單克隆抗體間接免疫熒光檢測附紅細(xì)胞體病的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種單克隆抗體間接免疫熒光檢測附紅細(xì)胞體病的方法，包括標(biāo)準(zhǔn)陽性對照和陰性對照的設(shè)立，抗原包被，熒光二抗的稀釋，IFA測定等步驟。采用的抗體是抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體，相對于IHA、ELISA等其他檢測方法所用的一般的抗體而言，其特異性高、敏感性強(qiáng)，準(zhǔn)確性可靠性大；能快速、簡便、可靠、準(zhǔn)確的檢測出樣品中的附紅細(xì)胞體，也可用于附紅細(xì)胞體病的流行病學(xué)調(diào)查和療效檢測。
【專利說明】單克隆抗體間接免疫熒光檢測附紅細(xì)胞體病的方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于生物工程檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及單克隆抗體間接免疫熒光檢測附紅細(xì)胞體病的方法。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]附紅細(xì)胞體病(Eperythrozoonsis)是由附紅細(xì)胞體(Eperythmzoon, EH)寄生于人、動物紅細(xì)胞表面、血漿及骨髓內(nèi)，引起的一種以貧血、黃疸、發(fā)熱等為主要臨床癥狀的人畜共患病。屬于立克次體目(Rickettsiales)、無衆(zhòng)體科(Anaplasmata-ceae)、附紅細(xì)胞體屬(Eperythrozoon)。多在紅細(xì)胞表面單個或成團(tuán)，呈鏈狀或鱗片狀，少量游離。豬附紅細(xì)胞體一般呈環(huán)形，直徑0.8-2.5um，也有球狀、桿狀。對干燥和化學(xué)藥物比較敏感，0.5%石炭酸于37°C經(jīng)3h可將其殺死，一般常用濃度的消毒藥在幾分鐘內(nèi)即可使其死亡，對低溫冷凍的抵抗力較強(qiáng)，可存活數(shù)年之久。附紅細(xì)胞體對宿主的選擇并不嚴(yán)格，人、牛、豬、羊等多種動物均可感染，且感染率比較高。有人做過調(diào)查，各種階段豬的感染率達(dá)80-90% ;人的感染陽性率可達(dá)86% ;而雞的陽性率更高，可達(dá)90%，但除了豬之外的其它動物發(fā)病率不高。多數(shù)隱性，少數(shù)發(fā)病(受應(yīng)激因素刺激)，潛伏期2-45d，因動物種類不同發(fā)病癥狀也不同，發(fā)熱，食欲不振，精神萎頓，黏膜黃染，貧血，背腰及四肢末梢瘀血，淋巴結(jié)腫大，心悸及呼吸加快；腹瀉，生殖力下降，毛質(zhì)下降，紅細(xì)胞數(shù)減少，血紅素、血漿白蛋白、球蛋白均下降，淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞上升，血紅蛋白尿病程長短不一，短者幾天，長者數(shù)年，嚴(yán)重者死亡。
[0005]該病最早發(fā)現(xiàn)于192 8年，直到1950年確定豬的黃疸性貧血是由附紅細(xì)胞體所引起，才逐漸被重視起來。我國于1981年首先在家兔中發(fā)現(xiàn)附紅細(xì)胞體，相繼在牛、羊、豬等家畜中查到附紅細(xì)胞體，以后在人群中也證實(shí)了附紅細(xì)胞體感染的存在。該病不僅導(dǎo)致畜產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量降低，動物生育力下降，而且還可導(dǎo)致動物發(fā)生嚴(yán)重的臨床癥狀甚至死亡，阻礙了畜牧業(yè)的發(fā)展，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對該病的診斷仍多采用鏡檢的方法，但由于一些人為的因素及該病多呈混合感染，常會發(fā)生誤診。近年來發(fā)展起來的分子生物學(xué)檢測方法如PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、核酸雜交等已開始應(yīng)用到該病的檢測診斷中，但特異敏感的檢測方法急需完善，假陰性和假陽性的幾率非常大。所以，目前急需一種特異性強(qiáng)、敏感性高的檢測方法用于附紅細(xì)胞體病的診斷。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，提供一種單克隆抗體間接免疫熒光檢測附紅細(xì)胞體病的方法，快速、 簡便、可靠、準(zhǔn)確的檢測出附紅細(xì)胞體病，以滿足畜牧業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)學(xué)診斷的需求。[0008]本發(fā)明提供的單克隆抗體間接免疫熒光檢測附紅細(xì)胞體病的方法，包括以下步驟:
