專(zhuān)利名稱(chēng)：利用高效液相色譜法檢測(cè)玉米細(xì)胞核dna和線(xiàn)粒體dna甲基化水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及，尤其涉及的是一種利用高效液相色譜法檢測(cè)玉米細(xì)胞核DNA和線(xiàn)粒體DNA甲基化水平的方法。
背景技術(shù)：
隨著DNA甲基化研究的逐步深入，DNA甲基化水平的檢測(cè)已發(fā)展成為一門(mén)內(nèi)容豐富的方法學(xué)。DNA甲基化常用的分析方法為MSAP法，該法被廣泛應(yīng)用于水稻、棉花和擬南芥等基因組的胞嘧啶甲基化評(píng)定。但是，MSAP法所使用的同裂酶(如HpaII和MspI)不能切割所有的甲基化位點(diǎn)，識(shí)別范圍有限。相比較而言，HPLC法能方便、快速、準(zhǔn)確地測(cè)定整個(gè)基因組的甲基化水平，它能在宏觀(guān)上對(duì)整個(gè)基因組的DNA甲基化水平進(jìn)行大規(guī)模的分析測(cè) 定，這恰恰是具有識(shí)別位點(diǎn)特異性的MSAP法所不具備的。HPLC法是生物化學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域與專(zhuān)業(yè)最為重要的分離分析技術(shù)，也可以應(yīng)用于測(cè)定全基因組DNA甲基化水平。繼Wagner等首次用HPLC法測(cè)定植物5mC的含量以來(lái)，該法被廣泛應(yīng)用于植物DNA甲基化水平的檢測(cè)。Johnston等[2]用該方法對(duì)茶薦子基因組中5mC含量進(jìn)行了分析，丁明麗用該法測(cè)定了小麥成熟胚脫分化過(guò)程中的DNA甲基化水平，表明HPLC方法可達(dá)到對(duì)植物DNA甲基化水平精確分析的目的。因此，運(yùn)用高效液相色譜法能夠更加準(zhǔn)確、全面地測(cè)定DNA甲基化水平。核酸的酶水解通常采用核酸酶P1、磷酸二酯酶和堿性磷酸酶將DNA水解為脫氧核苷后進(jìn)行測(cè)定。核酸酶Pl只能對(duì)DNA的單鏈產(chǎn)生作用；核酸酶Pl的最適反應(yīng)溫度高于另外兩種酶，而最適pH值卻低于另外兩種酶，這就意味著三種酶不能同時(shí)作用，而且需人為地調(diào)節(jié)pH值，使實(shí)驗(yàn)顯得格外繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種利用高效液相色譜法檢測(cè)玉米細(xì)胞核DNA和線(xiàn)粒體DNA甲基化水平的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下利用高效液相色譜法檢測(cè)玉米細(xì)胞核DNA和線(xiàn)粒體DNA甲基化水平的方法，可供處理100份I μ g DNA的水解混合液配制方法為將250U Benzonase、300mU磷酸二酯酶I、200U堿性磷酸酶加入至5mL pH為7. 9的Tris-HCl水解緩沖液內(nèi)；流動(dòng)相的pH :對(duì)于線(xiàn)粒體DNA，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3. 42 ;對(duì)于細(xì)胞核DNA，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3. O ;色譜條件為色譜柱C18填料色譜柱；流速0. 8 mL/min，檢測(cè)器波長(zhǎng)287nm ;柱溫35°C ;進(jìn)樣量20uL ;流動(dòng)相甲醇5mM戊烷磺酸鈉三乙胺(10 90 :0. 2，V/V)，并用磷酸調(diào)節(jié)pH分別至3. 42和3.0。方法簡(jiǎn)單易行，20min內(nèi)可將各組分完全分離。(I)利用Benzonase、磷酸二酯酶和堿性磷酸酶配置成水解體系,根據(jù)每ug DNA加上一定量的水解液，37°C水解6個(gè)小時(shí)即能獲得脫氧核苷。此法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、有效。
(2)對(duì)線(xiàn)粒體DNA和細(xì)胞核DNA甲基化水平的檢測(cè)條件有所不同流速、進(jìn)樣體積、柱溫箱溫度均一致，但是流動(dòng)相的PH不一樣。線(xiàn)粒體DNA分析時(shí)需要的pH略高于細(xì)胞核DNA，這樣才能使各時(shí)各組分得到較好的分離。(3)經(jīng)過(guò)優(yōu)化的色譜條件為，色譜柱C18填料色譜柱(4. 6X250mm,5um);流速O. 8 mL/min，檢測(cè)器波長(zhǎng)287nm ;柱溫35°C ;進(jìn)樣量20uL ;流動(dòng)相甲醇5mM戊烷磺酸鈉:三乙胺(10 90 :0. 2，V/V)，并用磷酸調(diào)節(jié)pH分別至3. 42和3. O。方法簡(jiǎn)單易行，20min內(nèi)可將各組分完全分離。


圖I為標(biāo)準(zhǔn)品及樣品經(jīng)水解后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖譜；圖2為DNA標(biāo)準(zhǔn)品水解后HPLC色譜圖；
