專利名稱：一種檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌引起豬的以纖維素性漿膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的傳染病。該病在全世界均有發(fā)生，通常見于5 8周齡的豬，發(fā)病率一般在10% 15%，嚴重時死亡率可達50%。近年來此病在規(guī)?；i場的感染率和所致的死亡率日益增高，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)較嚴重的細菌性疾病之一。副豬嗜血桿菌病是世界性分布的條件性疾病，許多豬場有該病的存在。近年來我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展很快，而飼養(yǎng)管理技術(shù)水平卻相對滯后，飼養(yǎng)環(huán)境條件惡劣，疫病日益復(fù)雜，豬群健康水平下降，大多處于亞健康狀態(tài)，這就為本病的發(fā)生與流行創(chuàng)造了條件。及時、準確地診斷出該病以便采取相應(yīng)的措施，是成功防制副豬嗜血桿菌病的關(guān)鍵。副豬嗜血桿菌的血清型眾多，有15個血清型，還有20%分離株無法分型，所以給副豬嗜血桿菌病的診斷帶了很大的困難，尤其是血清學(xué)診斷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子技術(shù)在細菌診斷領(lǐng)域廣泛的應(yīng)用，分子診斷在副豬嗜血桿菌的診斷中得到了廣泛的應(yīng)用，如基因限制性片段長度多態(tài)性分型(RFLP)技術(shù)(de Ia 2003 ；del Rio 2006等)、限制性內(nèi)切酶技術(shù)(ERP) (Smart 1988)、腸桿菌基因間保守重復(fù)序列(ERIC) (Rafiee 2000)、單基因座序列分型技術(shù)和多為點序列分型(MLST)(Olvera 2006)，由于這些診斷方法需要專業(yè)的設(shè)備和技術(shù)，所以在臨床上很難推廣應(yīng)用。Miniats (1991)等用副豬嗜血桿菌的煮沸物或超聲波破碎物致敏新鮮綿羊紅細胞建立了 IHA和用副豬嗜血桿菌的煮沸物或熱酚水透析物建立了 ELISA診斷方法；石碧(2007)等用副豬嗜血桿菌血清5型莢膜多糖建立了 IHA和ELISA診斷方法，檢測效果明顯優(yōu)于前者。IHA和ELISA是目前國內(nèi)外學(xué)者探索的主要副豬嗜血桿菌病抗體檢測方法，所不同的是抗原的制備方法不同。但是這些診斷方法均具有一定的局限性，全菌超破抗原成分復(fù)雜，缺乏特異性，莢膜多糖抗原抗原雖有很好的特異性，但只能檢測相應(yīng)的血清型的單一抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條及其制備方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)提供的診斷副豬嗜血桿菌的方法，需專業(yè)設(shè)備和技術(shù)，并且這些診斷方法應(yīng)用的局限性較大，無法滿足副豬嗜血桿菌診斷的最大化需求的問題。本發(fā)明的目的在于提供一種檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條，該試紙條包括PVC襯板、硝酸纖維素膜、吸收墊、金標墊、樣品墊，所述PVC襯板設(shè)置在最底部，同時PVC襯板上部中段設(shè)置有所述硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上部左端設(shè)置有所述吸收墊，所述硝酸纖維素膜上部右端設(shè)置有所述金標墊，所述金標墊上部右端設(shè)置有所述樣品墊。
進一步，所述硝酸纖維素膜左端噴有抗副豬嗜血桿菌IgG作為質(zhì)控線，所述硝酸纖維素膜右端噴有純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白作為檢測線，所述金標墊上噴有膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白。進一步，該試紙條可以檢測所有血清型的副豬嗜血桿菌感染產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條的制備方法，該制備方法包括以下步驟:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金；制備膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白；制備膠體金墊及含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜，組裝構(gòu)成試紙條。