(1)標(biāo)準(zhǔn)陽性對照和陰性對照的設(shè)立，將自然感染率達(dá)90%以上，且經(jīng)瑞氏、姬姆薩和吖啶橙染色檢測均為陽性的豬血作為標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原對照；將來自西藏地區(qū)且經(jīng)壓片、瑞氏、姬姆薩和吖啶橙染色及PCR檢測均為陰性的豬血作為陰性對照；
(2)抗原包被，取標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性血樣涂片，晾干，并設(shè)空白對照；
(3)熒光二抗的稀釋，分別用0.01%的伊文思藍(lán)和0.01 mo I / L PBS稀釋FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體；
(4)IFA測定，將已包被好的兩組標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性對照的玻片，用冷丙酮和甲醛等比例混合液固定15 min，室溫下干燥，加入相應(yīng)編號的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體20 L，置濕盒中37°C下作用30 min，用PBS輕輕沖洗，然后浸泡于PBS盒中，于電動搖床上輕微搖動，連續(xù)洗滌3次，待免疫熒光片干燥后將其中一組標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性抗原及空白對照玻片中加Λ 10 L用0.01%伊文思藍(lán)稀釋的熒光抗體；另一組加入IOL用0.0lmol / LPBS稀釋的熒光抗體，置濕盒中37°C下作用30 min，用PBS輕輕沖洗，然后浸泡于PBS盒中，于電動搖床上輕微搖動，連續(xù)洗滌3次，待干燥后滴加甘油-PBS緩沖液，覆加蓋玻片，置熒光顯微鏡下觀察；
所述步驟(I)中所用的瑞氏、姬姆薩和吖啶橙染色方法步驟如下:
(1)瑞氏染色，取一潔凈載玻片，以其右端1/3蘸血一滴，作血涂片，自然晾干后滴加瑞氏染液lmin，加等量0.01mol/L PBS (PH6.4)混勻，染色3_5min，水洗，室溫干燥后鏡檢；
(2)姬姆薩染色,作血涂片，自然晾干后用甲醇固定2-3min,加姬姆薩染液15_30min,水洗，室溫干燥后鏡檢；
(3)吖啶橙染色，做血涂片，自然晾干后用95%乙醇固定15-30min，濾紙吸干，1%醋酸作用30s, PBS清洗lmin,于0.01%吖啶橙染液中染色l_5min，PBS清洗lmin,用0.lmol/LCaCl2分色0.5-2min, PBS清洗3次，每次數(shù)秒，甘油和PBS等比例混合封片，立刻于熒光顯微鏡下觀察。
[0009]本發(fā)明提供的單克隆抗體間接免疫熒光檢測附紅細(xì)胞體病的方法，其有益效果在于:提供了一種檢測附紅細(xì)胞體病的標(biāo)準(zhǔn)方法，采用的抗體是抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體，相對于IHA、ELISA等其他檢測方法所用的一般的抗體而言，其特異性高、敏感性強(qiáng)，準(zhǔn)確性可靠性大；能快速、簡便、可靠、準(zhǔn)確的檢測出樣品中的附紅細(xì)胞體，也可用于附紅細(xì)胞體病的流行病學(xué)調(diào)查和療效檢測。
[0010]
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合一個實(shí)施例，對本發(fā)明提供的單克隆抗體間接免疫熒光檢測附紅細(xì)胞體病的方法進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0012]
實(shí)施例
[0013]本實(shí)施例的單克隆抗體間接免疫熒光檢測附紅細(xì)胞體病的方法，包括以下步驟: (1)標(biāo)準(zhǔn)陽性對照和陰性對照的設(shè)立，將自然感染率達(dá)90%以上，且經(jīng)瑞氏、姬姆薩和吖啶橙染色檢測均為陽性的豬血作為標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原對照；將來自西藏地區(qū)且經(jīng)壓片、瑞氏、姬姆薩和吖啶橙染色及PCR檢測均為陰性的豬血作為陰性對照；
(2)抗原包被，取標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性血樣涂片，晾干，并設(shè)空白對照；
(3)熒光二抗的稀釋，分別用0.01%的伊文思藍(lán)和0.01 mo I / L PBS稀釋FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體；
