專利名稱：一種影響骨骼礦化作用藥物的篩選系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種影響骨骼礦化作用藥物的篩選系統(tǒng)，特別涉及一種鈣黃綠素為染劑的骨骼礦化作用藥物的篩選系統(tǒng)，屬于藥物篩選技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于科技文明的進(jìn)步，男女平均年齡不斷提高，老化的人口增加，使得骨質(zhì)疏松癥的患者逐漸增多。骨質(zhì)疏松癥為一種因骨質(zhì)減少及骨密度降低使骨骼結(jié)構(gòu)松散的疾病，患者骨骼脆弱易骨折。此類疾病常見于55歲以上的老年人及停經(jīng)后的婦女，其原因?yàn)楣趋览匣c停經(jīng)后的婦女動(dòng)情激素分泌停止，使得骨質(zhì)大量流失。為了補(bǔ)充流失的骨質(zhì)，多數(shù)人會(huì)攝取大量的鈣質(zhì)及維他命D，停經(jīng)后的婦女會(huì)補(bǔ)充女性荷爾蒙(動(dòng)情素和黃體素)，或是服用抑鈣素抑制鈣質(zhì)流失?，F(xiàn)今醫(yī)學(xué)上常用的抗骨質(zhì)疏松藥物多為雙磷酸鹽類藥物(如Alendronate, Ibandronate),其功用大多數(shù)是抑制骨質(zhì)流失(蝕骨細(xì)胞)的速率，但促進(jìn)其再吸收的藥物則相當(dāng)稀少。因此，如何以快速有效的活體平臺(tái)及方法來(lái)篩選治療的藥劑，就成為此研究上一重要的指標(biāo)。目前篩選抗骨質(zhì)疏松藥物的研究上，主要是利用⑴活體外細(xì)胞株(hMSCs)培養(yǎng)進(jìn)行藥物篩選分析，產(chǎn)生大量初步的結(jié)果。再利用(2)活體內(nèi)嚙齒類動(dòng)物驗(yàn)證大量初步結(jié)果，但過(guò)程相當(dāng)緩慢且耗費(fèi)金錢，加上活體外細(xì)胞株驗(yàn)證并不能系統(tǒng)性地解釋藥物活性及毒性，嚙齒類動(dòng)物模型又無(wú)法快速地驗(yàn)證其結(jié)果，造成藥物大量篩選一個(gè)很大的斷層。有鑒于以上研究平臺(tái)及方法的不足，我們發(fā)展一個(gè)可大量快速篩選抗骨質(zhì)疏松藥物的模型，一來(lái)?yè)碛谢铙w外細(xì)胞株可快速篩選之優(yōu)勢(shì)，二來(lái)也具有整體性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性特點(diǎn)。斑馬魚(Daniorerio)是一種小型熱帶淡水魚,屬于鯉科,為一種完善的脊椎動(dòng)物模型，胚胎可在體外發(fā)育生長(zhǎng)，便于觀察與操作。半透明的組織與相對(duì)較快的胚胎發(fā)展，使斑馬魚在研究型態(tài)及細(xì)胞生物學(xué)成為一個(gè)良好的生物模型。斑馬魚與哺乳類一樣，骨骼系統(tǒng)由軟骨及硬骨所組成。在胚胎發(fā)育的過(guò)程中，硬骨的形成主要經(jīng)由兩種過(guò)程軟骨內(nèi)骨化(intramembranous ossification)及膜內(nèi)骨化(endochondralossification) (Olsen BR, Reginato AM, Wang W(2000)Bone development.Annu Rev Cell DevBiol 16:191-220)。軟骨內(nèi)骨化的過(guò)程為間質(zhì)干細(xì)胞起始在軟骨內(nèi)骨骼上形成軟骨，硬骨在軟骨上形成，最后取代軟骨；這類的骨頭包括人類的四肢骨及魚類的下顎骨及鰭條骨。膜內(nèi)骨化形成于頭骨大部分的扁平骨，其骨化過(guò)程中不經(jīng)過(guò)形成軟骨形成的階段，直接分化為成骨細(xì)胞，分泌細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行礦物化，最后形成硬骨。(AkiyamaH, Kim JE,Nakashima K,BalmesG, Iwai N, et al. (2005)Osteo-chondroprogenitorcells are derived from Sox9 expressingprecursors. Proc Natl Acad Sci USA102:14665-14670)斑馬魚與哺乳類的脊椎骨發(fā)育不同，在胚胎早期發(fā)育的過(guò)程中，哺乳類是經(jīng)由軟骨內(nèi)骨化所形成，而斑馬魚是經(jīng)由膜內(nèi)骨化的方式形成，無(wú)須經(jīng)由形成軟骨骨架的過(guò)程，在受精后第七天便可發(fā)現(xiàn)脊索(notochord)上部分的骨頭已經(jīng)開始進(jìn)行礦化作用，之后直接形成脊椎骨，所以可直接經(jīng)由斑馬魚半透明之胚胎進(jìn)行礦化作用的觀察。在 Angeleen Fleming et al. (2005) Journal of Biomolecular Screening 中，Angeleen Fleming等人發(fā)表一種以斑馬魚作為動(dòng)物模型來(lái)篩選以及評(píng)估已知藥物的方法，該方法為(I)首先，將所收集到的胚胎置于胚胎培養(yǎng)液中以標(biāo)準(zhǔn)方法養(yǎng)育，待受精后三天將胚胎分別置于含有200ul胚胎培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板中(96-well plate)中，每個(gè)孔洞中有三只胚胎。