專利名稱：一種質(zhì)粒dna定量檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化分析領(lǐng)域，具體涉及一種質(zhì)粒DNA熒光染料定量檢測方法和檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
質(zhì)粒DNA是游離于染色體外的小型(l_200kb)的共價、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子，能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。它通常編碼一些酶基因，如產(chǎn)生抗生素、抗生素抗性、限制酶、修飾酶等有利于宿主的酶基因。由于它分子小、能夠自主復(fù)制并且穩(wěn)定遺傳，因此是分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)中常用的載體。在分子生物學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行DNA分析時常常需要對質(zhì)粒DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量，如進(jìn)行克隆文庫構(gòu)建時的酶切和連接操作，以及對質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序時，為了得到良好的后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，都需要對質(zhì)粒DNA的濃度進(jìn)行準(zhǔn)確測定。因此對質(zhì)粒DNA定量有著廣泛的應(yīng)用。 采用Pic0Green熒光染料法對核酸進(jìn)行定量，因其方法的靈敏度高、線性范圍廣，因此應(yīng)用非常廣。然而，PicoGreen熒光染料法在對DNA進(jìn)行定量時的局限性表現(xiàn)為，第一，方法的準(zhǔn)確度高低取決于試劑盒中DNA標(biāo)準(zhǔn)品含量的準(zhǔn)確度，而目前市售的試劑盒中DNA標(biāo)準(zhǔn)品的含量值均為廠家提供的一個參考值，S卩？ ng/ml，這個值一般是通過紫外吸收(0D260)確定的，該值也沒有相關(guān)的不確定度信息和溯源性。第二，由于PicoGreen對不同分子大小的DNA結(jié)合效率會有差異，如果依據(jù)定量的DNA標(biāo)準(zhǔn)和所測定的DNA樣本分子大小差異很大時，會導(dǎo)致對樣本定量結(jié)果的偏差很大，而目前商業(yè)化的試劑盒中均只有一個分子大小的DNA標(biāo)準(zhǔn)，即Lambda噬菌體DNA標(biāo)準(zhǔn)(48. 5K)。有報(bào)道稱以Lambda為標(biāo)準(zhǔn)，如果對分子量<23kb的DNA進(jìn)行定量，測定結(jié)果會比真實(shí)結(jié)果偏低。因此，如果對質(zhì)粒DNA采用PicoGreen法定量，由于質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品的缺乏,現(xiàn)有的商業(yè)化的試劑盒還無法滿足要求。因?yàn)镻icoGreen熒光染料法對質(zhì)粒DNA定量需要具有準(zhǔn)確量值的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而目前并沒有含有準(zhǔn)確量值的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)可用作PicoGreen法定量質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)。由于該量值直接關(guān)系到試劑盒定量方法的準(zhǔn)確度高低，因此要研制質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品，必須選擇準(zhǔn)確度高，溯源途徑清晰的DNA絕對定量方法。對質(zhì)粒DNA進(jìn)行絕對定量的方法有基于單分子擴(kuò)增的數(shù)字PCR方法、有依賴于磷元素標(biāo)準(zhǔn)的電感耦合等立體發(fā)射光譜法。我們建立了一種基于核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的超聲波-同位素質(zhì)譜法，可對質(zhì)粒DNA進(jìn)行絕對定量，從而為PicoGreen熒光染料法提供DNA標(biāo)準(zhǔn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種質(zhì)粒DNA熒光染料定量檢測方法和檢測試劑盒，該方法靈敏度高，線性范圍廣，準(zhǔn)確度高，精密度好。本發(fā)明首次建立了質(zhì)粒DNA熒光染料法定量檢測方法，采用質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)，利用PicoGreen法對質(zhì)粒DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量,本發(fā)明人進(jìn)行了如下研究工作
