專利名稱：一種腎綜合征出血熱病毒IgM抗體檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腎綜合征出血熱病毒IgM抗體檢 測(cè)方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
腎綜合征出血熱(Hemorrhagicfever with renal syndrome,以下簡(jiǎn)稱HFRS),我 國(guó)習(xí)稱流行性出血熱(Epidemic hemorrhagic fever, EHF),是由漢坦病毒(Hantavirus, HV)引起的以發(fā)熱、出血、腎臟損害為主要臨床特征的自然疫源傳染病，鼠為主要的傳染源， 寄生螨類參與傳播,主要通過接觸宿主動(dòng)物排泄物經(jīng)傷口、氣溶膠、飲食傳播。其臨床表現(xiàn) 復(fù)雜，預(yù)后差。
對(duì)HFRS的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有常規(guī)檢查、超聲檢查、基因檢測(cè)、病毒分離鑒定 與血清學(xué)檢測(cè)等。目前臨床主要依據(jù)患者的癥狀、體征及血、尿常規(guī)作診斷，這對(duì)一些典型 病人尚可，而一旦遇到不典型的病人，診斷就比較困難，常造成誤診或遺漏，不僅使病人在 經(jīng)濟(jì)上蒙受不應(yīng)有的損失，甚至喪失最佳搶救治療的時(shí)機(jī)，導(dǎo)致病人死亡，因此，早期診斷 尤為重要。超聲檢查HFRS對(duì)儀器與技術(shù)要求較高。基因檢測(cè)多采用反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR) 技術(shù)，但由于HFRS病程早期病毒載量較小,故在臨床標(biāo)本的檢測(cè)方面還不夠穩(wěn)定。病毒分 離鑒定法所需周期較長(zhǎng)且需要特殊設(shè)備。
血清學(xué)檢測(cè)方法是HFRS早期檢測(cè)的一種主要手段，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)、間接免疫突光法(IFA)等，ELISA 檢出率 高，敏感度和特異性都較好，但大都需要特殊設(shè)備，操作人員需要專門的操作技能，一次測(cè) 試從采樣到孵育、洗板、顯色需要很長(zhǎng)的時(shí)間，浪費(fèi)大量人力物力，難以在缺少設(shè)備的邊遠(yuǎn) 山區(qū)、基層醫(yī)院、診所開展。間接免疫熒光法需要熒光顯微鏡等設(shè)備，在基層也受到一定限 制。
流行性出血熱起病后2 3天血清中可檢測(cè)出流行性出血熱IgM抗體，7 10天 達(dá)高峰。而流行性出血熱IgG抗體在病后數(shù)周出現(xiàn)，可持續(xù)多年，因此，IgM抗體陽(yáng)性可對(duì) 該疾病進(jìn)行早期診斷。目前較為簡(jiǎn)便快捷的血清學(xué)檢測(cè)主要是采用膠體金斑點(diǎn)滲濾法檢 測(cè)HFRS-1gM抗體，其原理為液體通過微孔濾膜時(shí)，標(biāo)本中的抗體與膜上的抗原相接觸并 結(jié)合，再加入金標(biāo)記的抗人抗體顯色，達(dá)到快速檢測(cè)的目的(一般在3 5min左右完成)，同 時(shí)洗滌液的滲入在短時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到洗滌目的，成為“床邊檢驗(yàn)”主要方法之一。該方法以 操作簡(jiǎn)單便捷、檢測(cè)速度快、節(jié)省人力物力為特點(diǎn)，使得臨床檢驗(yàn)甚至可以在床邊進(jìn)行，不 需任何儀器、設(shè)備及復(fù)雜的樣本處理過程，結(jié)果立即可取，真正做到了床邊檢驗(yàn)(Point of Care Test，P0CT)，減輕了操作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度。