由于測(cè)試之藥物為100倍之濃度，加入配于100% DMSO的藥物中以2μ I的藥物加入稀釋，以28. 5°C培育至受精后九天；(2)胚胎麻醉并以4%多聚甲醛固定胚胎，接著以染劑茜素紅之標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行染色；(3)以SZX12立體顯微鏡及ColorView照相機(jī)進(jìn)行影像擷取，將實(shí)驗(yàn)組及控制組利用頭部影像染劑之有無(wú)或深淺以AnalySis software分別進(jìn)行定量，在T-test測(cè)定其組間是否有顯著差異。文獻(xiàn)中，已經(jīng)利用斑馬魚成功的驗(yàn)證一些臨床上已知藥物可促進(jìn)骨頭的礦物化程度，例如維他命D3 (cholecalciferol)、|丐三醇(calcitriol),副甲狀腺激素特立帕肽(Teriparatide)等等藥物,可作為陽(yáng)性藥物的控制組。雖然Angeleen Fleming等人發(fā)表以斑馬魚作為動(dòng)物模型的分析方法確實(shí)可以用來(lái)篩選影響礦化作用之藥物，但是以染劑之深淺作為數(shù)值化定量的結(jié)果并不能完全定義出其改變的程度。為了克服以上的不足，本發(fā)明利用鈣黃綠素為染劑作為骨骼礦化作用的藥物篩選系統(tǒng)，直接以脊索上的染色面積做為定量上的標(biāo)準(zhǔn)，以評(píng)估未知藥物對(duì)于骨骼礦物化之影響
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鈣黃綠素為染劑的骨骼礦化作用藥物的篩選系統(tǒng)。本發(fā)明的目的之一是提供鈣黃綠素作為染劑應(yīng)用于斑馬魚魚體的礦化程度評(píng)估中；由于現(xiàn)有技術(shù)中的染劑施用于斑馬魚后，是以染色后顏色深淺作為數(shù)值化定量的結(jié)果，不能完全定義出其改變的程度，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)斑馬魚魚體骨骼的礦化程度變化可以由活體染劑鈣黃綠素染色后的影像面積數(shù)值來(lái)評(píng)價(jià)，藉此所得到的數(shù)據(jù)可供用于大量篩選促進(jìn)礦化作用藥物之效用；具體技術(shù)方案為鈣黃綠素作為染劑在制備用于篩選礦化程度藥物篩選系統(tǒng)中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，上述應(yīng)用，步驟如下A、斑馬魚樣本前處理在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入I 30條發(fā)育至3天大的健康斑馬魚幼魚，加入藥物溶液，然后用胚胎培養(yǎng)液補(bǔ)至每培養(yǎng)孔中液體體積不小于lml，加蓋封閉，28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h 96h，得施藥斑馬魚；B、染色取施藥斑馬魚，加入鈣黃綠素溶液中，鈣黃綠素溶液質(zhì)量濃度為
O.Γ0. 3%，染色I(xiàn) 2. 5小時(shí)，制得染色斑馬魚；C、清洗將染色斑馬魚用胚胎培養(yǎng)液清洗，然后用胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)2 4h，再用胚胎培養(yǎng)液清洗魚體至胚胎培養(yǎng)液為無(wú)色；
D、熒光定量在熒光條件下對(duì)顯示黃綠色熒光部分進(jìn)行面積統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)板，是指6孔、12孔、24孔、48孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。本發(fā)明用胚胎培養(yǎng)液補(bǔ)每培養(yǎng)孔中液體體積，根據(jù)不同規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)孔體積不同，培養(yǎng)孔容納液體體積也不相同，6孔板孔容納最大體積為16. 5ml, 12孔板孔容納最大體積為6. 5ml, 24孔板孔容納最大體積為2. 9ml, 48孔板孔容納最大體積為1. 7ml。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種利用鈣黃綠素為染劑評(píng)價(jià)帶篩選藥物骨骼礦化作用大小的藥物篩選系統(tǒng)。