進一步，制備膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白的實現(xiàn)方法為:將制備的膠體金用0.lmol/L KC03調(diào)整pH值為7.0 7.8 ;用目測法確定膠體金與待標記蛋白應(yīng)標記的最佳量，得到最佳標記量為2.4mg/100ml,在膠體金溶液中按2.4mg/100ml加入純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白，靜置30min ；將膠體金經(jīng)2500r/min離心30min,除去沉淀物,得上清液；將上清液經(jīng)10000r/min離心30min，棄去上清收集沉淀物，將沉淀物懸浮于1/10倍初始膠體金體積的金膠緩沖液中，置4°C保存。進一步，所述金膠緩沖液為含5%。蔗糖、I % BSAU%o PEG20000、1%。Tween-20的磷酸鹽緩沖液，0.02mol/L、ρΗ7.4。進一步，制備含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的實現(xiàn)方法為:構(gòu)建重組原核表達載體Pet-30a_0ppA，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達OPPA重組蛋白，用N1-柱純化出His-OppA蛋白，用pH為7.2、0.15M的磷酸鹽緩沖液分別將純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白和抗副豬嗜血桿菌IgG濃度調(diào)至2.0g/Ι和1.4g/l工作濃度，分別按0.901/cm設(shè)置噴膜，將蛋白和抗體噴涂于硝酸纖維素膜上，形成檢測線與質(zhì)控線，37°C烘干或室溫自然干燥后，置于封閉液中浸泡lOmin，取出后室溫自然干燥，保存?zhèn)溆?。進一步，所述封閉液為含2.5 %犢牛血清，I %。Tween-20的磷酸鹽緩沖液，0.02mol/L、pH7.4。進一步，制備膠體金墊的實現(xiàn)方法為:取玻璃纖維紙，按301/cm將純化復(fù)性的Hi s-ΟρρΑ融合蛋白噴涂于玻璃纖維紙上，干燥后貯存?zhèn)溆?。進一步，組裝構(gòu)成試紙條的實現(xiàn)方法為:在PVC背襯板上由上至下分別將樣品墊、膠體金墊、包括檢測線及質(zhì)控線的硝酸纖維素膜、吸收墊按順序裝配，切割成4mm寬的條狀，即制成山羊接觸傳染性胸膜肺炎抗體檢測試紙條；其中，硝酸纖維素膜黏附于PVC襯板的底板上，長30mm ;硝酸纖維素膜上部左端黏附吸收墊，長25mm，并與硝酸纖維素膜重疊2mm ;金標墊長5mm，并且與硝酸纖維素膜重疊2mm ;樣品墊長20mm,并且與金標墊重疊2mm ;用切條機切割成4mm寬的條形帶,密封干燥保存。本發(fā)明提供的檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條及其制備方法，試紙條由PVC襯板、硝酸纖維素膜、吸收墊、金標墊及樣品墊，PVC襯板設(shè)置在最底部，同時PVC襯板上部中段設(shè)置有所述硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上部左端設(shè)置有吸收墊，硝酸纖維素膜上部右端設(shè)置有金標墊，金標墊上部右端設(shè)置有樣品墊，硝酸纖維素膜左端噴有抗副豬嗜血桿菌IgG作為質(zhì)控線，硝酸纖維素膜右端噴有純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白作為檢測線，金標墊上噴有膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白，該試紙條根據(jù)檢測線和質(zhì)控線是否出現(xiàn)色帶來確定血清中是否存在副豬嗜血桿菌病的抗體，并可檢測所有血清型的副豬嗜血桿菌感染產(chǎn)生的抗體，檢測過程簡便、快速、準確，實用性強，具有較強的推廣與應(yīng)用價值。


圖1是本發(fā)明實施例提供的檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明實施例提供的試紙條陰性結(jié)果的示意圖；圖3是本發(fā)明實施例提供的試紙條陽性結(jié)果的示意圖；圖4是本發(fā)明實施例提供的檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條的制備方法的實現(xiàn)流程圖。1、PVC襯板；2、硝酸纖維素膜；3、吸收墊；4、金標墊；5、樣品墊；6、質(zhì)控線；7、檢測線。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步的詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定發(fā)明。圖1示出了本發(fā)明實施例提供的檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條的結(jié)構(gòu)。為了便于說明，僅示出了與本發(fā)明相關(guān)的部分。該試紙條包括PVC襯板1、硝酸纖維素膜2、吸收墊3、金標墊4、樣品墊5，PVC襯板I設(shè)置在最底部，同時PVC襯板I上部中段設(shè)置有硝酸纖維素膜2，硝酸纖維素膜2上部左端設(shè)置有吸收墊3，硝酸纖維素膜2上部右端設(shè)置有金標墊4，金標墊4上部右端設(shè)置有樣品墊5。