專利名稱：一種Th細(xì)胞表面及胞內(nèi)染色的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種Th細(xì)胞表面及胞內(nèi)染色的方法及其應(yīng)用，屬于內(nèi)分泌技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自身免疫性甲狀腺病(autoimmune thyroid disease, AITD)為器官特異性自身免疫性疾病，以對(duì)甲狀腺抗原自我耐受被破壞為特征。橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’ sthyix)idtiS，HT)與Graves病(⑶)均屬于典型的自身免疫性甲狀腺疾病，甲狀腺中均有多量淋巴細(xì)胞以及漿細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，以HT淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)最為廣泛。目前普遍認(rèn)為，HT是由于抑制性T淋巴細(xì)胞功能降低，輔助性T淋巴細(xì)胞作用增強(qiáng)，使B淋巴細(xì)胞分化產(chǎn)生大量抗甲狀腺抗體，其中最常見的是抗過氧化物酶抗體(TPOAb)，通過抗體依賴性和自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用導(dǎo)致甲狀腺組織結(jié)構(gòu)破壞和甲狀腺功能低下為主要特點(diǎn)。CD4+T細(xì)胞是機(jī)體執(zhí)行免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞，初始CD4+T細(xì)胞受抗原刺激被激活后，可在不同的細(xì)胞因子微環(huán)境下分化為效應(yīng)細(xì)胞Thl、Th2、Thl7或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells, Treg)。Thl 細(xì)胞主要釋放 IFN-Y、IL_12、TNF_ β 等細(xì)胞因子，激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，發(fā)揮細(xì)胞毒及吞噬效應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞免疫。Th2細(xì)胞主要分泌的細(xì)胞因子有IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等，促進(jìn)B細(xì)胞釋放IgG、IgA、IgE抗體，介導(dǎo)體液免疫。Thl7細(xì)胞分泌IL-17A、IL-17F、IL-6和IL-9等，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型顯示Thl7細(xì)胞與器官特異性自身免疫性炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。Treg細(xì)胞則特異性抑制CD4+、CD8 + T細(xì)胞的活化和增殖，從而阻止自身免疫反應(yīng)的發(fā)生。在免疫應(yīng)答過程中，免疫細(xì)胞間可通過所分泌的細(xì)胞因子而相互刺激，彼此約束，從而對(duì)免疫應(yīng)答進(jìn)行調(diào)節(jié)。細(xì)胞因子作為免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)劑、免疫效應(yīng)分子、炎性反應(yīng)促進(jìn)劑參與、調(diào)節(jié)、影響、促進(jìn)這一過程。細(xì)胞因子的改變，在AITD患者中提示Thl / Th2功能有異常，這種異常可影響調(diào)節(jié)甲狀腺細(xì)胞功能網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的活動(dòng)，促進(jìn)甲狀腺抗體形成增多，促使AITD的發(fā)生，發(fā)展。普遍認(rèn)為Thl型細(xì)胞因子所介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)在HT發(fā)病中起主要作用。其中代表性的細(xì)胞因子為IFN-Y。它一方面促進(jìn)甲狀腺內(nèi)的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，另一方面促進(jìn)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化并釋放TNF-a、IL-U IL_6等細(xì)胞因子以及氧自由基的產(chǎn)生，這些物質(zhì)可造成甲狀腺組織破壞。GD的發(fā)生與促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)的產(chǎn)生有直接的關(guān)系，它是引起GD的主要和直接原因。TRAb屬于IgGl亞類，而Th2型細(xì)胞因子促進(jìn)IgGl亞類的產(chǎn)生。⑶的免疫反應(yīng)呈Th2型，其免疫應(yīng)答以體液免疫為主。TRAb模擬TSH的作用過度刺激甲狀腺濾泡細(xì)胞，導(dǎo)致甲狀腺功能亢進(jìn)[3]。