但目前膠體金斑點(diǎn)滲濾試劑的金標(biāo)液保存 期較短，容易受外界溫度等因素影響而發(fā)生沉淀等現(xiàn)象，某些診斷試劑盒的保存緩沖液出 于商業(yè)原因等并未給出具體組分，給試劑盒的開發(fā)應(yīng)用帶來不便。另外，由于試劑盒洗滌液 或樣本方面的原因，例如溶血、高血脂、高膽紅素等，本底會(huì)發(fā)紅，影響結(jié)果判讀，尤其是對(duì) 于弱陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的判讀。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種適用于臨床輔助診斷和鑒別的腎綜合征出血熱病毒IgM抗體檢測(cè)方法及試劑盒，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的金標(biāo)液保存期較短，容易受外界溫度等因素影響而發(fā)生沉淀現(xiàn)象等問題。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是
一種腎綜合征出血熱病毒IgM抗體的檢測(cè)方法，在膜上固定腎綜合征出血熱病毒抗原，加入待檢血清，待檢血清中的腎綜合征出血熱病毒IgM抗體和所述固定在膜上的抗原結(jié)合，再加入含有鼠抗人IgM單抗的金標(biāo)工作液，鼠抗人IgM單抗與待檢血清中的腎綜合征出血熱病毒IgM抗體結(jié)合，顯示出紅色，最后加入洗滌液，洗去多余的金標(biāo)工作液和其他雜質(zhì)；
所述金標(biāo)工作液采用如下方法制得
⑴制備金標(biāo)濃縮液取O. 5 1%的氯金酸水溶液100ml，加熱至沸騰，加入O. 4 O. 8被％檸檬酸三鈉溶液O. 8 1ml，混勻，待溶液顏色由淡黃至藍(lán)色至紫色至完全透明的酒紅色，繼續(xù)煮沸5 15分鐘，停止加熱，冷卻至室溫，向得到的溶液中加入lmg/ml的鼠抗人 IgM單抗O. 2 O. 5ml，然后將混合溶液進(jìn)行離心處理，棄去上清液，得到下層金標(biāo)濃縮液；
⑵制備稀釋液將121.1 242. 2mg的三羥甲基氨基甲烷、O.1 O. 2mg的氯化鈉和O. 5 O. 7mg的牛血清白蛋白置于容量瓶?jī)?nèi)，加入雙蒸水，使之完全溶解，然后繼續(xù)加入雙蒸水至IOOmL,再加入O. 04 (λ 07wt%診斷試劑防腐劑PR0CLIN300，然后依次加入I 2wt%海藻糖、2ml甘油、O. 03 O. 05wt%黃原膠與O. 8 2. 0wt%的羧甲基殼聚糖，再加入 O. 5ml水楊酸異辛酯一并混勻，最后用鹽酸將其pH調(diào)節(jié)至7. O 7. 5，得到所述稀釋液；
⑶將所述金標(biāo)濃縮液與稀釋液按1: 15 30的體積比混合，得到金標(biāo)工作液；
所述洗滌液，包括三羥甲基氨基甲烷、氯化鈉和牛血清白蛋白，并采用如下方法制得將121.1mg 242. 2mg的三輕甲基氨基甲燒、O.1mg Img的氯化鈉和O.1mg Img的牛血清白蛋白置于容量瓶?jī)?nèi)，加入雙蒸水，使之完全溶解，然后繼續(xù)加入雙蒸水至IOOmL,加入 O.1 O. 2wt%的EDTA，然后再加入體積比為1. 5 2. 0%的丙醇，混勻后加入O. 8 1. 5wt% 的二氯醋酸及O. 2 O. 4wt%的TritonX-100，最后再用氫氧化鈉溶液將其pH調(diào)節(jié)為8. 5 9.0，得到洗滌液。
優(yōu)選的，所述包被膜為硝酸纖維素膜。
優(yōu)選的，所述稀釋液和洗滌液瓶置于2 8°C下保存。
