專利名稱：萘肼無(wú)機(jī)酸鹽或萘肼有機(jī)酸鹽在作為基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜中基質(zhì)的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種萘肼無(wú)機(jī)酸鹽或萘肼有機(jī)酸鹽在作為基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜中基質(zhì)的應(yīng)用，屬于質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自1988年Karas et al.和Tanaka et al.報(bào)道米用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-TOF MS)技術(shù)可以有效的進(jìn)行生物大分子質(zhì)譜的分析以來(lái)，MALD1-T0FMS技術(shù)備受各國(guó)研究者的青睞。但由于MALD1-TOF MS技術(shù)常用的基質(zhì)都是小分子有機(jī)化合物，如0-腈基-4-羥基肉桂酸(0^)、2，5-二羥基苯甲酸(0耶)、芥子酸(5六)、3-羥基-2-吡啶甲酸(3-HPA)、蒽三酚(DI)和3-氨基喹啉(3-AQ)等。在分析過(guò)程中，由于上述基質(zhì)分子在m/z〈500的范圍內(nèi)容易發(fā)生碎裂及分子之間的締合等產(chǎn)生嚴(yán)重的基質(zhì)背景干擾現(xiàn)象，因此，采用這些基 質(zhì)不能有效的分析m/z〈500的小分子化合物。為了避免基質(zhì)背景干擾現(xiàn)象的產(chǎn)生，研究者們通過(guò)對(duì)MALD1-TOF MS機(jī)理的研究提出了許多可行的改進(jìn)方法。如先后引入無(wú)機(jī)物基質(zhì)、聚合物基質(zhì)、混合基質(zhì)等新基質(zhì)或通過(guò)對(duì)多孔硅表面進(jìn)行化學(xué)修飾從而采用無(wú)基質(zhì)解吸/電離方法來(lái)克服以有機(jī)小分子作為基質(zhì)分析小分子化合物的不足。采用無(wú)機(jī)物如二氧化鈦?zhàn)鳛榛|(zhì)分析樣品時(shí)，得到的信號(hào)峰不僅有質(zhì)子化的樣品分子峰、還有樣品分子和堿金屬形成的加合物的峰等多種峰；用石墨烯作為基質(zhì)，分析樣品時(shí)，靈敏度較低。由于聚合物的合成步驟較多，如果用聚合物作為基質(zhì)分析樣品，不能充分體現(xiàn)MALD1-TOF MS分析樣品快速、高效的特點(diǎn)。采用質(zhì)子海綿作為基質(zhì)只能分析有機(jī)酸類化合物。在多孔硅表面發(fā)生解吸/電離時(shí)首先要在硅晶表面進(jìn)行刻蝕使其產(chǎn)生納米結(jié)構(gòu)的表面，在這樣的表面雖然可以直接分析多肽和抗病毒藥物，但由于這種表面的重復(fù)使用效果不好，因此就需要在同樣的納米結(jié)構(gòu)表面上進(jìn)行反復(fù)處理以得到能重復(fù)使用的表面。此夕卜，對(duì)多孔硅表面進(jìn)行化學(xué)修飾耗時(shí)較長(zhǎng)而且經(jīng)過(guò)修飾多孔硅重復(fù)使用時(shí)分析效果會(huì)大大下降。因此，提供一種操作方法簡(jiǎn)單，成本低廉，適用范圍廣，在小于m/z 500內(nèi)沒(méi)有或只有很低背景峰的基質(zhì)以及樣品制備分析方法，是對(duì)當(dāng)前基于MALDI的質(zhì)譜分析的重要和有力補(bǔ)充。具有廣泛的實(shí)用意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種萘肼無(wú)機(jī)酸鹽或萘肼有機(jī)酸鹽在作為基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI)中基質(zhì)的應(yīng)用。本發(fā)明提供的萘肼無(wú)機(jī)酸鹽或萘肼有機(jī)酸鹽在作為基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜中基質(zhì)的應(yīng)用中，所述基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-TOF MS)，但與其他質(zhì)譜分析儀器也兼容。