具體技術(shù)方案為一種鈣黃綠素為染劑的骨骼礦化作用的藥物篩選系統(tǒng)，包括受試組的斑馬魚胚胎實(shí)驗(yàn)前將健康成年斑馬魚放置在交配缸排卵，收集受精卵，放置在胚胎培養(yǎng)液中，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光環(huán)境下培養(yǎng)3天，然后加入待篩選藥物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)72h 96h，獲得受試藥物組；陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎實(shí)驗(yàn)前將健康成年斑馬魚放置在交配缸排卵，收集受精卵，放置在胚胎培養(yǎng)液中，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光環(huán)境下培養(yǎng)3天，然后加入陽(yáng)性對(duì)照藥物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)72h 96h，獲得陽(yáng)性控制組；陰性控制組的斑馬魚胚胎實(shí)驗(yàn)前將健康成年斑馬魚放置在交配缸排卵，收集受精卵，放置在胚胎培養(yǎng)液中，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光環(huán)境下培養(yǎng)，時(shí)間與陽(yáng)性控制組和受試組相同，獲得陰性控制組；鈣黃綠素染劑質(zhì)量濃度為O. Γ0. 3%的鈣黃綠素溶液；用于對(duì)已礦化之骨頭進(jìn)行活體熒光染色；影像采集系統(tǒng)用于對(duì)受試組的斑馬魚胚胎、陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎、陰性控制組的斑馬魚胚胎的魚體脊椎骨的位置進(jìn)行影像采集，分別得到受試組的斑馬魚胚胎、陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎、陰性控制組的斑馬魚胚胎的魚體影像；影像分析及統(tǒng)計(jì)軟件用于對(duì)受試組的斑馬魚胚胎、陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎、陰性控制組的斑馬魚胚胎的魚體脊椎骨影像進(jìn)行分析，分別得到受試組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值、陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值以及陰性控制組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎中陽(yáng)性對(duì)照藥物為促進(jìn)骨骼礦化作用的陽(yáng)性對(duì)照藥物或者用于抑制骨骼礦化作用的陽(yáng)性對(duì)照藥物，促進(jìn)骨骼礦化作用的陽(yáng)性對(duì)照藥物為阿侖唑奈(Alendronate),維生素D3 (cholecalciferol), I丐三醇(calcitriol)或副甲狀腺激素特立帕肽(Teriparatide)中的一種；抑制骨骼礦化作用的陽(yáng)性對(duì)照藥物為6-[4-[2-(1_哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[l，5-a]嘧P定(Dorsomorphin)0一種利用鈣黃綠素為染劑篩選骨骼礦化作用藥物的方法，步驟如下( 1)分組將健康斑馬魚受精卵收集在培養(yǎng)液中，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光環(huán)境下培養(yǎng)3天，幼魚從卵中孵出，挑選健康幼魚，隨即分組，同一組置于一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中，每組f 30條；將加入待篩選藥物的孔設(shè)為受試組；加入陽(yáng)性對(duì)照藥物的孔設(shè)為陽(yáng)性控制組；加入不含藥物的培養(yǎng)液的孔設(shè)為陰性控制組；
(2)藥物處理向上述各組孔中加入溶劑，然后加入培養(yǎng)液至每孔相同體積，加蓋封閉，在28°C、光照14h/黑暗10h的控光環(huán)境下培養(yǎng)72h 96h ；(3)染色吸去孔中藥液，加入質(zhì)量濃度為0.1-0. 3%的鈣黃綠素溶液，染色1- 2. 5小時(shí)，染色結(jié)束后將染色劑吸出，用胚胎培養(yǎng)液清洗后，繼續(xù)靜置2 4h，再用胚胎培養(yǎng)液清洗魚體至胚胎培養(yǎng)液為無(wú)色；(4)圖像采集利用圖像采集工具對(duì)經(jīng)熒光照射的受試組的斑馬魚胚胎、陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎、陰性控制組的斑馬魚胚胎的魚體黃綠部位進(jìn)行影像采集，之后利用圖像處理軟件進(jìn)行面積定量；(5)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析分析統(tǒng)計(jì)受試組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值、陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值以及陰性控制組的斑馬魚胚胎的黃綠色部位影像平均面積數(shù)值，其中若陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值高于受試組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值，并且受試組的斑馬魚胚胎與陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎的平均面積數(shù)值之間的差異具有p〈0. 