主要來源于脂類，1740cm-l為脂和脂肪酸中酯官能團(tuán)中C=O的振動吸收峰，這兩個區(qū)域吸收強(qiáng)度大小對應(yīng)于藻細(xì)胞內(nèi)油脂的含量。1650CHT1及1540CHT1分別為與蛋白質(zhì)中C=O伸縮振動及N-H的彎曲振動，吸收強(qiáng)度大小對應(yīng)于藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量。1200-900(31^1為糖類C-O-C的振動吸收峰，吸收強(qiáng)度大小對應(yīng)藻細(xì)胞中多糖含量。
[0026]將亞心形四月藻或柵藻樣品3mg與溴化鉀按比例(1: 100質(zhì)量比)混合研磨，取60mg壓片，利用傅里葉變換紅外光譜儀(Bruker TENS0R27，德國)進(jìn)行樣品掃描，掃描條件:光譜分辨率:4cm—1，累加掃描32次，掃描范圍4000-700(^1'
[0027]譜圖處理軟件OPUS 6.5 (Bruker，德國)對樣品紅外譜圖油脂(3002-2807^^1)、蛋白質(zhì)酰胺1 (1722-1585(31^1)及多糖(1200-953(31^1)吸收譜帶進(jìn)行面積積分，以酰胺I (1722-1585CHT1)譜帶作為內(nèi)參比峰，以脂吸收峰(3002-2807cm^)面積/酰胺I面積A (Lipid/Amide I)計算油脂的相對含量，以多糖吸收譜帶(1200-953(31^1)面積/酰胺I面積A (Carbo/Amide I)計算多糖的相對含量。亞心形四月藻和柵藻油脂相對含量分別為0.568，0.708 ;多糖相對含量分別為3.07，1.03。即紅外光譜測定此柵藻油脂含量高于而亞心形四月藻多糖含量高于柵藻。
[0028]實(shí)施例2
[0029]所用實(shí)驗藻株:亞心型四爿藻(Tetraselmis subcordiformis),角毛藻(Chaetoceros),蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa),柵藻rm(Scenedesmusobliquus)，萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii CC 124)，紫球藻(Porphyridium cruentum), H56、H16 (未確定名稱藻株)
[0030]微藻樣品紅外譜圖各組分特征吸收見表1。3000-2800cm^范圍為C-H伸縮振動，主要來源于脂類，1740cm-l為脂和脂肪酸中酯官能團(tuán)中C=O的振動吸收峰，這兩個區(qū)域吸收強(qiáng)度大小對應(yīng)于藻細(xì)胞內(nèi)油脂的含量。1650CHT1及1540CHT1分別為與蛋白質(zhì)中C=O伸縮振動及N-H的彎曲振動，吸收強(qiáng)度大小對應(yīng)于藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量。1200-9000^1為糖類C-O-C的振動吸收峰，吸收強(qiáng)度大小對應(yīng)藻細(xì)胞中多糖含量。
[0031]將帶篩選藻粉3mg樣品與溴化鉀按比例(1:100質(zhì)量比)混合研磨，取60mg壓片，利用傅里葉變換紅外光譜儀(Bruker TENS0R27，德國)進(jìn)行樣品掃描，掃描條件:光譜分辨率:4cm—1，掃描范圍4000-700(^-1,累加掃描32次。
[0032]譜圖處理軟件OPUS 6.5 (Bruker，德國)對樣品紅外譜圖油脂(3002-28070^1)、蛋白質(zhì)酰胺1 (1722-1585(31^1)及多糖(1200-953(31^1)吸收譜帶進(jìn)行面積積分，以酰胺
I(1722-1585CHT1)譜帶作為內(nèi)參比峰，以脂吸收峰(3002-2807(^1)面積/酰胺I面積A(Lipid/Amide I)計算油脂的相對含量，以多糖吸收譜帶(1200-9530^1)面積/酰胺I面積A (Carbo/Amide I) 計算多糖的相對含量(圖1)?；瘜W(xué)方法(Bligh, E.G., andDyer, ff.J.(1959)A rapid method of total lipid extraction and purification,Canadian journal of biochemistry and physiology.37,911-917.；Bradford,M.M., (1976).A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramquantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal.Biochem.72, 248254.；Somani, B.L., Khanade, J., and Sinha, R.