上述的應(yīng)用中,所述萘肼無(wú)機(jī)酸鹽可為萘肼鹽酸鹽、萘肼硝酸鹽、萘肼磷酸鹽或萘餅硫酸鹽等；所述萘肼有機(jī)酸鹽可為萘肼三氟乙酸鹽、萘肼乙酸鹽、萘肼甲酸鹽、萘肼檸檬酸鹽或萘肼草酸鹽等；所述萘肼無(wú)機(jī)酸鹽和萘肼有機(jī)酸鹽上的肼基團(tuán)均為I位取代或2位取代。 上述的應(yīng)用中，所述基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜中的待測(cè)物質(zhì)的分子量小于500。上述的應(yīng)用中，所述基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜中的待測(cè)物質(zhì)可為單糖、寡糖、糖肽、糖醇、糖脂、脂類化合物、金屬離子、核酸、有機(jī)酸、留體類化合物和胺類化合物中任一種。上述的應(yīng)用中，所述單糖和寡糖具體可為D (+)木糖、D-(-)阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、L(+)鼠李糖、D-半乳糖、D-果糖、葡萄糖、L-山梨糖、蔗糖、乳糖、D ( + )蜜三糖或水蘇四糖等；所述糖肽為糖蛋白水解后的糖肽片段；所述糖醇可為木糖醇或甘露醇等；所述糖脂為甘油糖脂、鞘糖脂或脂多糖等；所述脂類化合物可為甘油三脂、卵磷脂、腦磷脂或肌醇磷脂等；所述金屬離子可為鉛離子、汞離子、鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子、鐵離子、鈷離子、錳離子、鎳離子或金離子等；所述有機(jī)酸可為尿黑酸、五氟苯甲酸、尿酸或抗壞血酸等；所述留體類化合物可為膽固醇或腎上腺素等；所述胺類化合物可為尿素或多巴胺等。上述的應(yīng)用中，所述基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜用于檢測(cè)下述體系細(xì)胞組織樣本、微生物樣本、體液、化學(xué)反應(yīng)混合物和環(huán)境監(jiān)測(cè)樣本,因此,萘肼無(wú)機(jī)酸鹽或萘肼有機(jī)酸鹽可在有機(jī)與生物質(zhì)譜 、質(zhì)譜成像、蛋白質(zhì)譜學(xué)、代謝組學(xué)、生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)和環(huán)境分析等領(lǐng)域得到有效的應(yīng)用。上述的應(yīng)用中，所述環(huán)境檢測(cè)樣本具體可為水、大氣、或土壤樣本。上述的應(yīng)用中，所述基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜用于對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜成像，如待測(cè)樣品為組織切片時(shí)，可將萘肼無(wú)機(jī)酸鹽或萘肼有機(jī)酸鹽的溶液(lmg/mL至飽和濃度)噴灑在樣品表面，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)譜成像分析。上述的應(yīng)用中，所述萘肼無(wú)機(jī)酸鹽或萘肼有機(jī)酸鹽與所述基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜的待測(cè)物質(zhì)的摩爾比可為(廣1000):(廣10)，如5 :1、1. 5 :1或3 :5，具體應(yīng)用時(shí)，用水、甲醇、乙醇或乙腈溶解所述萘肼無(wú)機(jī)酸鹽或萘肼有機(jī)酸鹽得到基質(zhì)溶液，然后與待測(cè)物質(zhì)混合均勻后，吸取0. 5^1 u L混合液點(diǎn)樣。待混合液中的溶劑在空氣中揮發(fā)完全后，即可采用負(fù)離子掃描模式的MALD1-TOF MS對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行分析。上述的應(yīng)用中，待測(cè)物質(zhì)為復(fù)雜混合體系時(shí)，通常無(wú)需特殊處理，吸取混合體系的上清液(也可以是渾濁液)以一定比例和基質(zhì)溶液混合，點(diǎn)于MALDI靶板后即可用于質(zhì)譜分析。本發(fā)明從技術(shù)上克服了常用有機(jī)小分子基質(zhì)在低分子量區(qū)容易產(chǎn)生嚴(yán)重的基質(zhì)背景干擾現(xiàn)象從而導(dǎo)致不能有效分析小分子樣品的缺陷；本發(fā)明采用的基質(zhì)，無(wú)需加入離子化試劑，減少了對(duì)樣本處理的要求；由于在m/z〈500幾乎沒(méi)有背景干擾，因而對(duì)多種復(fù)雜混合體系也可進(jìn)行分析。而且樣本兼容性好，無(wú)需特殊復(fù)雜處理即可分析。同時(shí)由于其極低的靈敏度(Iamol)與對(duì)糖類物質(zhì)的敏感性，可以在生物復(fù)雜樣品中特異性檢測(cè)低濃度糖。