05的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，該藥物被認(rèn)為是促進(jìn)礦化作用的藥物；陰性控制組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值低于受試組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值，并且受試組的斑馬魚胚胎與陰性控制組的斑馬魚胚胎平均面積數(shù)值之間的差異具有p〈0. 05的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，該藥物被認(rèn)為是抑制礦化作用的藥物。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中陽(yáng)性對(duì)照藥物為促進(jìn)骨骼礦化作用的陽(yáng)性對(duì)照藥物或者用于抑制骨骼礦化作用的陽(yáng)性對(duì)照藥物，促進(jìn)骨骼礦化作用的陽(yáng)性對(duì)照藥物為阿侖唑奈(Alendronate),維生素 D3 (cholecalciferol)， 丐三酉享(calcitriol)或副甲狀腺激素特立帕肽(Teriparatide)中的一種；抑制骨骼礦化作用的陽(yáng)性對(duì)照藥物為6-[4-[2-(1_哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[l，5-a]嘧啶(Dorsomorphin).根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的斑馬魚為野生型斑馬魚或AB系斑馬魚。轉(zhuǎn)基因斑馬魚是在特定組織或者蛋白上標(biāo)記熒光蛋白，方便觀察，并不會(huì)影響本發(fā)明所述的染色劑對(duì)斑馬魚骨骼染色的效果。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中所述的溶劑為二甲基亞砜、甲醇或水。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(4)中的圖像采集工具為熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡。本發(fā)明所述試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)市售產(chǎn)品。有益效果1、本發(fā)明通過(guò)觀察斑馬魚脊索上骨礦化的根數(shù)及面積可以反映待篩選物質(zhì)影響骨礦化作用的程度，這與先前的檢測(cè)方法都不同，為眾多的化合物提供了新方法。2、本發(fā)明與傳統(tǒng)用茜素紅染色方法相比，用染色的有無(wú)代替染色深淺評(píng)價(jià)骨骼形成的變化，解決了傳統(tǒng)染色通過(guò)深淺程度判斷易受染色條件、染色時(shí)間、操作等外界因素影響，克服了無(wú)法準(zhǔn)確反映骨骼礦化程度的缺陷。
3、本發(fā)明利用活體染劑來(lái)染色已礦化的骨頭，在熒光顯微鏡下可明顯觀察到礦化骨骼發(fā)出黃綠色熒光，熒光區(qū)域界線明顯，對(duì)熒光區(qū)域面積定量，比傳統(tǒng)方法采用染色深淺程度定量相比，準(zhǔn)確性明顯提高。4、本發(fā)明中的模型動(dòng)物斑馬魚，與體外細(xì)胞株及嚙齒類動(dòng)物相比，具有細(xì)胞株可置于多孔板大量篩選之效率，也有嚙齒類動(dòng)物活體內(nèi)驗(yàn)證之優(yōu)點(diǎn)。利用斑馬魚胚胎進(jìn)行大量化合物的篩選，有助于提高篩選效率和降低實(shí)驗(yàn)成本。


圖1 :Alendronate對(duì)斑馬魚礦化促進(jìn)作用的I丐黃綠素染色照片；其中，左側(cè)為白光下顯微鏡圖，中部為熒光顯微鏡圖，右側(cè)為熒光顯微鏡下背部骨骼局部放大圖；圖2 :Alendronate增加斑馬魚骨骼礦化面積的柱狀圖；圖3 :Alendronate 結(jié)構(gòu)式圖；圖4 :Dorsomorphin抑制斑馬魚骨骼礦化作用的I丐黃綠素的染色照片；其中，左側(cè)為白光下顯微鏡圖，中部為熒光顯微鏡圖，右側(cè)為熒光顯微鏡下背部骨骼局部放大圖；圖5 :Dorsomorphin抑制斑馬魚骨骼礦化面積的柱狀圖；圖6 Dorsomorphin 結(jié)構(gòu)式；圖7 :Pentamidine (CY⑶-1140)促進(jìn)斑馬魚骨骼礦化作用的鈣黃綠素的染色照片;其中，左側(cè)為白光下顯微鏡圖，中部為熒光顯微鏡圖，右側(cè)為熒光顯微鏡下背部骨骼局部放大圖；圖8 :Pentamidine (CYCU-1140)促進(jìn)斑馬魚骨骼礦化面積的柱狀圖；圖9 Pentamidine (CYCU-1140)化學(xué)結(jié)構(gòu)式；圖10 :菌素紅染色圖；圖11 :鈣黃綠素染色圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和說(shuō)明書附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實(shí)驗(yàn)材料胚胎培養(yǎng)液(EmbryoMedium)胚胎培養(yǎng)液配方如表I所示表1.胚胎培養(yǎng)液的配方