Th細(xì)胞有多種亞型，包括能分泌IL-17A的Thl7亞型，在器官特異性自身免疫性炎癥的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭酗@示出重要意義。而如何從單細(xì)胞水平檢測(cè)不同細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子，是相關(guān)領(lǐng)域有待解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供一種Th細(xì)胞表面及胞內(nèi)染色的方法及其應(yīng)用，以提供一種從單細(xì)胞水平檢測(cè)不同細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子的方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):一種Th細(xì)胞表面及胞內(nèi)染色的方法，其步驟為:I)在一支流式測(cè)定管中加Iml肝素抗凝全血和Iml無菌的含10%小牛血清的RPMI1640培液混勻。2)在上述管中再加入佛波酯2ul，離子霉素2ul，莫能菌素2ul ;蓋上蓋子，在37°C，5%的CO2培養(yǎng)箱中培育不超過3.5小時(shí)(千萬不要超過3.5小時(shí)，否則⑶4細(xì)胞得率降低。蓋子不要蓋太緊)。3)在3個(gè)流式管子內(nèi)，分別加入IFNy/CD4/IL4體系，標(biāo)記為IL-4，加入IFN-Y /⑶4/IL-17體系，標(biāo)記為IL-17，以及陰性對(duì)照管(不加任何抗體)。取步驟2)的全血培養(yǎng)液輕緩顛倒混勻，取出600μ I分別加到三個(gè)流式管子中。4)每根流式管子加4ml無菌紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻數(shù)次，放置lOmin，裂解紅細(xì)胞。5)將裂解紅細(xì)胞后的樣本離心1，500rpm, 5min,棄上清。6)每管加Iml PBS緩沖液輕輕彈撥數(shù)次清洗沉淀,離心1，500rpm, 5min,棄上清加標(biāo)記抗體PE-Cy5-CD4抗體10 μ 1，陰性管不要加，4°C避光孵育30min。7)每管加Iml PBS緩沖液輕輕彈撥數(shù)次洗滌，離心1，500rpm，5min，棄上清，控干。8)每管加冷固定劑:500μ 1，4%多聚甲醛；固定20min，避光放置。9)每管加Iml PBS緩沖液輕輕彈撥數(shù)次清洗,離心1，500rpm, 5min,棄上清。加500 μ 1，I %的皂素穿膜劑，避光放置lOmin。10) 1，500rpm, 5min,離心棄上清。11)在標(biāo)記為 IL-4 的管子中加 FITC-1FN- Y 抗體 0.5ug，PE-1L-4 抗體 0.125ug，在 IL-17 的管子中 FITC-1FN- Y 抗體 0.5ug, PE-1L-17 抗體 0.25ug。12)將上述3根流式管子放在暗室中，室溫孵育過夜后，上流式儀器檢測(cè)。所述的流式細(xì)胞儀檢測(cè)采用BECTON DICKINSON FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果分析應(yīng)用CellsQuest軟件。激活劑:在靜止?fàn)顟B(tài)下,未活化的淋巴細(xì)胞內(nèi)基本不表達(dá)或僅表達(dá)少量細(xì)胞因子，因而難以檢測(cè)。只有當(dāng)其被活化后，細(xì)胞內(nèi)因子才能合成增加，因此檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子必須利用激活劑將其活化。阻斷劑選擇:細(xì)胞在活化后，細(xì)胞因子合成增多，卻不斷地分泌至細(xì)胞外發(fā)生作用，這就造成了用流式細(xì)胞檢測(cè)其細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子水平的困難，因此還要阻斷劑阻止其細(xì)胞因子分泌至胞外才能進(jìn)行檢測(cè)。本試驗(yàn)中使用的阻斷劑是莫能菌素。莫能菌素通過抑制細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子向細(xì)胞外分泌，使細(xì)胞因子合成后累積在細(xì)胞內(nèi)，但是，莫能菌素可產(chǎn)生劑量、時(shí)間依賴的細(xì)胞毒作用，故在使用時(shí)應(yīng)摸索其實(shí)驗(yàn)條件，通常在刺激反應(yīng)結(jié)束前6 12小時(shí)內(nèi)使用。激活時(shí)間:根據(jù)檢測(cè)指標(biāo)和標(biāo)本的不同，需要選擇不同的刺激劑和刺激時(shí)間，以獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。標(biāo)本處理:避免使用絡(luò)合鈣的抗凝劑，如EDTA(因?yàn)樗鼤?huì)限制鈣依賴性激活過程)，所以推薦使用肝素鈉。此外，血樣在8h內(nèi)應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，超過8h會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性損失，一般細(xì)胞因子陽性細(xì)胞會(huì)減少5%。