圖1為1-萘肼的結(jié)構(gòu)式。圖2為1-鹽酸萘肼的質(zhì)譜背景圖。圖3為基質(zhì)檢測(cè)葡萄糖溶液的檢測(cè)限質(zhì)譜分析圖(S/N=3)。圖4為實(shí)施例1中寡糖類的質(zhì)譜分析圖，其中圖4 (A)、圖4 (B)、圖4 (C)和圖4(D)分別為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和麥芽七糖的負(fù)離子掃描MALDI譜圖。圖5為實(shí)施例2中檢測(cè)血清中葡萄糖分子的質(zhì)譜分析圖，其中圖5 (A)和圖5 (B)分別為DHB檢測(cè)血清的正離子模式及NHHC檢測(cè)血清的負(fù)離子模式掃描MALDI譜圖；圖5(C)為標(biāo)準(zhǔn)加入法定量分析血清中葡萄糖含量的曲線。圖6 (A)為實(shí)施例3中檢測(cè)尿液中尿黑酸分子的質(zhì)譜分析圖；圖6 (B)為實(shí)施例3中定量分析尿黑酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7為萘肼與葡萄糖衍生化反應(yīng)的化學(xué)方程式。圖8為萘肼與糖類衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜分析圖，其中圖8(A)和圖8 (B)分別為葡萄糖和麥芽糖衍生化產(chǎn)物沉淀溶液的負(fù)離子模式掃描MALDI譜圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明下述實(shí)施例所用的1-鹽酸萘肼購(gòu)自美國(guó)sigma公司。本發(fā)明下述實(shí)施例所用的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的型號(hào)為BIFLEXTM III (Bruker)?；|(zhì)的質(zhì)譜背景非常簡(jiǎn)單、干凈，質(zhì)譜信號(hào)除了氯離子和鹽酸與氯離子的加合物峰以外，沒(méi)有其它信號(hào)，對(duì)測(cè)試樣本，包括復(fù)雜體系均無(wú)干擾(如圖2所示)。同時(shí)對(duì)寡糖類物質(zhì)具有極低的檢測(cè)限，測(cè)試葡萄糖溶液時(shí)可達(dá)到Iamol (如圖3所示)。實(shí)施例1、寡糖類物質(zhì)的分析取各種配制好的樣品溶液和基質(zhì)溶液以1:1體積比混合均勻(1-鹽酸萘肼與葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和麥芽七糖的摩爾比分別為5 :1、5 :1、1.5 :1和1.5 :1)，然后于MALDI靶板上加入I U L混合樣品，在空氣中干燥后進(jìn)入質(zhì)譜分析。其中葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和麥芽七糖均溶解在純水中，濃度依次為3mmol/L、3mmOl/L、10mmOl/L和lOmmol/L，基質(zhì)1_鹽酸萘肼溶解在體積比為1:1的乙腈/水溶液中配制為3mg/mL的溶液。質(zhì)譜條件為電壓加速電壓19. OOOkV ;延遲引出電壓14. 920kV;反射器電壓20. OOOkV ;透鏡電壓7. OOOkV ;頻率1. OOOHz ;激光器能量:75 80% ;累加次數(shù)80次；負(fù)
離子模式。在MALDI電離方式下，基質(zhì)可以將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到待測(cè)化合物(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和麥芽七糖)，使待測(cè)化合物帶負(fù)電，從而被質(zhì)譜檢測(cè)，結(jié)構(gòu)如圖4所示。實(shí)驗(yàn)證明，該基質(zhì)對(duì)于寡糖物質(zhì)均具有較好的分析性能。實(shí)施例2、血清中葡萄糖含量分析取10 ii L人血清與30 ii L乙腈混合，充分混合，離心，取10 ii L上清液與10 ii L基質(zhì)1-鹽酸萘肼溶液混合，最后取出I U L混合液加入到MALDI靶板上，在空氣中干燥后進(jìn)入質(zhì)譜分析。在使用標(biāo)準(zhǔn)加入法定量檢測(cè)葡萄糖濃度時(shí)，配制摩爾濃度為10mmol/L的同位素標(biāo)記的D-葡萄糖-1，2-13C2水溶液，以及摩爾濃度分別為0、1、2、3、5和9mmol/L的葡萄糖水溶液。取制備好的去蛋白的血清上清液以體積比1:1 :1 :1與3mg/mL基質(zhì)水溶液、同位素標(biāo)記的葡萄糖水溶液與不同濃度的葡萄糖溶液混合，取混合溶液I U L進(jìn)行MALD1-TOF質(zhì)譜分析。質(zhì)譜條件為電壓加速電壓19. OOOkV ;延遲引出電壓14. 920kV;反射器電壓20. OOOkV ;透鏡電壓7. OOOkV ;頻率1. OOOHz ;激光器能量:75 80% ;累加次數(shù)80次；負(fù)
