基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的大規(guī)模血漿鞘脂輪廓分析方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的大規(guī)模血漿鞘脂輪廓分析方法，其特征在于：采用甲基叔丁基醚/甲醇/水（MTBE/MeOH/H2O）雙相提取，并結(jié)合溫和堿性水解，提取血漿中鞘脂。隨后用超高效液相色譜-電噴霧離子化-質(zhì)譜聯(lián)用在15min內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速半定量分析。本發(fā)明中的MTBE/MeOH/H2O提取體系簡單，快速，易于操作，提取液中蛋白干擾少，重復(fù)性好，同時(shí)通過水解除去脂質(zhì)組中高豐度磷脂和甘油酯的干擾，降低離子抑制，達(dá)到高靈敏度檢測低豐度鞘脂的目的。后續(xù)的超高效液相色譜（UHPLC）的高分辨分離能力和MRM的特異性，可以實(shí)現(xiàn)對異構(gòu)體的有效區(qū)分，避免定量時(shí)引入復(fù)雜的同位素校正，使更快速、準(zhǔn)確。
【專利說明】基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的大規(guī)模血漿鞘脂輪廓分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分析化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，是一種基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的大規(guī)模血漿鞘脂的輪廓分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鞘脂(sphingolipids, SLs)是一類結(jié)構(gòu)中以1，3_輕基_2_氨基燒烴/烯烴為共同母核的脂質(zhì)分子。隨著2-氨基以酰胺鍵與各種不同鏈長不同飽和度的脂肪酸相連，以及1-羥基與各類極性基團(tuán)的相連(如磷酸膽堿、各類簡單及復(fù)雜糖基等)，鞘脂分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，化學(xué)性質(zhì)不一，同時(shí)各亞類鞘脂的豐度也差距很大。盡管鞘脂組是整個(gè)脂質(zhì)組中微小的一部分，其在生命體的功能卻不可小覷。鞘脂是構(gòu)成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的必需組成成分，同時(shí)作為信號分子參與細(xì)胞凋亡、分化等多個(gè)生命過程。鞘脂代謝異常與肥胖、胰島素抵抗、糖尿病、阿爾茲海默癥、癌癥等多種疾病密切相關(guān)。血漿作為常用的生物體液，包含了大量的代謝物信息。因此建立可靠、穩(wěn)健、簡單、高靈敏度的大規(guī)模血漿鞘脂輪廓分析方法對于鞘脂代謝相關(guān)的生理、病理研究具有積極的意義。
[0003]傳統(tǒng)的鞘脂分析手段包括薄層色譜(TLC)，衍生化后高效液相色譜(HPLC)-紫外/熒光檢測，或免疫化學(xué)手段。然而這些方法嚴(yán)重受限于檢測的特異性，無法在分子水平上實(shí)現(xiàn)對鞘脂的準(zhǔn)確定量。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是目前理想的用于鞘脂組分析的手段。
[0004]目前氯仿/甲醇/水體系(CHCl3/Me0H/H20)提取結(jié)合甲醇鈉溫和堿性水解是提取鞘脂用于HPLC-MS/MS分析的最經(jīng)典方法。提取全脂直接用于HPLC-MS/MS鞘脂分析的提取方法也多有采用，體系包括氯仿/甲醇/水體系(CHCl3/Me0H/H20)、正丁醇/水體系(l_butanol/H20)、異丙醇/乙酸乙酯體系(isopropanol/ethyl acetate)等。相對于前者，這些方法受來自共存高豐度甘油酯(glycerolipids)和甘油磷脂(glycerophospholipids)的離子抑制效應(yīng)，從而影響檢測靈敏度。此外，也有提取出全脂后用固相萃取(SPE)柱對某些亞類鞘脂(如神經(jīng)酰胺)進(jìn)行選擇性富集的方法，然而該方法操作復(fù)雜，通量低。氯仿具有較強(qiáng)的毒性(肝毒性)，CHCl3/Me0H/H20提取體系離心后自上而下分別為水層-蛋白及殘?jiān)鼘?有機(jī)層的分布，吸取氯仿層易引入誤差，影響提取重復(fù)性，且容易在提取液中引入蛋白干擾。在后續(xù)的HPLC-MS/MS分析中，多采用正相液相色譜(NPLC)，在定量時(shí)需要進(jìn)行同位素校正；一些方法使用反相色譜(RPLC)，分離時(shí)間長，或引入氯仿作為洗脫流動相。由于鞘脂各亞類在結(jié)構(gòu)和豐度上的多樣性，多平臺的引入(多個(gè)提取+多個(gè)LC-MS方法)可以覆蓋盡可能多的鞘脂，但會使方法復(fù)雜?；诖?，我們發(fā)展了一種基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的血漿鞘脂輪廓分析方法，以期在盡可能簡單快速的條件下實(shí)現(xiàn)對鞘脂的大規(guī)模覆蓋。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的大規(guī)模血漿鞘脂輪廓分析方法，可提供生命體的鞘脂代謝輪廓，用于鞘脂代謝相關(guān)的研究，為了解機(jī)體的生理過程、疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、機(jī)體對病變和藥物的應(yīng)答以及個(gè)性化治療方案提供有效的信息和依據(jù)。