I、質(zhì)粒DNA濃度與熒光信號強(qiáng)度是否存在線性關(guān)系(見實(shí)施例I)將構(gòu)建的5k大小的質(zhì)粒稀釋成不同濃度的DNA樣品，稀釋后的質(zhì)粒DNA與PicoGreen突光染料結(jié)合后,測定突光信號。結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA濃度與熒光信號成正比，線性相關(guān)系數(shù)為O. 99。因此可以以熒光信號強(qiáng)度測算質(zhì)粒DNA濃度。本研究為確定本方法的可行性打下了基礎(chǔ)。2、不同分子量大小的DNA與熒光信號強(qiáng)度的線性關(guān)系差別(見實(shí)施例3)選擇了分子大小分別為5k，9k，48k的質(zhì)粒/基因組分子作為研究對象，分別將DNA進(jìn)行梯度稀釋，稀釋后的DNA與PicoGreen熒光染料結(jié)合后，測定熒光信號。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種不同分子量的DNA，濃度與熒光信號均成正比，且線性相關(guān)性都很好，相關(guān)系數(shù)均>0. 99。但不同分子量大小的DNA與熒光信號的線性關(guān)系(斜率)不同，分子量越大，直線的斜率越大。以商業(yè)化試劑盒l(wèi)ambda DNA作為標(biāo)準(zhǔn)(48k)測定2k IOk的質(zhì)粒DNA,結(jié)果偏差較大，具體見表2。此研究結(jié)果表明，測定質(zhì)粒DNA濃度應(yīng)選擇分子量差別不大的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品。3、研究了對質(zhì)粒DNA定量的線性范圍(見實(shí)施例2)將質(zhì)粒DNA稀釋至O. Olng/mL^lOOOOng/mL,與熒光染料結(jié)合后，測定熒光信號值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA濃度在O. 25ng/mL 1000ng/mL之間時，熒光強(qiáng)度與DNA濃度成正比。此研究確定了熒光染料法定量檢測DNA的濃度范圍是O. 25ng/mL 1000ng/mL。3、研究了對質(zhì)粒DNA的檢測靈敏度(見實(shí)施例2)由于最低檢測到的熒光信號對應(yīng)的DNA濃度為O. 01ng/mL，加樣量100 μ L，因此計(jì)算出該方法的靈敏度為lpg。4、定量限(見實(shí)施例2)根據(jù)最低定量的線性范圍，定量限為25pg。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明提供了一種質(zhì)粒DNA熒光染料法定量檢測方法，其特征為用不同濃度的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品與Pi coGreen熒光染料混合，分別測定熒光信號強(qiáng)度，繪制濃度一熒光信號強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后將待測質(zhì)粒DNA樣品稀釋至0. 25ng/mL^lOOOng/mL,與熒光染料混合后，測定熒光信號強(qiáng)度；根據(jù)所繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測質(zhì)粒DNA樣品的DNA濃度。待測質(zhì)粒DNA的分子大小為2k 10k。具體操作步驟如下I)配制合適濃度的熒光染料用工作液稀釋PicoGreen熒光染料至O. 6^1. O μ M濃度；2)制備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品檢測液用工作液對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，得到4 8個濃度的稀釋液；如濃度為Ing/ μ L、0. 5ng/ μ L、0. 25ng/ μ L、0. lng/ μ L、0. Olng/ μ L ；取每一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100 μ L分別與100 μ L步驟I)得到的熒光染料混勻；
3)制備待測物檢測稀釋液A將待測質(zhì)粒DNA樣品用紫外法測定大致濃度范圍后，用工作液稀釋至濃度為O.25ng/mL^1000ng/mL ；B取稀釋好的樣品100 μ L與100 μ L步驟I)得到的熒光染料混勻；4)測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號，繪制濃度一熒光信號強(qiáng)度曲線A將上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品檢測稀釋液轉(zhuǎn)移至同一個96孔酶標(biāo)板上，利用酶標(biāo)儀分別讀取每種濃度標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號強(qiáng)度；設(shè)置酶標(biāo)儀激發(fā)波長480nm，吸收波長為520nm ；B以標(biāo)準(zhǔn)品每種DNA濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的突光信號值為縱坐標(biāo)繪制“突光信號