(1987)A modifiedanthrone sulfuric-acid method for the determination of fructose in the presenceof certain proteins,Analytical biochemistry 167，327-330.)對以上藻株樣品的油脂、蛋白質(zhì)、多糖含量進(jìn)行測定(表2)，以驗證傅里葉變換紅外光譜掃描結(jié)果的準(zhǔn)確性。圖1a顯示由FTIR測定H56的相對油脂含量A (Lipid/Amide I)值為1.32顯著高于其他藻種較高。Η16(0.75)，柵藻(0.71)，角毛藻(0.66)，蛋白核小球藻(0.59)，亞心形四爿藻(0.57)，相對油脂含量相差不大，紫球藻(0.18)相對油脂含量較低。傳統(tǒng)化學(xué)方法對篩選藻株油脂、多糖、蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測定(表2)。結(jié)果顯示油脂含量較高的藻株為Η56、Η16分別占藻粉的31.0%和28.5%，傳統(tǒng)化學(xué)方法測定其他篩選藻株油脂含量柵藻，角毛藻，蛋白核小球藻，亞心形四月藻含量相差不大在10-13% ;紫球藻油脂含量最低為7.2%。圖1b顯示由FTIR測定總糖相對含量A (Carbo/Amide I)最高為亞心形四月藻(3.07)，其他藻株含量稍低，依次為角毛藻(6.78)，Η16(11.7)，Η56(4.27)，蛋白核小球藻(2.16)，紫球藻(4.58)，柵藻(3.12)。表2顯示總糖含量最高的為亞心形四月藻，總糖含量為47.4%，含量稍低的為Η16、角毛藻含量分別為21.5%和18.4%，化學(xué)方法測定其他藻株總糖含量依次為Η56，蛋白核小球藻，紫球藻，柵藻。所測藻株多糖含量與FTIR測定結(jié)果一致。[0033]以傅里葉變換紅外光譜測定油脂及多糖相對含量與化學(xué)方法測定結(jié)果進(jìn)行線性回歸(圖2)，相對油脂含量與化學(xué)方法結(jié)果的線性關(guān)系:Υ=0.02837Χ+0.26204R2=0.91798 ；相對多糖含量與化學(xué)測定結(jié)果的線性關(guān)系:Y=0.05354Χ+0.4885R2=0.9716。進(jìn)一步證明傅里葉變換紅外光譜，可作為一種準(zhǔn)確快速的方法應(yīng)用于微藻生物質(zhì)的快速測定。
[0034]表1
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種傅里葉變換紅外光譜測定微藻生物質(zhì)組成的方法，其特征在于:利用傅里葉變換紅外光譜對微藻生物質(zhì)樣品進(jìn)行掃描，以蛋白質(zhì)酰胺I譜帶作為內(nèi)參比峰，計算油脂及多糖的相對含量。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 具體步驟如下: (1)樣品準(zhǔn)備: 稱取待測微藻藻粉l_5mg，按照1.0-3.0:100質(zhì)量比例與KBr混合研磨，取40_80mg混合樣品壓片； (2)傅里葉變換紅外光譜測定: 傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行樣品掃描，掃描條件:光譜分辨率為4CHT1，掃描范圍4000-700(^-1,累加掃描 16-64 次； 譜圖1722-1585CHT1吸收峰為蛋白質(zhì)酰胺I吸收譜帶，3002-2807(31^1吸收峰為油脂吸收譜帶，1200-953cm^吸收峰為多糖吸收譜帶； (3)相對含量計算 分別對油脂吸收譜帶、蛋白質(zhì)酰胺I吸收譜帶及多糖吸收譜帶進(jìn)行面積積分，以蛋白質(zhì)酰胺I帶作為內(nèi)參比峰計算油脂和多糖相對蛋白質(zhì)含量； 油脂相對含量為:油脂吸收峰面積/酰胺I帶面積；多糖相對含量為油脂吸收峰面積/酰胺I帶面積。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述微藻生物質(zhì)是指微藻中的油脂、蛋白質(zhì)和多糖。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述蛋白質(zhì)酰胺I譜帶為蛋白質(zhì)C=O鍵在紅外光譜中的特征吸收峰，波數(shù)范圍為1722-1585CHT1。
【文檔編號】G01N21/3563GK103852440SQ201210517281
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月5日
【發(fā)明者】薛松, 孟迎迎, 姚長洪, 曹旭鵬 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所