優(yōu)選的，所述金標(biāo)工作液由所述金標(biāo)濃縮液與稀釋液按1:20的體積比混合得到。
一種腎綜合征出血熱病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒，包括檢測(cè)盒、按照權(quán)利要求1所述方法制備的金標(biāo)工作液和洗滌液，所述檢測(cè)盒內(nèi)設(shè)有包被膜，`所述包被膜上設(shè)有檢測(cè)點(diǎn)和質(zhì)控點(diǎn)，所述檢測(cè)點(diǎn)包被有固相腎綜合征出血熱抗原，所述質(zhì)控點(diǎn)包被有羊抗鼠抗體。
優(yōu)選的，所述腎綜合征出血熱抗原包被量為O. 2mg/ml的腎綜合征出血熱抗原 O. 5 μ I,所述羊抗鼠抗體包被量為2mg/ml的羊抗鼠抗體O. 5 μ I。
優(yōu)選的，所述包被膜為硝酸纖維素膜。
優(yōu)選的，所述檢測(cè)盒放置在濕度小于40%的環(huán)境下干燥2小時(shí)后，放置在鋁箔袋內(nèi)封口保存。
采用上述技術(shù)方案后，本發(fā)明的有益效果是
(I)由于改善了金標(biāo)工作液配方，通過添加糖類與甘油組合物，減少了溫度等環(huán)境變化對(duì)金標(biāo)溶液體系穩(wěn)定性的影響，同時(shí)由于紫外線吸收劑水楊酸異辛酯的加入，避免了過度光照引起的金標(biāo)物聚集，從而延長(zhǎng)了金標(biāo)液以及整個(gè)試劑盒的保質(zhì)期，試驗(yàn)證明此發(fā)明所述金標(biāo)工作液可穩(wěn)定16個(gè)月之久；
(2)通過添加對(duì)于血紅素助溶及洗滌作用的物質(zhì)，減少或消除了因標(biāo)本(例如溶血標(biāo)本、高膽紅素標(biāo)本)或試劑原因出現(xiàn)的底色發(fā)紅的現(xiàn)象，提高了檢測(cè)的靈敏度，尤其是避免了對(duì)弱陽(yáng)性樣本的漏檢。
本發(fā)明試劑盒具有保質(zhì)期較長(zhǎng)、交叉反應(yīng)少、顯色性能較優(yōu)的特點(diǎn)，使用方法簡(jiǎn)單便捷、檢測(cè)速度快，臨床檢驗(yàn)不需任何儀器，避免了實(shí)驗(yàn)過程中各種因素對(duì)結(jié)果的影響以及減輕了操作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度；可滿足醫(yī)院診所及衛(wèi)生檢疫部門的臨床需求，也可用于大專院校和科研機(jī)構(gòu)的疾病診斷研究。具體實(shí)施例
實(shí)施例1
金標(biāo)工作液的配制
1、原料氯金酸、檸檬酸三鈉，鼠抗人IgM單抗，鹽酸、碳酸鉀、三羥甲基氨基甲烷、 海藻糖、氯化鈉、甘油，牛血清白蛋白，PR0CLIN300，水楊酸異辛酯、黃原膠、PEG20000，羧甲基殼聚糖。
2、儀器設(shè)備容量瓶；磁力攪拌器；萬(wàn)分之一電子天平；冰箱；離心機(jī)。
3、配制步驟
(I)制備金標(biāo)濃縮液取lwt%的氯金酸水溶液100ml，加熱至沸騰，加入O. 5 丨％檸檬酸三鈉溶液O. 8ml，迅速混勻，待溶液顏色由淡黃至藍(lán)色至紫色至完全透明的酒紅色，繼續(xù)煮沸10分鐘，停止加熱，冷卻至室溫；
向得到的溶液中加入lmg/ml的鼠抗人IgM單抗O. 3ml，然后將混合溶液進(jìn)行離心處理，棄去上清液，得到下層金標(biāo)濃縮液，備用；
(2)制備稀釋液將121.1mg的三羥甲基氨基甲烷、O.1mg的氯化鈉和O. 5mg的牛血清白蛋白置于容量瓶?jī)?nèi)，加入雙蒸水，輕搖使之完全溶解，然后繼續(xù)加入雙蒸水至IOOmL, 再加入O. 06wt%PR0CLIN300診斷試劑防腐劑，然后依次加入2 丨％海藻糖、2ml甘油、O. 03wt% 黃原膠與lwt%的羧甲基殼聚糖,再加入O. 5ml水楊酸異辛酯與并混勻,最后用鹽酸將其pH 調(diào)節(jié)至7. 4，在2 8°C下保存，備用；
