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利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)可卡因的熒光檢測(cè)方法

文檔序號(hào):5966002閱讀:635來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)可卡因的熒光檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及可卡因的檢測(cè)方法,尤其是涉及一種利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè) 可卡因的熒光檢測(cè)方法。技術(shù)背景
可卡因是從古柯葉中分離出來(lái)的一種最主要的生物堿,屬中樞神經(jīng)興奮劑,也是 一種強(qiáng)效局部麻醉劑。可卡因?qū)儆诔R?jiàn)毒品之一,吸食可卡因會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的心理依賴(lài)性并 對(duì)身體造成極大傷害,引發(fā)社會(huì)安全問(wèn)題。因此尋找快速、簡(jiǎn)便、高靈敏度的方法來(lái)檢測(cè)可 卡因當(dāng)前研究的熱門(mén)課題,具有重要意義。
如公開(kāi)號(hào)為CN 101948907 A的“一種提高可卡因檢測(cè)靈敏度的方法”,使用的是納 米金顆粒,能觀察到顏色變化,并且可以用通過(guò)光學(xué)和電化學(xué)的信號(hào)來(lái)測(cè)定可卡因的存在。 此專(zhuān)利的優(yōu)點(diǎn)在于能直接通過(guò)顏色變化檢測(cè),且電化學(xué)光化學(xué)均可以,但是檢測(cè)限不高,為 O.5Mmol/L0
隨著科學(xué)家們對(duì)核酸的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注,特別是關(guān)于生物遺傳分子機(jī)理 以及寡核苷酸分子的識(shí)別、測(cè)序等方面的研究。目前針對(duì)于核酸的新型分析方法已經(jīng)在生 命科學(xué)研究、環(huán)境檢測(cè)、藥物毒性篩選和疾病分子診斷等領(lǐng)域得到迅速發(fā)展??茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)核 酸中的可卡因適配體能特異性的與可卡因形成含3個(gè)莖狀結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)合物,這一特 點(diǎn)為可卡因的檢測(cè)提供了新的途徑。因此,一些具有特異性結(jié)合功能的寡核苷酸探針相繼 被開(kāi)發(fā)出來(lái),并取得了較好的效果。
近年來(lái),氧化石墨烯以其特殊的力學(xué)、量子學(xué)和電學(xué)性質(zhì),頗受物理和材料學(xué)界重 視。由于其具有優(yōu)異的電學(xué)性能、導(dǎo)熱性好、比表面積大等優(yōu)點(diǎn),也為生物分子的檢測(cè)提供 了新的思路。目前,隨著單壁碳納米管在生物傳感中的成功應(yīng)用,氧化石墨烯也逐漸成為傳 感領(lǐng)域青睞的對(duì)象。由于氧化石墨烯的特殊性質(zhì),使得檢測(cè)過(guò)程操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速,這樣 大大減少了實(shí)驗(yàn)的步驟,同時(shí)可以顯著的提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有的可卡因檢測(cè)方法存在檢測(cè)儀器昂貴、靈敏度較低等的 問(wèn)題,提供一種利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)可卡因的熒光檢測(cè)方法,其具有較高特異 性和靈敏度。
本發(fā)明利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)可卡因的熒光檢測(cè)方法,按以下次序的步 驟依次進(jìn)行
I)將染料標(biāo)記的寡核苷酸探針加入到緩沖溶液中,對(duì)溶液進(jìn)行熒光檢測(cè),記錄寡 核苷酸探針的熒光發(fā)射譜帶;
2)將氧化石墨烯作為固相載體加入到上述溶液中,使寡核苷酸探針吸附到氧化石 墨烯的表面,形成寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物,將染料的熒光信號(hào)猝滅;
3)在寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物中加入互補(bǔ)探針進(jìn)行反應(yīng),通過(guò)互補(bǔ)探針與寡核苷酸探針的堿基結(jié)合作用,形成雙鏈二級(jí)結(jié)構(gòu),使寡核苷酸探針從氧化石墨烯的表面 脫離并且游離在溶液中從而使熒光得以恢復(fù),在激發(fā)波長(zhǎng)480 490nm,發(fā)射波長(zhǎng)490 650nm下進(jìn)行熒光檢測(cè),所述互補(bǔ)探針包含一段單鏈核酸,與寡核苷酸探針堿基互補(bǔ),無(wú)熒 光標(biāo)記;
4)在雙鏈探針/氧化石墨烯復(fù)合物中加入可卡因進(jìn)行反應(yīng),通過(guò)可卡因與互補(bǔ)探 針的特異性作用,形成含3個(gè)莖狀結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu),使寡核苷酸探針又重新結(jié)合到氧化石 墨烯的表面,從而使突光信號(hào)淬滅,在激發(fā)波長(zhǎng)480 490nm,發(fā)射波長(zhǎng)490 650nm下進(jìn)行 熒光檢測(cè)。