權(quán)利要求
1.鈣黃綠素作為染劑在制備用于篩選礦化程度藥物篩選系統(tǒng)中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下 A、斑馬魚樣本前處理在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入I 30條發(fā)育至3天大的健康斑馬魚幼魚，加入藥物溶液，然后用胚胎培養(yǎng)液補(bǔ)至每培養(yǎng)孔中液體體積不小于1ml，加蓋封閉，28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h 96h，得施藥斑馬魚； B、染色取施藥斑馬魚，加入鈣黃綠素溶液，鈣黃綠素溶液質(zhì)量濃度為O.Γ0. 3%，染色I(xiàn) 2. 5小時(shí)，制得染色斑馬魚； C、清洗將染色斑馬魚用胚胎培養(yǎng)液清洗，然后用胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)2 4h，再用胚胎培養(yǎng)液清洗魚體至胚胎培養(yǎng)液為無(wú)色； D、熒光定量在熒光條件下對(duì)顯示黃綠色熒光部分進(jìn)行面積統(tǒng)計(jì)分析。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)板，是指6孔、12孔、24孔、48孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
4.一種鈣黃綠素為染劑的骨骼礦化作用的藥物篩選系統(tǒng)，其特征在于，包括 受試組的斑馬魚胚胎實(shí)驗(yàn)前將健康成年斑馬魚放置在交配缸排卵，收集受精卵，放置在胚胎培養(yǎng)液中，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光環(huán)境下培養(yǎng)3天，然后加入待篩選藥物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)72h 96h，獲得受試藥物組； 陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎實(shí)驗(yàn)前將健康成年斑馬魚放置在交配缸排卵，收集受精卵，放置在胚胎培養(yǎng)液中，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光環(huán)境下培養(yǎng)3天，然后加入陽(yáng)性對(duì)照藥物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)72h 96h，獲得陽(yáng)性控制組； 陰性控制組的斑馬魚胚胎實(shí)驗(yàn)前將健康成年斑馬魚放置在交配缸排卵，收集受精卵，放置在胚胎培養(yǎng)液中，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光環(huán)境下培養(yǎng)，時(shí)間與陽(yáng)性控制組和受試組相同，獲得陰性控制組； 鈣黃綠素染劑質(zhì)量濃度為O. Γ0. 3%的鈣黃綠素溶液；用于對(duì)已礦化之骨頭進(jìn)行活體熒光染色； 影像采集系統(tǒng)用于對(duì)受試組的斑馬魚胚胎、陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎、陰性控制組的斑馬魚胚胎的魚體脊椎骨的位置進(jìn)行影像采集，分別得到受試組的斑馬魚胚胎、陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎、陰性控制組的斑馬魚胚胎的魚體影像； 影像分析及統(tǒng)計(jì)軟件用于對(duì)受試組的斑馬魚胚胎、陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎、陰性控制組的斑馬魚胚胎的魚體脊椎骨影像進(jìn)行分析，分別得到受試組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值、陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值以及陰性控制組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值。
5.如權(quán)利要求4所述的藥物篩選系統(tǒng)，其特征在于，所述陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎中陽(yáng)性對(duì)照藥物為促進(jìn)骨骼礦化作用的陽(yáng)性對(duì)照藥物或者用于抑制骨骼礦化作用的陽(yáng)性對(duì)照藥物，促進(jìn)骨骼礦化作用的陽(yáng)性對(duì)照藥物為阿侖唑奈，維生素D3，鈣三醇或副甲狀腺激素特立帕肽中的一種；抑制骨骼礦化作用的陽(yáng)性對(duì)照藥物為6-[4-[2-(1_哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[l，5-a]嘧啶。