在本發(fā)明實施例中，硝酸纖維素膜2左端噴有抗副豬嗜血桿菌IgG作為質(zhì)控線6，硝酸纖維素膜2右端噴有純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白作為檢測線7，金標墊4上噴有膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白。在本發(fā)明實施例中，該試紙條可以檢測所有血清型的副豬嗜血桿菌感染產(chǎn)生的抗體。圖2是本發(fā)明實施例提供的試紙條陰性結(jié)果的示意圖，圖3是本發(fā)明實施例提供的試紙條陽性結(jié)果的示意圖。圖4示出了本發(fā)明實施例提供的檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條的制備方法的實現(xiàn)流程。該制備方法包括以下步驟在步驟S401中，采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金；在步驟S402中，制備膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白；在步驟S403中，制備膠體金墊及含有檢測線7和質(zhì)控線6的硝酸纖維素膜2，組裝構(gòu)成試紙條。在本發(fā)明實施例中，制備膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白的實現(xiàn)方法為:將制備的膠體金用0.lmol/L KC03調(diào)整pH值為7.0 7.8 ;用目測法確定膠體金與待標記蛋白應(yīng)標記的最佳量，得到最佳標記量為
2.4mg/100ml,在膠體金溶液中按2.4mg/100ml加入純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白，靜置30min ；將膠體金經(jīng)2500r/min離心30min，除去沉淀物，得上清液；將上清液經(jīng)10000r/min離心30min，棄去上清收集沉淀物，將沉淀物懸浮于1/10倍初始膠體金體積的金膠緩沖液中，置4°C保存。在本發(fā)明實施例中，金膠緩沖液為含5 %。蔗糖、I % BSA、I %。PEG20000、1% Tween-20 的磷酸鹽緩沖液，0.02mol/L、ρΗ7.4。在本發(fā)明實施例中，制備含有檢測線7和質(zhì)控線6的硝酸纖維素膜2的實現(xiàn)方法為:構(gòu)建重組原核表達載體Pet-30a_0ppA，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達OPPA重組蛋白，用N1-柱純化出His-OppA蛋白，用pH為7.2、0.15M的磷酸鹽緩沖液分別將純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白和抗副豬嗜血桿菌IgG濃度調(diào)至2.0g/Ι和1.4g/l工作濃度，分別按0.901/cm設(shè)置噴膜，將蛋白和抗體噴涂于硝酸纖維素膜2上，形成檢測線7與質(zhì)控線6，37°C烘干或室溫自然干燥后，置于封閉液中浸泡lOmin，取出后室溫自然干燥，保存?zhèn)溆?。在本發(fā)明實施例中，封閉液為含2.5%犢牛血清，1%0 Tween-20的磷酸鹽緩沖液，
0.02mol/L、pH7.4。在本發(fā)明實施例中，制備膠體金墊的實現(xiàn)方法為:取玻璃纖維紙，按301/cm將純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白噴涂于玻璃纖維紙上，干燥后貯存?zhèn)溆谩Ｔ诒景l(fā)明實施例中，組裝構(gòu)成試紙條的實現(xiàn)方法為:在PVC背襯板上由上至下分別將樣品墊5、膠體金墊、包括檢測線7及質(zhì)控線6的硝酸纖維素膜2、吸收墊3按順序裝配，切割成4mm寬的條狀，即制成山羊接觸傳染性胸膜肺炎抗體檢測試紙條；其中，硝酸纖維素膜2黏附于PVC襯板I的底板上，長30mm ;硝酸纖維素膜2上部左端黏附吸收墊3,長25mm,并與硝酸纖維素膜2重疊2mm ;金標墊4長5mm,并且與硝酸纖維素膜2重疊2mm ;樣品墊5長20mm,并且與金標墊4重疊2mm ;用切條機切割成4mm寬的條形帶，密封干燥保存。下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步描述。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種膠體金免疫層法檢測副豬嗜血病抗體的試紙條及制備方法，包括副豬嗜血桿菌寡肽透明質(zhì)酸酶ABC轉(zhuǎn)運蛋白OppA體外表達、分離純化和膠體金免疫層析法檢測副豬嗜血桿菌15個血清抗體的試紙條，構(gòu)建重組原核表達載體pET-30a-0ppA，在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達OPPA重組蛋白，用N1-柱純化His-OppA融合蛋白，用不同濃度的尿素復(fù)性His-OppA融合蛋白。將純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白和抗副豬嗜血桿菌IgG噴在硝酸纖維膜上，分別作為檢測線7 (T線)和質(zhì)控線6 (C線)。將膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白噴在玻璃纖維上制成金標墊4，從而組裝成膠體金試紙條。根據(jù)檢測線7和質(zhì)控線6是否出現(xiàn)色帶來確定血清中是否存在副豬嗜血桿菌病的抗體。用本發(fā)明的試紙條檢測，簡便、快速、準確，適用于基層。本發(fā)明的技術(shù)問題通過下述技術(shù)方案解決一種膠體金免疫層析法檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條及其制備方法，包括副豬嗜血桿菌寡聚透明質(zhì)酸酶轉(zhuǎn)運蛋白OppA體外表達、分離純化和膠體金免疫層析方檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條,其特征是構(gòu)建重組原核表達載體Pet-30a-0ppA，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達OPPA重組蛋白，用N1-柱純化出His-OppA蛋白，將純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白和抗副豬嗜血桿菌IgG點樣于硝酸纖維膜上，分別作為檢測線7 (T線)和質(zhì)控線6 (C線)，將膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白吸附于玻璃纖維制成金標墊4。一種膠體金免疫層析法檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條及其制備方法，PCR法從副豬嗜血桿菌基因組DNA中成功擴增出oppA全長基因，構(gòu)建了 oppA原核表達載體，重組蛋白主要以不溶性包涵體在大腸桿菌中表達，表達的重組蛋白能與副豬嗜血桿菌15個標準菌株陽性血清發(fā)生反應(yīng)；經(jīng)尿素變性和復(fù)性后，用N1-柱純化法獲得單一的His-OppA融合蛋白條帶，純化的重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性，用純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白作為抗原包被硝酸纖維膜，建立了檢測副豬嗜血桿菌血清抗體的膠體金免疫層析法。一種膠體金免疫層析法檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條，由PVC襯板1、硝酸纖維素膜2、吸收墊3、金標墊4、樣品墊5部分組成，硝酸纖維素膜2左端噴有抗副豬嗜血桿菌IgG作為質(zhì)控線6，右端噴有純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白作為檢測線7 ;金標墊4上噴有膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白。金標墊4上噴的膠體金標記的OppA抗原蛋白為純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白，檢測線7噴有的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白，試紙條可以檢測所有血清型的副豬嗜血桿菌感染產(chǎn)生的抗體。一種膠體金免疫層析法檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條，由以下步驟制備而成a、膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金；b、膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白首先將a步制備的膠體金用
O.lmol/L KC03調(diào)整pH值為7. O 7. 8 ;然后用目測法確定膠體金與待標記蛋白應(yīng)標記的最佳量，得到最佳標記量為2. 4mg/100ml，在膠體金溶液中按2. 4mg/100ml加入純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白，靜置30min ;將上述膠體金經(jīng)2500r/min離心30min,除去沉淀物,得上清液；將上清液經(jīng)10000r/min離心30min，棄去上清收集沉淀物，將沉淀物懸浮于1/10倍初始膠體金體積的金膠緩沖液中，置4°C保存；C、組裝抗體檢測試紙條步驟I)硝酸纖維素膜2黏附于PVC襯板I底板上，長30mm ；2)黏附吸收墊3，長25臟，并與硝酸纖維素膜2重疊2mm ;3) 5mm長的金標墊4與硝酸纖維素膜2重疊2mm ；4)樣品墊5長20mm與金標墊4重疊2mm ；5)用切條機切割成4_寬的條形帶，密封干燥保存。如圖1所示，一種檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條由五個部分組成PVC襯板1、硝酸纖維素膜2、吸收墊3、金標墊4、樣品墊5，PVC襯板I設(shè)在最底部，PVC襯板I上部中段設(shè)有硝酸纖維素膜2，硝酸纖維素膜2上部左端貼有吸收墊3，硝酸纖維素膜2上部右端設(shè)有金標墊4，金標墊4的上部右端設(shè)有樣品墊5。