本發(fā)明步驟I)中,用于標(biāo)記的染料為熒光素FAM,染料標(biāo)記在寡核苷酸探針的5’ 端,所述寡核酸探針的堿基組成為5’ -CTGTTCCTTTTAGGAAGTTACTTCACCCAG-3 ,;所用緩沖 溶液為 O. 02mol/L Tris-HCl,O. lmol/L NaCl,O. 005mol/L KCl,0.005mol/L MgCl2 , pH =7. 4。進(jìn)行熒光檢測(cè)方法為以480 490nm為激發(fā)波長(zhǎng),發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為490 650 nm0
本發(fā)明步驟2)中,所述寡核苷酸探針吸附到氧化石墨烯表面的溫度為室溫,熒光 猝滅的時(shí)間為I 3分鐘。
本發(fā)明步驟3)中,所述互補(bǔ)探針的堿基組成為5' -GACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGT GGGTC-3',在寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物中加入互補(bǔ)探針進(jìn)行反應(yīng)的溫度為室溫,寡核 苷酸探針從氧化石墨烯表面脫離的時(shí)間為10 20分鐘。
本發(fā)明步驟4)中,在雙鏈探針/氧化石墨烯復(fù)合物中加入可卡因進(jìn)行反應(yīng)的溫度 為室溫,可卡因與互補(bǔ)探針特異性作用形成含3個(gè)莖狀結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu),使寡核苷酸探針 重新結(jié)合到氧化石墨烯表面的時(shí)間為10 20分鐘。
本發(fā)明先以氧化石墨烯為固相載體用來(lái)吸附熒光素標(biāo)記的寡核苷酸探針,由于氧 化石墨烯表面具有能與寡核苷酸進(jìn)行非共價(jià)鍵結(jié)合作用的化學(xué)基團(tuán),可以使熒光素標(biāo)記的 寡核苷酸探針吸附到氧化石墨烯的表面,從而形成寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物,此時(shí),熒 光素與氧化石墨烯之間發(fā)生高效的能量轉(zhuǎn)移,熒光素的熒光被氧化石墨烯有效的猝滅。當(dāng) 加入互補(bǔ)探針時(shí),互補(bǔ)探針能夠與寡核苷酸探針堿基結(jié)合形成雙鏈結(jié)構(gòu),使寡核苷酸探針 脫離氧化石墨烯的表面,此時(shí)熒光素基團(tuán)與氧化石墨烯之間的距離較遠(yuǎn),不能發(fā)生有效的 能量轉(zhuǎn)移,標(biāo)記在寡核苷酸探針末端的熒光素的熒光信號(hào)得到恢復(fù),可以檢測(cè)到較強(qiáng)的熒 光信號(hào)恢復(fù)。當(dāng)溶液中存在可卡因時(shí),可卡因會(huì)與互補(bǔ)探針特異性結(jié)合形成含3個(gè)莖狀結(jié) 構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu),使寡核苷酸探針重新結(jié)合到氧化石墨烯表面,使熒光發(fā)生淬滅。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)溶液中熒光強(qiáng)度的變化來(lái)達(dá)到檢測(cè)可卡因的 目的,檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速,具有較高特異性和靈敏度,在可卡因檢測(cè)方面具有重要的意義。 根據(jù)本發(fā)明的熒光檢測(cè)方法,最低可檢測(cè)的可卡因的濃度為6nmol/L。當(dāng)體系中含有茶堿、 咖啡堿等其它非靶生物堿分子時(shí),仍然可以實(shí)現(xiàn)對(duì)可卡因的高靈敏度的檢測(cè)。因此,本發(fā)明 有望應(yīng)為實(shí)際樣品中可卡因的檢測(cè)提供一種簡(jiǎn)便、快速的方法。


圖1為本發(fā)明利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)可卡因的熒光檢測(cè)方法的工作原 理圖。
圖2為檢測(cè)過(guò)程中不同反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度結(jié)果對(duì)比圖。其中,a為染料標(biāo)記寡核苷酸探針;b為寡核苷酸+氧化石墨烯復(fù)合物;c為雙鏈探針+氧化石墨烯復(fù)合物;d為雙鏈探針+氧化石墨烯復(fù)合物+可卡因;e為雙鏈探針+氧化石墨烯復(fù)合物+水作空白對(duì)照。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。以下實(shí)施例僅是用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步具體描述,而不是用于對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)范圍的限定。
下述實(shí)施例中,熒光檢測(cè)所用儀器為熒光分光度計(jì)(RF-5301,日本)。熒光光譜測(cè)量條件氙燈激發(fā),激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為5. O nm和10. O nm,電壓為950V,響應(yīng)時(shí)間2 S, 激發(fā)波長(zhǎng)為480 490nm,發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍490 650 nm ;用3 mL石英比色皿進(jìn)行測(cè)量, 樣品體積1. 60 mL ;室溫。
所用氧化石墨烯是根據(jù)文獻(xiàn)(W.S. Hummers, R. E. Offeman, J. Am. Chem. Soc. 1958,80,1339-1339)中 Hummers 的方法合成的。
所用Tris-HCl 緩沖溶液的組成為 O. 02mol/L Tris-HCl,O. lmol/L NaCl, O. 005mol/L KCl ,0. 005mol/L MgCl2 , pH =7.4。
所用寡核苷酸探針和互補(bǔ)探針購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司,
權(quán)利要求