(4)IFA測定，將已包被好的兩組標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性對照的玻片，用冷丙酮和甲醛等比例混合液固定15 min，室溫下干燥，加入相應(yīng)編號的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體20 L，置濕盒中37°C下作用30 min，用PBS輕輕沖洗，然后浸泡于PBS盒中，于電動搖床上輕微搖動，連續(xù)洗滌3次，待免疫熒光片干燥后將其中一組標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性抗原及空白對照玻片中加Λ 10 L用0.01%伊文思藍(lán)稀釋的熒光抗體；另一組加入IOL用0.0lmol / LPBS稀釋的熒光抗體，置濕盒中37°C下作用30 min，用PBS輕輕沖洗，然后浸泡于PBS盒中，于電動搖床上輕微搖動，連續(xù)洗滌3次，待干燥后滴加甘油-PBS緩沖液，覆加蓋玻片，置熒光顯微鏡下觀察；
所述步驟(I)中所用的瑞氏、姬姆薩和吖啶橙染色方法步驟如下:
(1)瑞氏染色，取一潔凈載玻片，以其右端1/3蘸血一滴，作血涂片，自然晾干后滴加瑞氏染液lmin，加等量0.01mol/L PBS (PH6.4)混勻，染色3_5min，水洗，室溫干燥后鏡檢；
(2)姬姆薩染色,作血涂片，自然晾干后用甲醇固定2-3min,加姬姆薩染液15_30min,水洗，室溫干燥后鏡檢；
(3)吖啶橙染色，做血涂片，自然晾干后用95%乙醇固定15-30min，濾紙吸干，1%醋酸作用30s, PBS清洗lmin,于0.01%吖啶橙染液中染色l_5min，PBS清洗lmin,用0.lmol/LCaCl2分色0.5-2min, PBS清洗3次，每次數(shù)秒，甘油和PBS等比例混合封片，立刻于熒光顯微鏡下觀察。
【權(quán)利要求】
1.一種單克隆抗體間接免疫熒光檢測附紅細(xì)胞體病的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)標(biāo)準(zhǔn)陽性對照和陰性對照的設(shè)立，將自然感染率達(dá)90%以上，且經(jīng)瑞氏、姬姆薩和吖啶橙染色檢測均為陽性的豬血作為標(biāo)準(zhǔn)陽性抗原對照；將來自西藏地區(qū)且經(jīng)壓片、瑞氏、姬姆薩和吖啶橙染色及PCR檢測均為陰性的豬血作為陰性對照； (2)抗原包被，取標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性血樣涂片，晾干，并設(shè)空白對照； (3)熒光二抗的稀釋，分別用0.01%的伊文思藍(lán)和0.01 mo I / L PBS稀釋FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體； (4)IFA測定，將已包被好的兩組標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性對照的玻片，用冷丙酮和甲醛等比例混合液固定15 min，室溫下干燥，加入相應(yīng)編號的抗豬附紅細(xì)胞體的單克隆抗體20 L，置濕盒中37°C下作用30 min，用PBS輕輕沖洗，然后浸泡于PBS盒中，于電動搖床上輕微搖動，連續(xù)洗滌3次，待免疫熒光片干燥后將其中一組標(biāo)準(zhǔn)陽性和陰性抗原及空白對照玻片中加Λ 10 L用0.01%伊文思藍(lán)稀釋的熒光抗體；另一組加入IOL用0.0lmol / LPBS稀釋的熒光抗體，置濕盒中37°C下作用30 min，用PBS輕輕沖洗，然后浸泡于PBS盒中，于電動搖床上輕微搖動，連續(xù)洗滌3次，待干燥后滴加甘油-PBS緩沖液，覆加蓋玻片，置熒光顯微鏡下觀察。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體間接免疫熒光檢測附紅細(xì)胞體病的方法，其特征在于:所述步驟(I)中所用的瑞氏、姬姆薩和吖啶橙染色方法步驟如下: (1)瑞氏染色，取一潔凈載玻片，以其右端1/3蘸血一滴，作血涂片，自然晾干后滴加瑞氏染液lmin，加等量0.01mol/L PBS (PH6.4)混勻，染色3_5min，水洗，室溫干燥后鏡檢； (2)姬姆薩染色,作血涂片，自然晾干后用甲醇固定2-3min,加姬姆薩染液15_30min,水洗，室溫干燥后鏡檢； (3)吖啶橙染色，做血涂片，自然晾干后用95%乙醇固定15-30min，濾紙吸干，1%醋酸作用30s, PBS清洗lmin,于0.01%吖啶橙染液中染色l_5min，PBS清洗lmin,用0.lmol/LCaCl2分色0.5-2min, PBS清洗3次，每次數(shù)秒，甘油和PBS等比例混合封片，立刻于熒光顯微鏡下觀察。
【文檔編號】G01N33/577GK103869071SQ201210550663
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月18日
【發(fā)明者】張述智, 夏偉, 朱紹輝, 張 浩, 王曉麗, 徐權(quán)汗, 李之詳, 許團(tuán)輝 申請人:青島中仁藥業(yè)有限公司