(3)將金標(biāo)濃縮液與稀釋液按1:20的體積比混合，得到金標(biāo)工作液。
對(duì)比例I配制方法
(I)制備金標(biāo)濃縮液 取1%的氯金酸水溶液100ml，加熱至沸騰，加入O. 5%檸檬酸三鈉溶液O. 8ml，迅速混勻，待溶液顏色由淡黃至藍(lán)色至紫色至完全透明的酒紅色，繼續(xù)煮沸10分鐘，停止加熱，冷卻至室溫；向得到的溶液中加入lmg/ml的鼠抗人IgM單抗O. 3ml, 然后將混合溶液進(jìn)行離心處理，棄去上清液，得到下層金標(biāo)濃縮液，備用；
(2)制備稀釋液將121.1mg的三羥甲基氨基甲烷、O.1mg的氯化鈉和O. 5mg的牛血清白蛋白置于容量瓶?jī)?nèi)，加入雙蒸水，輕搖使之完全溶解，然后繼續(xù)加入雙蒸水至IOOmL,最后用鹽酸將其PH調(diào)節(jié)至7. 4，即為金標(biāo)稀釋液。在2 8°C下保存，備用；
(3)將稀釋液與金標(biāo)濃縮液按20 1的體積比混合，得到金標(biāo)工作液。
對(duì)比例2配制方法方法同對(duì)比例1，僅在稀釋液制備步驟中另外添加O. 1%的 PEG20000。
4、驗(yàn)證金標(biāo)工作液配方的穩(wěn)定性及有效性
將加有穩(wěn)定劑的金標(biāo)工作液與對(duì)比工作液置于室溫保存條件下，前期隔月進(jìn)行檢測(cè)，后期每月進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)，觀察金標(biāo)工作液的物理狀態(tài)，并在硝酸纖維素膜上包被 HFRS抗原(檢測(cè)點(diǎn))與羊抗鼠抗體(質(zhì)控點(diǎn))，利用強(qiáng)陽(yáng)性、中陽(yáng)性、弱陽(yáng)性質(zhì)控品(各10份) 檢驗(yàn)顯色性能。檢驗(yàn)結(jié)果如下
表I金標(biāo)工作液物理狀態(tài)穩(wěn)定性結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種腎綜合征出血熱病毒IgM抗體檢測(cè)方法，在膜上固定腎綜合征出血熱病毒抗原，加入待檢血清，待檢血清中的腎綜合征出血熱病毒IgM抗體和所述固定在膜上的抗原結(jié)合，再加入含有鼠抗人IgM單抗的金標(biāo)工作液，鼠抗人IgM單抗與待檢血清中的腎綜合征出血熱病毒IgM抗體結(jié)合，顯示出紅色，最后加入洗滌液，洗去多余的金標(biāo)工作液和其他雜質(zhì)，其特征在于 所述金標(biāo)工作液采用如下方法制得 ⑴制備金標(biāo)濃縮液取0. 5 lwt%的氯金酸水溶液100ml，加熱至沸騰，加入0. 4 0.8被％檸檬酸三鈉溶液0. 8 1ml，混勻，待溶液顏色由淡黃至藍(lán)色至紫色至完全透明的酒紅色，繼續(xù)煮沸5 15分鐘，停止加熱，冷卻至室溫，向得到的溶液中加入lmg/ml的鼠抗人IgM單抗0. 2 0. 5ml，然后將混合溶液進(jìn)行離心處理，棄去上清液，得到下層金標(biāo)濃縮液； ⑵制備稀釋液將121.1 242. 2mg的三羥甲基氨基甲烷、0.1 0. 2mg的氯化鈉和0.5 0. 7mg的牛血清白蛋白置于容量瓶?jī)?nèi)，加入雙蒸水，使之完全溶解，然后繼續(xù)加入雙蒸水至IOOmL,再加入0. 04 0. 07wt9Uf斷試劑防腐劑PR0CLIN300，然后依次加入I 2wt%海藻糖、2ml甘油、0. 03 0. 05wt%黃原膠與0. 8 2. 0wt%的羧甲基殼聚糖，再加入0. 5ml水楊酸異辛酯一并混勻，最后用鹽酸將其PH調(diào)節(jié)至7. 0 7. 