該試紙條的制備按如下操作:膠體金的制備:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金；膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白:首先將制備的膠體金用0.lmol/LKC03調(diào)整pH值為7.0 7.8 ;然后用目測法確定膠體金與待標記蛋白應(yīng)標記的最佳量，得到最佳標記量為2.4mg/100ml，在膠體金溶液中按2.4mg/100ml加入純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白，靜置30min ;將上述膠體金經(jīng)2500r/min離心30min,除去沉淀物,得上清液；將上清液經(jīng)10000r/min離心30min，棄去上清收集沉淀物，將沉淀物懸浮于1/10倍初始膠體金體積的金膠緩沖液中，置4°C保存；試紙條的組裝:制備含有檢測線7和質(zhì)控線6的硝酸纖維素膜2:用0.15M的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)分別將純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白和抗副豬嗜血桿菌IgG濃度調(diào)至2.0g/Ι和1.4g/l工作濃度，分別按0.901/cm設(shè)置噴膜，將上述蛋白和抗體噴涂于硝酸纖維素膜2上，形成質(zhì)檢測線7與控線，37°C烘干或室溫自然干燥后，置于封閉液中浸泡lOmin，取出后室溫自然干燥，保存?zhèn)溆?；制備膠體金墊:取玻璃纖維紙，按301/cm將純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白噴涂于玻璃纖維紙上，干燥后貯存?zhèn)溆茫辉嚰垪l的組裝:在PVC背襯板上由上至下分別將樣品墊5、膠體金墊，包括檢測線
7、質(zhì)控線6的硝酸纖維素膜2以及吸收墊3按順序裝配，切割成4_寬的條狀，即制成山羊接觸傳染性胸膜肺炎抗體檢測試紙條。金膠緩沖液為含5%。蔗糖、I % BSAU%o PEG20000、1%。Tween-20的磷酸鹽緩沖液(0.02mol/L、pH7.4)。封閉液為含2.5%犢牛血清，1% Tween-20的磷酸鹽緩沖液(0.02mol/L、ρΗ7.4)。本發(fā)明實施例提供的檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條的制備方法，試紙條由PVC襯板1、硝酸纖維素膜2、吸收墊3、金標墊4及樣品墊5，PVC襯板I設(shè)置在最底部，同時PVC襯板I上部中段設(shè)置有硝酸纖維素膜2，硝酸纖維素膜2上部左端設(shè)置有吸收墊3，硝酸纖維素膜2上部右端設(shè)置有金標墊4，金標墊4上部右端設(shè)置有樣品墊5，硝酸纖維素膜2左端噴有抗副豬嗜血桿菌IgG作為質(zhì)控線6，硝酸纖維素膜2右端噴有純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白作為檢測線7，金標墊4上噴有膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白，該試紙條根據(jù)檢測線7和質(zhì)控線6是否出現(xiàn)色帶來確定血清中是否存在副豬嗜血桿菌病的抗體，并可檢測所有血清型的副豬嗜血桿菌感染產(chǎn)生的抗體，檢測過程簡便、快速、準確，實用性強，具有較強的推廣與應(yīng)用價值。以上僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條，其特征在于，該試紙條包括:PVC襯板、硝酸纖維素膜、吸收墊、金標墊、樣品墊，所述PVC襯板設(shè)置在最底部，同時PVC襯板上部中段設(shè)置有所述硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上部左端設(shè)置有所述吸收墊，所述硝酸纖維素膜上部右端設(shè)置有所述金標墊，所述金標墊上部右端設(shè)置有所述樣品墊。
2.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述硝酸纖維素膜左端噴有抗副豬嗜血桿菌IgG作為質(zhì)控線，所述硝酸纖維素膜右端噴有純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白作為檢測線，所述金標墊上噴有膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，該試紙條可以檢測所有血清型的副豬嗜血桿菌感染產(chǎn)生的抗體。