值-DNA濃度”標(biāo)準(zhǔn)曲線；5)測定待測物熒光信號方法同步驟4) A ;6)計(jì)算待測樣品濃度將待測樣品熒光信號值代入步驟4) B得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測樣品的濃度。以上方法中，所述工作液的成分是IOmM Tris-HCl，含ImM EDTA, pH=8. O。本發(fā)明用超聲波一同位素稀釋質(zhì)譜方法驗(yàn)證了本方法的準(zhǔn)確度(見實(shí)施例3)。本方法的創(chuàng)新點(diǎn)是I、首次采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為熒光染料法中的DNA標(biāo)準(zhǔn)對質(zhì)粒樣品進(jìn)行定量；2、靈敏度高可檢測低至Ipg的DNA ；3、方法線性范圍廣可檢測O. 25ng/mL 1000ng/mL的DNA，跨越4個數(shù)量級；4、準(zhǔn)確度高首次采用高準(zhǔn)確度的超聲波-同位素稀釋質(zhì)譜法對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行定量，得到的量值不確定度低，準(zhǔn)確度高。本發(fā)明還提供了一種質(zhì)粒DNA熒光染料定量檢測試劑盒，試劑盒中包括質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品，PicoGreen熒光染料和工作液，其特征為工作液成分為IOmM Tris-HCl，含 ImM EDTA, ρΗ=8· O ；質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品為具有準(zhǔn)確濃度定量值的環(huán)狀質(zhì)粒分子DNA，濃度范圍是Ing/μ L 300ng/ μ L本發(fā)明中所用的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品用超聲波-酶解-同位素稀釋質(zhì)譜法確定量值，方法為將質(zhì)粒DNA進(jìn)行前處理，然后以核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品和同位素標(biāo)記的核苷酸作為內(nèi)標(biāo)，用高效液相色譜-質(zhì)譜分離單核苷酸并準(zhǔn)確定量；所述前處理是將質(zhì)粒DNA經(jīng)超聲波處理成為長度為200bp以下的片段，然后進(jìn)行酶解，條件為I)超聲波處理強(qiáng)度5，時間25min，上樣量為IOOyL, DNA濃度10-50ng/yL,工作循環(huán)10%，爆破/循環(huán)200，溫度4° C ；2)所述酶是磷酸二酯酶；活性濃度為O. 02-0. 025U/ μ L ；3)磷酸二酯酶水解質(zhì)粒DNA時間為IOOmin以上。本試劑盒的優(yōu)點(diǎn)是I、彌補(bǔ)了現(xiàn)有商業(yè)化突光染料試劑盒中不能對質(zhì)量DNA進(jìn)行定量的缺點(diǎn)；
2、靈敏度高可檢測低至Ipg的DNA ；3、檢測范圍廣可檢測O. 25ng/mL 1000ng/mL的DNA，跨越4個數(shù)量級；4、操作簡便、需要的檢測儀器設(shè)備常規(guī)；5、標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確度高。


圖1為質(zhì)粒DNA濃度(O. 25ng/mL IOOOng / mL)與PicoGreen突光信號強(qiáng)度的關(guān)系;圖2為質(zhì)粒DNA濃度(O. 01ng/mL IOOOOng / mL)與PicoGreen突光信號的關(guān)系;圖3為PicoGreen熒光染料法對質(zhì)粒DNA定量的線性范圍；圖4為PicoGreen熒光染料法對不同分子大小的DNA定量的線性相關(guān)性；圖5為超聲波處理質(zhì)粒PNK603的結(jié)果圖；圖6為標(biāo)準(zhǔn)品色譜分離圖；圖7為質(zhì)粒經(jīng)過超聲和水解后樣品的色譜分離圖；圖8水解樣品的總離子流圖；圖9 提取離子色譜圖((I)dCMP，(II)LdCMP, (III) dTMP, (IV) LdTMP, (V) dGMP, (VI)LdGMP, (VII)dAMP，(VIII)LdAMP)；圖10為兩種方法(PicoGreen突光染料法與超聲波_同位素稀釋質(zhì)譜法)測定結(jié)果比較。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I質(zhì)粒DNA與PicoGreen熒光信號的關(guān)系一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康奶剿髻|(zhì)粒DNA濃度與PicoGreen熒光信號是否有線性關(guān)系二、材料與方法1.質(zhì)粒DNA pBAZS :通過在載體pEASY_T3上連接4個外源基因片斷(擴(kuò)增所用引物見表I)得到。2. PicoGreen突光染料購自life technology公司。用IxTE按照1:200進(jìn)行稀釋。3.將質(zhì)粒DNA配置成10000ng/mL的保存濃度，然后用IxTE稀釋至1000ng/mL、750ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、lng/mL、0. 5ng/mL、0. 25ng/mL。4.