5，得到所述稀釋液； ⑶將所述金標(biāo)濃縮液與稀釋液按1: 15 30的體積比混合，得到金標(biāo)工作液； 所述洗滌液，包括三羥甲基氨基甲烷、氯化鈉和牛血清白蛋白，并采用如下方法制得將121.1mg 242. 2mg的三輕甲基氨基甲燒、0.1mg Img的氯化鈉和0.1mg Img的牛血清白蛋白置于容量瓶?jī)?nèi)，加入雙蒸水，使之完全溶解，然后繼續(xù)加入雙蒸水至IOOmL,加入0.1 0. 2wt%的EDTA，然后再加入體積比為1. 5 2. 0%的丙醇，混勻后加入0. 8 1. 5wt%的二氯醋酸及0. 2 0. 4wt%的TritonX-100，最后再用氫氧化鈉溶液將其pH調(diào)節(jié)為8. 5 9.0，得到洗滌液。
2.如權(quán)利要求1所述的一種腎綜合征出血熱病毒IgM抗體檢測(cè)方法，其特征在于所述膜為硝酸纖維素膜。
3.如權(quán)利要求1所述的一種腎綜合征出血熱病毒IgM抗體檢測(cè)方法，其特征在于所述稀釋液和洗滌液置于2 8°C下保存。
4.如權(quán)利要求1所述的一種腎綜合征出血熱病毒IgM抗體檢測(cè)方法，其特征在于所述金標(biāo)工作液由所述金標(biāo)濃縮液與稀釋液按1:20的體積比混合得到。
5.一種腎綜合征出血熱病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括檢測(cè)盒、按照權(quán)利要求I所述方法制備的金標(biāo)工作液和洗滌液，所述檢測(cè)盒內(nèi)設(shè)有包被膜，所述包被膜上設(shè)有檢測(cè)點(diǎn)和質(zhì)控點(diǎn)，所述檢測(cè)點(diǎn)包被有固相腎綜合征出血熱抗原，所述質(zhì)控點(diǎn)包被有羊抗鼠抗體。
6.如權(quán)利要求5所述的一種腎綜合征出血熱病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述腎綜合征出血熱抗原包被量為0. 2mg/ml的腎綜合征出血熱抗原0. 5iU，所述羊抗鼠抗體包被量為2mg/ml的羊抗鼠抗體0. 5 ii I。
7.如權(quán)利要求5所述的一種腎綜合征出血熱病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述包被膜為硝酸纖維素膜。
8.如權(quán)利要求5所述的一種腎綜合征出血熱病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)盒放置在濕度小于40%的環(huán)境下干燥2小時(shí)后，放置在鋁箔袋內(nèi)封口保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腎綜合征出血熱病毒IgM抗體檢測(cè)檢測(cè)方法及試劑盒，在膜上固定腎綜合征出血熱病毒抗原，加入待檢血清，待檢血清中的腎綜合征出血熱病毒IgM抗體和所述固定在膜上的抗原結(jié)合，再加入含有鼠抗人IgM單抗的金標(biāo)工作液，鼠抗人IgM單抗與待檢血清中的腎綜合征出血熱抗體結(jié)合，顯示出紅色，最后加入洗滌液，洗去多余的金標(biāo)工作液和其他雜質(zhì)。本發(fā)明本發(fā)明試劑盒具有保質(zhì)期較長(zhǎng)、交叉反應(yīng)少、顯色性能較優(yōu)等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/532GK103033616SQ20121057257
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者楊致亭, 楊金紅, 王秀利, 武新清, 孫洪芝, 劉迎軍, 袁忠群, 王德亞 申請(qǐng)人:濰坊市康華生物技術(shù)有限公司