4.一種檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下步驟: 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金； 制備膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白； 制備膠體金墊及含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜，組裝構(gòu)成試紙條。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，制備膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白的實現(xiàn)方法為: 將制備的膠體金用0.lmol/L KC03調(diào)整pH值為7.0 7.8 ; 用目測法確定膠體金與待標記蛋白應(yīng)標記的最佳量，得到最佳標記量為2.4mg/100ml,在膠體金溶液中按2.4mg/100ml加入純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白，靜置30min ； 將膠體金經(jīng)2500r/min離心30min,除去沉淀物,得上清液； 將上清液經(jīng)10000r/min離心30min，棄去上清收集沉淀物，將沉淀物懸浮于1/10倍初始膠體金體積的金膠緩沖液中，置4°C保存。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述金膠緩沖液為含5%。蔗糖、I% BSA、1% PEG20000、1%。Tween-20 的磷酸鹽緩沖液，0.02mol/L、pH7.4。
7.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，制備含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的實現(xiàn)方法為: 構(gòu)建重組原核表達載體Pet-30a-0ppA，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達OPPA重組蛋白，用N1-柱純化出His-OppA蛋白，用pH為7.2、0.15M的磷酸鹽緩沖液分別將純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白和抗副豬嗜血桿菌IgG濃度調(diào)至2.0g/Ι和1.4g/l工作濃度，分別按0.901/cm設(shè)置噴膜，將蛋白和抗體噴涂于硝酸纖維素膜上，形成檢測線與質(zhì)控線，37°C烘干或室溫自然干燥后，置于封閉液中浸泡lOmin，取出后室溫自然干燥，保存?zhèn)溆谩?br> 8.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述封閉液為含2.5%犢牛血清，1% Tween-20 的磷酸鹽緩沖液，0.02mol/L、pH7.4。
9.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，制備膠體金墊的實現(xiàn)方法為:取玻璃纖維紙，按301/cm將純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白噴涂于玻璃纖維紙上，干燥后貯存?zhèn)溆谩?br> 10.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，組裝構(gòu)成試紙條的實現(xiàn)方法為: 在PVC背襯板上由上至下分別將樣品墊、膠體金墊、包括檢測線及質(zhì)控線的硝酸纖維素膜、吸收墊按順序裝配，切割成4mm寬的條狀，即制成山羊接觸傳染性胸膜肺炎抗體檢測試紙條；其中，硝酸纖維素膜黏附于PVC襯板的底板上，長30mm ;硝酸纖維素膜上部左端黏附吸收墊，長25臟，并與硝酸纖維素膜重疊2mm ;金標墊長5臟，并且與硝酸纖維素膜重疊2mm ；樣品墊長20mm， 并且與金標墊重疊2mm ;用切條機切割成4mm寬的條形帶，密封干燥保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測副豬嗜血桿菌病抗體的試紙條及其制備方法，試紙條由PVC襯板、硝酸纖維素膜、吸收墊、金標墊及樣品墊，PVC襯板設(shè)置在最底部，同時PVC襯板上部中段設(shè)置有硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上部左端設(shè)置有吸收墊，硝酸纖維素膜上部右端設(shè)置有金標墊，金標墊上部右端設(shè)置有樣品墊，硝酸纖維素膜左端噴有抗副豬嗜血桿菌IgG作為質(zhì)控線，硝酸纖維素膜右端噴有純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白作為檢測線，金標墊上噴有膠體金標記的純化復(fù)性的His-OppA融合蛋白，該試紙條根據(jù)檢測線和質(zhì)控線是否出現(xiàn)色帶來確定血清中是否存在副豬嗜血桿菌病的抗體，可檢測所有血清型副豬嗜血桿菌感染產(chǎn)生的抗體，檢測簡便、快速。
文檔編號G01N33/544GK103076450SQ201210571988
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月15日
發(fā)明者逯忠新, 高鵬程, 儲岳峰, 趙萍, 賀英 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所