離子模式。測(cè)試結(jié)構(gòu)如圖5所示，圖5 (A)和圖5 (B)分別為DHB檢測(cè)血清的正離子模式及NHHC檢測(cè)血清的負(fù)離子模式掃描MALDI譜圖，從圖5中可以看出，去蛋白后的血清中大量葡萄糖被離子化，產(chǎn)生了較高的質(zhì)譜信號(hào)。圖5 (C)給出了通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)加入法繪制的曲線，其中R2=O. 9965，當(dāng)y=0時(shí)，x=_0. 28，從而算出血清中葡萄糖絕對(duì)含量為4. 48mmol/L。此例說(shuō)明，該基質(zhì)可以應(yīng)用于血清中的小分子代謝物定量分析。實(shí)施例3、尿液中尿黑酸含量分析取新鮮尿液配制5mg/mL的尿黑酸溶液，取出I U L混合液加入到MALDI靶板上，在空氣中干燥后進(jìn)入質(zhì)譜分析。在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線定量檢測(cè)已知濃度的尿液中的尿黑酸時(shí)，配制摩爾濃度為3mg/mL的同位素標(biāo)記的尿黑酸-13C6尿樣溶液與摩爾濃度分別為0、1、2、3、4和5mg/mL的尿黑酸尿樣溶液以及3mg/mL基質(zhì)水溶液以1:1 1等體積混合(其中1_鹽酸萘肼與尿黑酸的摩爾比約為3 :5)，取混合溶液I y L進(jìn)`行MALD1-TOF質(zhì)譜分析。質(zhì)譜條件為電壓加速電壓19. OOOkV ;延遲引出電壓14. 920kV;反射器電壓20. OOOkV ;透鏡電壓7. OOOkV ;頻率1. OOOHz ;激光器能量:75 80% ;累加次數(shù)80次；負(fù)
離子模式。從圖6(A)中可以看出，在分析未經(jīng)處理加入的尿樣中的尿黑酸時(shí)，譜圖較為干凈，產(chǎn)生了較高的質(zhì)譜信號(hào)。圖6 (B)給出了用于定量分析尿黑酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在檢測(cè)加入已知含量的尿黑酸(5mg/mL)尿樣時(shí)測(cè)得結(jié)果為4. 99mg/mL,回收率為99. 8%。此例說(shuō)明，該基質(zhì)可以應(yīng)用于尿樣中的小分子代謝物定量分析。實(shí)施例4、萘肼與糖類衍生化產(chǎn)物分析(圖7)取2mg NHHC,加入15 y L濃硫酸，倒入150 y L純度為95%的乙醇和300 y L的純水，混合均勻后加入200 u L 5mmol/L的葡萄糖(果糖、麥芽糖、麥芽七糖)溶液，加熱至80°C，保溫30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，靜止24h，待沉淀量可提取時(shí)，離心，沉淀用純水洗滌三次后，滴加四氫呋喃溶液至沉淀剛好溶解，分別取上清液、洗滌液和沉淀溶液與基質(zhì)溶液等體積混合后進(jìn)行MALD1-TOF質(zhì)譜分析。質(zhì)譜條件為電壓加速電壓19. OOOkV ;延遲引出電壓14. 920kV ;反射器電壓:20. OOOkV ;透鏡電壓7. OOOkV ;頻率1. OOOHz ;激光器能量75^80% ;累加次數(shù)80次；負(fù)離子模式。從圖7中可以看到，萘肼與糖類物質(zhì)發(fā)生類似如圖7所示的反應(yīng)，因?yàn)檠苌镏杏休镰h(huán)官能團(tuán)，可以吸收一定的紫外能量，從而不需要基質(zhì)的輔助即可進(jìn)行解吸/電離進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。圖8 (A)和圖8 (B)分別為葡萄糖和麥芽糖衍生化產(chǎn)物沉淀溶液的負(fù)離子模式掃描MALDI譜圖，由圖可知，成功得檢測(cè)到了葡萄糖與麥芽糖的衍生物。
權(quán)利要求