1.一種利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)可卡因的熒光檢測(cè)方法,按以下次序的步驟依次進(jìn)行1)將染料標(biāo)記的寡核苷酸探針加入到緩沖溶液中,對(duì)溶液進(jìn)行熒光檢測(cè),記錄寡核苷酸探針的熒光發(fā)射譜帶;2)將氧化石墨烯作為固相載體加入到上述溶液中,使寡核苷酸探針吸附到氧化石墨烯的表面,形成寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物,將染料的熒光信號(hào)猝滅;3)在寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物中加入互補(bǔ)探針進(jìn)行反應(yīng),通過(guò)互補(bǔ)探針與寡核苷酸探針的堿基結(jié)合作用,形成雙鏈二級(jí)結(jié)構(gòu),使寡核苷酸探針從氧化石墨烯的表面脫離并且游離在溶液中從而使熒光得以恢復(fù),在激發(fā)波長(zhǎng)480 490nm,發(fā)射波長(zhǎng)490 650nm下進(jìn)行熒光檢測(cè),所述互補(bǔ)探針包含一段單鏈核酸,與寡核苷酸探針堿基互補(bǔ),無(wú)熒光標(biāo)記;4)在雙鏈探針/氧化石墨烯復(fù)合物中加入可卡因進(jìn)行反應(yīng),通過(guò)可卡因與互補(bǔ)探針的特異性作用,形成含3個(gè)莖狀結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu),使寡核苷酸探針又重新結(jié)合到氧化石墨烯的表面,從而使突光信號(hào)淬滅,在激發(fā)波長(zhǎng)480 490nm,發(fā)射波長(zhǎng)490 650nm下進(jìn)行突光檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)可卡因的熒光檢測(cè)方法,其特征在于步驟I)中,用于標(biāo)記的染料為熒光素FAM,染料標(biāo)記在寡核苷酸探針的5’端,所述寡核酸探針的堿基組成為5’ -CTGTTCCTTTTAGGAAGTTACTTCACCCAG-3,;所用緩沖溶液為 O. 02mol/L Tris-HCl,O. lmol/L NaCl,0. 005mol/L KCl ,0. 005mol/L MgCl2 , pH =7.4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)可卡因的熒光檢測(cè)方法,其特征在于步驟I)中進(jìn)行熒光檢測(cè)方法為以480 490nm為激發(fā)波長(zhǎng),發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為 490 650 nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)可卡因的熒光檢測(cè)方法,其特征在于步驟2)中,所述寡核苷酸探針吸附到氧化石墨烯表面的溫度為室溫,熒光猝滅的時(shí)間為I 3分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)可卡因的熒光檢測(cè)方法,其特征在于步驟3)中,所述互補(bǔ)探針的堿基組成為5' -GACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTC -3^,在寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物中加入互補(bǔ)探針進(jìn)行反應(yīng)的溫度為室溫,寡核苷酸探針從氧化石墨烯表面脫離的時(shí)間為10 20分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)可卡因的熒光檢測(cè)方法,其特征在于步驟4)中,在雙鏈探針/氧化石墨烯復(fù)合物中加入可卡因進(jìn)行反應(yīng)的溫度為室溫,可卡因與互補(bǔ)探針特異性作用形成含3個(gè)莖狀結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu),使寡核苷酸探針重新結(jié)合到氧化石墨烯表面的時(shí)間為10 20分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用寡核苷酸和氧化石墨烯檢測(cè)可卡因的熒光檢測(cè)方法,先將染料標(biāo)記的寡核苷酸探針加入到緩沖溶液中;再加入氧化石墨烯作為固相載體,使寡核苷酸探針吸附到氧化石墨烯的表面,形成寡核苷酸/氧化石墨烯復(fù)合物,將染料的熒光信號(hào)猝滅;然后加入互補(bǔ)探針進(jìn)行反應(yīng),通過(guò)互補(bǔ)探針與寡核苷酸探針的堿基結(jié)合作用,形成雙鏈二級(jí)結(jié)構(gòu),使熒光得以恢復(fù);最后加入可卡因進(jìn)行反應(yīng),通過(guò)可卡因與互補(bǔ)探針的特異性作用,形成含3個(gè)莖狀結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu),使寡核苷酸探針又重新結(jié)合到氧化石墨烯的表面,使熒光信號(hào)淬滅。本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)溶液中熒光強(qiáng)度的變化來(lái)達(dá)到檢測(cè)可卡因的目的,檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速,具有較高特異性和靈敏度。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102998292SQ20121054562
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者苗立坤, 喻世濤, 黃龍, 朱巍 申請(qǐng)人:湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司, 武漢市黃鶴樓科技園有限公司
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