該方法具有靈敏度高、重復(fù)性好、特異性好、簡單快速，穩(wěn)健可靠的優(yōu)點(diǎn)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]第一步:將低溫保存的血漿冰浴下解凍，定量移取40yL，并加入30yL內(nèi)標(biāo)混合溶液，渦旋混勻。內(nèi)標(biāo)溶液成分和濃度為=Ceramide (dl8:1/17:0)0.42nmol/mL,SM (dl8:1/12:0) L 67nmol/mL, Sphingosine (dl7:1) 0.17nmol/mL, Lactosylceramide (dl8:1/12:0)0.17nmol/mL, Glucosylceramide(dl8:1/12:0)0.03nmol/mL, Dihydroceramide(dl8:0/12:0)0.03nmol/mL。
[0008]第二步:冰浴下加入225 μ L甲醇和75 μ LlM的甲醇鈉-甲醇溶液,渦旋。加入ImLMTBE，渦旋。
[0009]第三步:置于37°C搖床上震蕩2h。
[0010]第四步:取出后冷卻，加入25 μ L20% (v/v)乙酸水溶液和250 μ L超純水，渦旋。
[0011]第五步:10°C,轉(zhuǎn)速12000rpm下高速離心IOmin,定量取出上清800 μ L,冷凍干燥。
[0012]第六步，分析前用復(fù)溶液甲醇/異丙醇/水=65/30/5 (Me0H/IPA/H20=65/30/5)復(fù)溶至50 μ L，渦旋lmin，用于HPLC-MS/MS分析，進(jìn)樣體積為5 μ L。
[0013]超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的儀器為LC/MS QQQ6460 (Agilent, SantaClara, CA, USA)
[0014]液相條件為:色譜柱為UPLC ACQUITY? C8Column (2.1mmX IOOmmX 1.7 μ m, Waters,Milford, USA)。流動相為A:乙腈/水=60:40( IOmM甲酸銨);B:異丙醇/乙腈=90:1OlOmM甲酸銨)。梯度為:0-1.5min，保持 B% 為 32% ；1.5_3min，B% 從 32% 線性升至 45% ;3_llmin，B%從45%線性升至75% ; 11-11.5min,B%從75%線性升至97%,并保持2min ;之后0.1min內(nèi)，B%回到32%并后平衡1.5min。柱溫55°C。進(jìn)樣體積5 μ L。
[0015]質(zhì)譜條件為:ESI源正離子模式下,采用動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(dynamicMRM)實(shí)現(xiàn)對90對離子對(84個(gè)內(nèi)源性鞘脂和6個(gè)內(nèi)標(biāo))的同時(shí)檢測。得到的所有離子對的MRM提取離子色譜圖即為血漿鞘脂代謝輪廓譜。
[0016]質(zhì)譜米集數(shù)據(jù)用Masshunter Quantitative Analysis software (Agilent, SantaClara, CA, USA)導(dǎo)出，并用對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正，實(shí)現(xiàn)半定量分析。
[0017]鞘脂是一類豐度低但具有重要意義的脂質(zhì)，其含量的變化不僅能反應(yīng)人體正常情況下的生理狀況，同時(shí)也能反應(yīng)外界環(huán)境刺激和病變引起的變化。鞘脂的輪廓分析是一種表征鞘脂代謝的方法。采用MTBE/Me0H/H20雙相提取，并結(jié)合溫和堿性水解提取血漿鞘脂組，利用高分辨高靈敏度LC-MS/MS檢測，可以用40 μ L血漿快速實(shí)現(xiàn)對84種鞘脂的半定量分析，從而得到鞘脂的代謝輪廓信息。
[0018]本發(fā)明中所改進(jìn)的鞘脂提取方法相對于其他提取方法，操作更為簡單快速，溶劑毒性小，提取過程中不會引入蛋白干擾，重復(fù)性好。同時(shí)水解除去高豐度的甘油酯，降低離子抑制，提高檢測靈敏度。后續(xù)UHPLC-ES1-dynamic MRM檢測利用選擇性的MRM和高分辨的反相色譜(RPLC)可以快速實(shí)現(xiàn)對各個(gè)鞘脂分子的特異性檢測，區(qū)分異構(gòu)體?？梢悦獬惽手肿娱g的同位素校正，使定量的數(shù)據(jù)處理過程更為快速，準(zhǔn)確。綜上，本發(fā)明具有簡單快速、溶劑毒性低、靈敏度高、特異性好、重復(fù)性好、定量的數(shù)據(jù)處理簡單準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】[0019]圖1是正常人血漿中90個(gè)離子對(84種內(nèi)源性鞘脂和6種內(nèi)標(biāo))的dynamic MRM提取離子流色譜圖。(a)全視圖(b)y軸放大后的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明:本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0021]實(shí)施例1