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。DNA樣品經(jīng)酸或酶水解成堿基/核苷/核苷酸,本實(shí)驗(yàn)利用Benzonase、磷酸二酯酶和堿性磷酸酶配置成水解混合液，可供處理100份I μ g DNA的水解混合液配制方法為將250U Benzonase、300mU磷酸二酯酶I、200U堿性磷酸酶加入至5mL pH為7. 9的Tris-HCl水解緩沖液內(nèi)。在I μ g 20 ng/ μ L的DNA中加入50 μ L水解混合液，37°C溫浴6小時(shí)后，_20°C冷藏待上機(jī)測(cè)定。啟動(dòng)電腦、高效液相色譜儀的A泵、B泵、SPD檢測(cè)器、柱溫箱等，先用100%甲醇沖洗柱子lh，再用水甲醇(95 :5，v/v)過(guò)渡30min，最后用含緩沖鹽的流動(dòng)相沖洗lh，平衡色譜柱至基線(xiàn)平穩(wěn)。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液dC、5mC分別進(jìn)樣，經(jīng)工作站軟件處理后得出洗脫峰、各自的保留時(shí)間和峰面積，接著將待測(cè)DNA樣品逐個(gè)上樣，根據(jù)標(biāo)樣dC和5mC洗脫峰的保留時(shí)間自動(dòng)檢測(cè)樣品DNA水解產(chǎn)物中dC和5mC的洗脫峰，通過(guò)公式(5mC/(511￡+(10\100%)，計(jì)算0嫩甲基化水平。樣品檢測(cè)完畢，先用流動(dòng)相沖洗lh，然后用水甲醇(95 :5，v/v)過(guò)渡30min，再用甲醇沖洗Ih以上，待基線(xiàn)平穩(wěn)后關(guān)機(jī)。測(cè)定波長(zhǎng)的優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高效液相色譜儀二極管陣列檢測(cè)器多通道(波長(zhǎng))掃描，找出dC和5mC最大吸收峰，對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)分別是278nm和287nm，本實(shí)驗(yàn)在最大吸收峰波長(zhǎng)周?chē)O(shè)計(jì)梯度實(shí)驗(yàn)，對(duì)各供試波長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)的峰面積進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1，由表I可以看出，dC在這供試波長(zhǎng)范圍內(nèi)的峰面積相差不大，但是5mC的波動(dòng)比較大，其中，在287nm處，5mC得到最大吸收，所以選擇287nm作為固定檢測(cè)波長(zhǎng)。表I不同檢測(cè)波長(zhǎng)下dC和5mC的峰面積
波長(zhǎng)(nm)dC峰面積5mC峰面積
r π273112068.7137436.6
275丨丨 6836.1149150.1
276118929.9丨 56430.3
277119339.615975(1.權(quán)利要求
1.利用高效液相色譜法檢測(cè)玉米細(xì)胞核DNA和線(xiàn)粒體DNA甲基化水平的方法，其特征在于，可供處理100份I μ g DNA的水解混合液配制方法為將250U Benzonase、300mU磷酸二酯酶I、200U堿性磷酸酶加入至5mL pH為7. 9的Tris-HCl水解緩沖液內(nèi)；流動(dòng)相的pH 對(duì)于線(xiàn)粒體DNA,用磷酸調(diào)節(jié)pH至3. 42 ;對(duì)于細(xì)胞核DNA,用磷酸調(diào)節(jié)pH至3. O ;色譜條件為色譜柱C18填料色譜柱；流速0. 8 mL/min，檢測(cè)器波長(zhǎng)287nm ;柱溫35°C ;進(jìn)樣量.20uL ;流動(dòng)相甲醇5mM戊烷磺酸鈉三乙胺(10 90 :0. 2，V/V),并用磷酸調(diào)節(jié)pH分別至.3. 42 和 3. O。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用高效液相色譜法檢測(cè)玉米細(xì)胞核DNA和線(xiàn)粒體DNA甲基化水平的方法，可供處理100份1μgDNA的水解混合液配制方法為將250U Benzonase、300mU磷酸二酯酶I、200U堿性磷酸酶加入至5mL pH為7.9的Tris-HCl水解緩沖液內(nèi)；流動(dòng)相的pH對(duì)于線(xiàn)粒體DNA，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.42；對(duì)于細(xì)胞核DNA，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0；色譜條件為色譜柱C18填料色譜柱；流速0.8mL/min，檢測(cè)器波長(zhǎng)287nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量20μL；流動(dòng)相甲醇5mM戊烷磺酸鈉三乙胺(10900.2，V/V)，并用磷酸調(diào)節(jié)pH分別至3.42和3.0。方法簡(jiǎn)單易行，20min內(nèi)可將各組分完全分離。
文檔編號(hào)G01N30/88GK102944638SQ20121051956
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月6日
發(fā)明者曹墨菊, 榮廷昭, 張晨, 張艷花, 汪靜, 盧艷麗, 劉和洋, 汪瀚宇, 王繼玥, 曾文兵, 汪生慶, 劉堅(jiān), 高世斌, 周樹(shù)峰, 胡爾良 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)