6.一種利用鈣黃綠素為染劑篩選骨骼礦化作用藥物的方法，其特征在于，步驟如下 (1)分組 將健康斑馬魚受精卵收集在培養(yǎng)液中，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光環(huán)境下培養(yǎng)3天，幼魚從卵中孵出，挑選健康幼魚，隨即分組，同一組置于一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板的孔中，每組Γ30條；將加入待篩選藥物的孔設(shè)為受試組；加入陽(yáng)性對(duì)照藥物的孔設(shè)為陽(yáng)性控制組；力口入不含藥物的培養(yǎng)液的孔設(shè)為陰性控制組； (2)藥物處理 向上述各組孔中加入溶劑，然后加入培養(yǎng)液至每孔相同體積，加蓋封閉，在28°C、光照14h/黑暗IOh的控光環(huán)境下培養(yǎng)72h 96h ； (3)染色 吸去孔中藥液，加入質(zhì)量濃度為O. Γ0. 3%的鈣黃綠素溶液，染色f 2. 5小時(shí)，染色結(jié)束后將染色劑吸出，用胚胎培養(yǎng)液清洗后，繼續(xù)靜置2 4h，再用胚胎培養(yǎng)液清洗魚體至胚胎培養(yǎng)液為無(wú)色； (4)圖像采集 利用圖像采集工具對(duì)經(jīng)熒光照射的受試組的斑馬魚胚胎、陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎、陰性控制組的斑馬魚胚胎的魚體黃綠部位進(jìn)行影像采集，之后利用圖像處理軟件進(jìn)行面積定量； (5)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 分析統(tǒng)計(jì)受試組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值、陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值以及陰性控制組的斑馬魚胚胎的黃綠色部位影像平均面積數(shù)值，其中若陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值高于受試組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值，并且受試組的斑馬魚胚胎與陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎的平均面積數(shù)值之間的差異具有P〈0. 05的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，該藥物被認(rèn)為是促進(jìn)礦化作用的藥物；陰性控制組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值低于受試組的斑馬魚胚胎的影像平均面積數(shù)值，并且受試組的斑馬魚胚胎與陰性控制組的斑馬魚胚胎平均面積數(shù)值之間的差異具有p〈0. 05的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，該藥物被認(rèn)為是抑制礦化作用的藥物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的陽(yáng)性對(duì)照藥物為促進(jìn)骨骼礦化作用的陽(yáng)性對(duì)照藥物或者用于抑制骨骼礦化作用的陽(yáng)性對(duì)照藥物，促進(jìn)骨骼礦化作用的陽(yáng)性對(duì)照藥物為阿侖唑奈，維生素D3，鈣三醇或副甲狀腺激素特立帕肽中的一種；抑制骨骼礦化作用的陽(yáng)性對(duì)照藥物為6-[4-[2-(1_哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1，5-a]嘧啶。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的斑馬魚為野生型斑馬魚或AB系斑馬魚。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中所述的溶劑為二甲基亞砜、甲醇或水。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中的圖像采集工具為熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種影響骨骼礦化作用藥物的篩選系統(tǒng)，包括受試組的斑馬魚胚胎；陽(yáng)性控制組的斑馬魚胚胎；陰性控制組的斑馬魚胚胎；鈣黃綠素染劑；影像采集系統(tǒng)；影像分析及統(tǒng)計(jì)軟件。本發(fā)明與傳統(tǒng)用茜素紅染色方法相比，用染色的有無(wú)代替染色深淺評(píng)價(jià)骨骼形成的變化，解決了傳統(tǒng)染色通過(guò)深淺程度判斷易受染色條件、染色時(shí)間、操作等外界因素影響，克服了無(wú)法準(zhǔn)確反映骨骼礦化程度的缺陷。
文檔編號(hào)G01N21/00GK103063630SQ20121055633
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者韓利文, 劉可春, 蔡志杰, 蕭崇德 申請(qǐng)人:山東省科學(xué)院生物研究所, 力鈞生物科技有限公司