[0022]取出-80°C低溫保存的正常人血漿冰浴下解凍，定量移取40yL并加入30 μ L內(nèi)標(biāo)混合溶液，潤旋混勻。內(nèi)標(biāo)液包括Ceramide (dl8:1/17:0) 0.42nmol/mL,SM (dl8:1/12:0) L 67nmol/mL, Sphingosine (dl7:1) 0.17nmol/mL, Lactosylceramide (dl8:1/12:0)0.17nmol/mL, Glucosylceramide(dl8:1/12:0)0.03nmol/mL, Dihydroceramide(d18:0/12:0)0.03nmol/mL。加入225 μ L甲醇和75 μ LlM甲醇鈉-甲醇溶液，渦旋30s。力口入ImLMTBE,渦旋30s。在37°C搖床上震蕩2h。取出后冷卻，加入20% (v/v)乙酸-水溶液25 μ L和超純水250 μ Lo渦旋30s。10°C下離心12000rpmX IOmin,定量移取上清800 μ L,冷凍干燥。用復(fù)溶液甲醇/異丙醇/水=65:30:5 (Me0H/IPA/H20=65:30:5)復(fù)溶至50 μ L，渦旋lmin，用于LC-MS/MS分析，檢測模式為ESI (+) -dynamic MRM,進(jìn)樣體積為5 μ L。15min內(nèi)可快速完成對84種內(nèi)源性鞘脂和6種內(nèi)標(biāo)的同時(shí)檢測。它們的提取離子流色譜圖如附圖1所示。
[0023]MRM 數(shù)據(jù)用 Masshunter Quantitative Analysis software(Agilent, SantaClara, CA, USA)導(dǎo)出，并用對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正，實(shí)現(xiàn)半定量分析。方法具有很好的重復(fù)性，日內(nèi)精密度92%以上的鞘脂RSD%〈10，日間精密度77%以上的鞘脂RSD%〈10。動態(tài)范圍寬，各亞類鞘脂的動態(tài)范圍達(dá)2.5-4數(shù)量級，R2均大于0.99。各亞類鞘脂的回收率為85.6%-95.6%。定量限均在0.625fmol/μ L血漿以下。附表I為該方法所涵蓋的84種鞘脂分子信息，MRM參數(shù)和精密度結(jié)果。
[0024]上述數(shù)據(jù)表明該方法可靠、穩(wěn)健、重復(fù)性好、靈敏度高、動態(tài)范圍寬。同時(shí)改進(jìn)后的鞘脂提取方法相比經(jīng)典方法更為操作簡單，毒性小，重現(xiàn)性好。
[0025]附表I
【權(quán)利要求】
1.基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的大規(guī)模血漿鞘脂輪廓分析方法，其特征在于: 第一步，將低溫保存的血漿冰浴下解凍，定量移取并加入內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻； 第二步，冰浴下加入甲醇和甲醇鈉-甲醇(MeONa-MeOH)溶液，渦旋；加入MTBE,渦旋； 第三步，置于搖床上震蕩； 第四步，取出后冷卻至室溫，加入乙酸水溶液和純水，渦旋； 第五步，高速離心后定量取出上清，冷凍干燥； 第六步，分析前用復(fù)溶液復(fù)溶，渦旋，用于超高效反相液相色譜-質(zhì)譜分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的大規(guī)模血漿鞘脂輪廓分析方法，其特征在于，第一步中，所用血漿體積為40 μ L，加入內(nèi)標(biāo)混合液30 μ L，內(nèi)標(biāo)包括:Ceramide (dl8:1/17: O) 0.42nmol/mL, SM (dl8:1/12: O) 1.67nmol/mL，Sphingosine(dl7:1)0.17nmol/mL, Lactosylceramide(dl8:1/12:0)0.17nmol/mL, Glucosylceramide(dl8:1/12:0)0.03nmol/mL, Dihydroceramide(dl8:0/12:0)0.03nmol/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的大規(guī)模血漿鞘脂輪廓分析方法，其特征在于，第二步中，加入甲醇225 μ L，IM MeONa-MeOH溶液75 μ L，渦旋30s ;加入MTBElmL，渦旋30s。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的大規(guī)模血漿鞘脂輪廓分析方法，其特征在于，第三步中，搖床溫度為37°C，時(shí)間為2h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的大規(guī)模血漿鞘脂輪廓分析方法，其特征在于，第四步中，加入20%(v/v)乙酸水溶液25 μ L，純水250 μ L，渦旋30s。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的大規(guī)模血漿鞘脂輪廓分析方法，其特征在于，第五步中，10°C下離心12000rpmX lOmin,定量移取上清800 μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的大規(guī)模血漿鞘脂輪廓分析方法，其特征在于，第六步中，復(fù)溶液為甲醇/異丙醇/水=65:30:5 (Me0H/IPA/H20=65:30:5, v/v/V)，復(fù)溶至50 μ L，渦旋Imin ;用于UHPLC-MS/MS分析的進(jìn)樣體積為5 μ L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的大規(guī)模血漿鞘脂輪廓分析方法，其特征在于，冰浴是指室溫下將盛有血漿的容器置于冰上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作；純水為18.2ΜΩ超純水。
【文檔編號】G01N30/02GK103884782SQ201210563413
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月21日
【發(fā)明者】許國旺, 李佳, 趙欣捷, 路鑫 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所