取稀釋好的DNA溶液0.1mL與O.1mL的稀釋好的PicoGreen染料混合,轉(zhuǎn)移至96孔酶標(biāo)板。5.將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上,選擇激發(fā)波長480nm,發(fā)射波長520nm進(jìn)行突光信號的米集。6.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以質(zhì)粒DNA濃度為橫坐標(biāo)，以熒光信號為縱坐標(biāo)進(jìn)行曲線繪制，所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由圖1可知，質(zhì)粒DNA與PicoGreen熒光染料結(jié)合后，DNA濃度與熒光信號成正比，線性相關(guān)系數(shù)為O. 996。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論質(zhì)粒DNA濃度與熒光強(qiáng)度具有線性關(guān)系，證明PicoGreen熒光染料法可以對質(zhì)粒DNA進(jìn)行定量。其他的實(shí)例不用包括試驗(yàn)?zāi)康?、結(jié)論等全部寫么？實(shí)施例2PicoGreen法對質(zhì)粒DNA定量的線性范圍及定量限和檢測靈敏度的確定一、材料與方法1.將質(zhì)粒DNA配置成10000ng/mL的保存濃度，然后用IxTE稀釋至5000ng/mL、2500ng/mL、2000ng/mL、1000ng/mL、750ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、lng/mL、0. 5ng/mL、0. 25ng/mL、0. 05ng/mL、0. 01ng/mLo2.取稀釋好的DNA溶液0.1mL與O.1mL的稀釋好的PicoGreen染料混合,轉(zhuǎn)移至96孔酶標(biāo)板。其它操作同實(shí)施實(shí)例I中的5和6。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. PicoGreen熒光染料法測定質(zhì)粒DNA的線性范圍為了測定PicoGreen熒光染料法測定質(zhì)粒定量的線性范圍，將DNA進(jìn)行了 14個不同濃度梯度的稀釋，所有DNA濃度與熒光信號的關(guān)系見圖2，由圖2可知，在實(shí)驗(yàn)的范圍內(nèi)熒光輕度與DNA濃度不完全成正比，當(dāng)濃度超過1000ng/mL或O. 25ng/mL時，熒光強(qiáng)度與DNA濃度已經(jīng)不再是直線關(guān)系了。因此將濃度超過1000ng/mL和濃度低于O. 25ng/mL的點(diǎn)去掉后所得到的即為PicoGreen對質(zhì)粒DNA的定量線性范圍，即O. 25ng/mL 1000ng/mL，見圖3。2. PicoGreen熒光染料法測定質(zhì)粒DNA的定量限根據(jù)上述的線性范圍，最低定量濃度O. 25ng/mL，加樣量為O.1mL,因此可計(jì)算出PicoGreen熒光染料法測定質(zhì)粒DNA的定量限為25pg。3. PicoGreen熒光染料法測定質(zhì)粒DNA的檢測靈敏度由于可檢測的最低信號值對應(yīng)的濃度為O. Olng/mL，加樣量為O.1mL,因此可計(jì)算出PicoGreen突光染料法測定質(zhì)粒DNA的檢測限為lpg。實(shí)施例3對不同分子大小DNA采用PicoGreen熒光染料法進(jìn)行定量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康难芯渴惺蹤z測試劑Lambda DNA是否可作為熒光染料法測定質(zhì)粒DNA的標(biāo)準(zhǔn)品。二、材料與方法1.選擇不同分子大小的DNA:lambda基因組DNA，大小48502bp，購自TAKARA公司，9000bpDNA :采用EcoRI限制性內(nèi)切酶將Lambda基因組DNA進(jìn)行酶切，通過瓊脂糖凝聚電泳回收純化得到；pBAZS質(zhì)粒DNA，如上所述。nosZPCR產(chǎn)物以構(gòu)建的質(zhì)粒為模板，以引物nosZ-F/R擴(kuò)增得到，具體的引物序列見表I。表I引物序列
權(quán)利要求
1.一種質(zhì)粒DNA定量檢測試劑盒，試劑盒中具有標(biāo)準(zhǔn)品、工作液和染料，其特征為 1)所述標(biāo)準(zhǔn)品為具有準(zhǔn)確DNA濃度定量值的環(huán)狀質(zhì)粒分子DNA，濃度范圍是lng/yL 300ng/u L ； 2)所述工作液成分為IOmM Tris-HCl，含 ImM EDTA, pH=8. 0 ； 3)所述染料是PicoGreen熒光染料。
2.權(quán)利要求I所述的試劑盒，所述標(biāo)準(zhǔn)品濃度的定量方法為將質(zhì)粒DNA進(jìn)行前處理，然后以核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品和同位素標(biāo)記的核苷酸作為內(nèi)標(biāo)，用高效液相色譜-質(zhì)譜法分離單核苷酸并準(zhǔn)確定量；其特征為，所述前處理是將質(zhì)粒DNA經(jīng)超聲波處理成為長度為200bp以下的片段，然后進(jìn)行酶解。