1.萘肼無(wú)機(jī)酸鹽或萘肼有機(jī)酸鹽在作為基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜中基質(zhì)的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述萘肼無(wú)機(jī)酸鹽為萘肼鹽酸鹽、萘肼硝酸鹽、萘肼磷酸鹽或萘肼硫酸鹽； 所述萘肼有機(jī)酸鹽為萘肼三氟乙酸鹽、萘肼乙酸鹽、萘肼甲酸鹽、萘肼檸檬酸鹽或萘肼草酸鹽； 所述萘肼無(wú)機(jī)酸鹽和萘肼有機(jī)酸鹽上的肼基團(tuán)均為I位取代或2位取代。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜中的待測(cè)物質(zhì)的分子量小于500。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜中的待測(cè)物質(zhì)為單糖、寡糖、糖肽、糖醇、糖脂、脂類化合物、金屬離子、核酸、有機(jī)酸、甾體類化合物和胺類化合物中任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述單糖和寡糖為D(+)木糖、D-(-)阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、L(+)鼠李糖、D-半乳糖、D-果糖、葡萄糖、L-山梨糖、蔗糖、乳糖、D ( + )蜜三糖或水蘇四糖；所述糖肽為糖蛋白水解后的糖肽片段；所述糖醇為木糖醇或甘露醇；所述糖脂為甘油糖脂、鞘糖脂或脂多糖；所述脂類化合物為甘油三脂、卵磷脂、腦磷脂或肌醇磷脂；所述金屬離子為鉛離子、汞離子、鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子、鐵離子、鈷離子、錳離子、鎳離子或金離子；所述有機(jī)酸為尿黑酸、五氟苯甲酸、尿酸或抗壞血酸；所述甾體類化合物為膽固醇或腎上腺素；所述胺類化合物為尿素或多巴胺。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于所述基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜用于檢測(cè)下述體系細(xì)胞組織樣本、微生物樣本、體液、化學(xué)反應(yīng)混合物和環(huán)境監(jiān)測(cè)樣本。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述環(huán)境檢測(cè)樣本為水、大氣、或土壤樣本。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜用于對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜成像。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述萘肼無(wú)機(jī)酸鹽或萘肼有機(jī)酸鹽與所述基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜的待測(cè)物質(zhì)的摩爾比為(廣1000) :(f 10)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于用水、甲醇、乙醇或乙腈溶解所述萘肼無(wú)機(jī)酸鹽或萘肼有機(jī)酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了萘肼無(wú)機(jī)酸鹽或萘肼有機(jī)酸鹽在作為基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜中基質(zhì)的應(yīng)用。所述萘肼無(wú)機(jī)酸鹽為萘肼鹽酸鹽、萘肼硝酸鹽、萘肼磷酸鹽或萘肼硫酸鹽；所述萘肼有機(jī)酸鹽為萘肼三氟乙酸鹽、萘肼乙酸鹽、萘肼甲酸鹽、萘肼檸檬酸鹽或萘肼草酸鹽；所述萘肼無(wú)機(jī)酸鹽和萘肼有機(jī)酸鹽上的肼基團(tuán)均為1位取代或2位取代。本發(fā)明從技術(shù)上克服了常用有機(jī)小分子基質(zhì)在低分子量區(qū)容易產(chǎn)生嚴(yán)重的基質(zhì)背景干擾現(xiàn)象從而導(dǎo)致不能有效分析小分子樣品的缺陷；本發(fā)明采用的基質(zhì)，無(wú)需加入離子化試劑，減少了對(duì)樣本處理的要求；由于在m/z<500幾乎沒(méi)有背景干擾，因而對(duì)多種復(fù)雜混合體系也可進(jìn)行分析。
文檔編號(hào)G01N27/62GK103063730SQ20121054136
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者聶宗秀, 何清, 陳素明, 王佳寧, 侯劍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所