3.權(quán)利要求2所述的試劑盒，所述前處理?xiàng)l件為 1)超聲波處理米用聲波聚焦超聲波破碎儀處理，強(qiáng)度5，時間25min,上樣量為100iiL，DNA 濃度10-50ng/iiL，工作循環(huán)10%，爆破 / 循環(huán)200，溫度4° C ； 2)所述酶是磷酸二酯酶；活性濃度為0.02-0. 025U/ u L ； 3)磷酸二酯酶水解質(zhì)粒DNA時間為IOOmin以上。
4.一種質(zhì)粒DNA熒光染料法定量檢測方法，其特征為 用不同濃度的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品與PicoGreen熒光染料混合，分別測定熒光信號強(qiáng)度，繪制濃度一熒光信號強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后將待測質(zhì)粒DNA樣品稀釋至0. 25ng/mL 1000ng/mL，與熒光染料混合后，測定熒光信號強(qiáng)度；根據(jù)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測質(zhì)粒DNA樣品的DNA濃度。
5.權(quán)利要求4所述的方法，具體操作步驟如下 1)配制合適濃度的熒光染料 用工作液稀釋PicoGreen熒光染料至0. 6^1. OuM濃度； 2)制備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品檢測液 用工作液對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，得到4 8個濃度的稀釋液；取每一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100 u L分別與100 u L步驟I)得到的熒光染料混勻； 3)制備待測物檢測稀釋液 A將待測質(zhì)粒DNA樣品用紫外法測定大致濃度范圍后，用工作液稀釋至濃度為0. 25ng/mL lOOOng/mL ； B取稀釋好的樣品100 ii L與100 u L步驟I)得到的熒光染料混勻； 4)測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號，繪制濃度一熒光信號強(qiáng)度曲線 A將上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品檢測稀釋液轉(zhuǎn)移至同一個96孔酶標(biāo)板上，用酶標(biāo)儀分別讀取每種濃度標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號強(qiáng)度； B以標(biāo)準(zhǔn)品每種DNA濃度為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的熒光信號值為縱坐標(biāo)繪制“熒光信號值一DNA濃度”標(biāo)準(zhǔn)曲線； 5)測定待測物熒光信號 方法同步驟4) A ; 6)計(jì)算待測樣品濃度 將待測樣品熒光信號值代入步驟4) B得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測樣品的濃度； 所述工作液的成分是IOmM Tris-HCl，含ImM EDTA, pH=8. O。
6.權(quán)利要求5所述的方法，測定熒光信號時，設(shè)置酶標(biāo)儀激發(fā)波長480nm，吸收波長為520nmo
全文摘要
本發(fā)明首次提供了一種質(zhì)粒DNA定量檢測試劑盒，具有采用高準(zhǔn)確度的超聲波-同位素稀釋質(zhì)譜法準(zhǔn)確定量的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品，彌補(bǔ)了現(xiàn)有試劑盒不能對質(zhì)粒DNA進(jìn)行定量的缺點(diǎn)。本發(fā)明還提供了一種質(zhì)粒DNA定量檢測方法，分別測定不同濃度的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號強(qiáng)度，繪制濃度—熒光信號強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后測定待測質(zhì)粒DNA樣品熒光信號強(qiáng)度，根據(jù)所繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確計(jì)算出待測樣品的DNA濃度。本方法和試劑盒首次采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為熒光染料法中的DNA標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量，靈敏度高，可檢測低至1pg的DNA；線性范圍廣，可檢測0.25ng/mL~1000ng/mL的質(zhì)粒DNA；對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒采用超聲波-同位素稀釋質(zhì)譜方法定量，得到的量值不確定度低，準(zhǔn)確度高。
文檔編號G01N21/64GK102980878SQ20121054144
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者董蓮華, 孟盈, 王晶, 傅博強(qiáng), 高運(yùn)華, 張玲 申請人:中國計(jì)量科學(xué)研究院