如不能在8h內(nèi)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)將真空采血管水平室溫放置。其基本原理是應(yīng)用熒光素標(biāo)記的特異性抗細(xì)胞因子單克隆抗體(如IFN、IL-4、IL-17等)和抗細(xì)胞表面分子單克隆抗體(如CD4、CD25等)，借助FCM免疫熒光技術(shù)(如FACS)即可從單細(xì)胞水平檢測(cè)不同細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子，并由此可判斷產(chǎn)生特定細(xì)胞因子的細(xì)胞種類、細(xì)胞定位、分布密度及細(xì)胞因子與組織病變關(guān)系等。本發(fā)明通過刺激細(xì)胞一阻斷細(xì)胞膜表面Fe受體一細(xì)胞膜表面抗原染色一細(xì)胞固定一細(xì)胞透膜一胞內(nèi)或核內(nèi)抗原染色一流式細(xì)胞分析等步驟，可以對(duì)Th細(xì)胞表面及胞內(nèi)染色，并獲得較好的實(shí)驗(yàn)效果?？蓱?yīng)用于測(cè)試Thl、Th2、Thl7細(xì)胞占⑶4+細(xì)胞的比例。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例1、入選人群⑶組25例和橋本氏甲減組25例患者均來自2010-06到2011-01上海市瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌門診。正常對(duì)照組來25例自年齡和性別相匹配的健康體檢者。上述初發(fā)GD患者25例，尚未治療。控制穩(wěn)定期⑶患者25例。上述健康體檢者25例。初發(fā)⑶組患者的診斷參照《內(nèi)科學(xué)》第六版和《協(xié)和內(nèi)分泌代謝學(xué)》第六版中GD的診斷標(biāo)準(zhǔn)。確診的GD患者符合下述條件之一即可入選。存在甲狀腺功能亢進(jìn)的癥狀，伴或不伴突眼，甲狀腺?gòu)浡阅[大(觸診或B超證實(shí))、質(zhì)軟；甲狀腺功能檢查(CMIA 法；Architect system, Abbott Laboratories, USA):游離 T3(FT3)、游離 T4(FT4)升高、超敏促甲狀腺激素(sensitive thyroidStimulatinghormone, STSH)水平降低。甲狀腺自身抗體(TRAb)陽性(ECLIA法；RocheDiagnostics)。橋本氏甲減組患者的診斷參照《內(nèi)科學(xué)》第六版和《協(xié)和內(nèi)分泌代謝學(xué)》第六版中的診斷標(biāo)準(zhǔn):甲狀腺中度腫大，質(zhì)地堅(jiān)硬。甲狀腺功能檢查:總T4 (TT4)、FT4減低、STSH顯著升高。甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)和抗過氧化物酶抗體(TPOAb)滴度明顯升高。⑶治療穩(wěn)定組甲狀腺功能檢查:游離T3(FT3)、游離T4(FT4)、超敏促甲狀腺激素水平在正常范圍，TRAb陰轉(zhuǎn)。所有入選的研究對(duì)象均排除近期有感染史、女性妊娠、吸煙、合并其他免疫性疾病及服用免疫增強(qiáng)劑或抑制劑史。兩組均選擇新診尚未治療的病人。生化檢查及激素測(cè)定血甲狀腺激素，由上海市瑞金醫(yī)院內(nèi)分泌研究所檢測(cè)。甲狀腺激素測(cè)定(化學(xué)發(fā)光法；Architectsystem, AbbottLaboratories, USA) ;TRAb (ECLIA 法；RocheDiagnostics) JgAb (CMIA法；Architect system, Abbott Laboratories.USA) ；TPOAb (CMIA法；Architect system, Abbott Laboratories.USA)。2、樣本準(zhǔn)備:所有研究對(duì)象均在上午9點(diǎn)至11點(diǎn)空腹采集靜脈血6ml，3ml為自凝血，提取血清分裝凍存于-80°C，集中檢測(cè)。3ml用無菌肝素抗凝管收集，置于室溫，當(dāng)天中午即處理，備流式細(xì)胞儀檢測(cè)。3、Th細(xì)胞表面及胞內(nèi)染色:
I)在一支流式測(cè)定管中加Iml肝素抗凝全血和Iml無菌的含10%小牛血清的RPMI1640培液混勻。2)在上述管中再加入佛波酯2ul，離子霉素2ul，莫能菌素2ul ;蓋上蓋子，在37°C，5%的CO2培養(yǎng)箱中培育不超過3.5小時(shí)(千萬不要超過3.5小時(shí)，否則⑶4細(xì)胞得率降低。蓋子不要蓋太緊)。 3)在3個(gè)流式管子內(nèi)，分別加入IFN- Y /CD4/IL-4體系，標(biāo)記為IL_4，加入IFN-y/⑶4/IL-17體系，標(biāo)記為IL-17，以及陰性對(duì)照管(不加任何抗體)。取步驟2)的全血培養(yǎng)液輕緩顛倒混勻，取出600μ I分別加到三個(gè)流式管子中。4)每根流式管子加4ml無菌紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻數(shù)次，放置lOmin，裂解紅細(xì)胞。5)將裂解紅細(xì)胞后的樣本離心1，500rpm, 5min,棄上清。6)每管加Iml PBS緩沖液輕輕彈撥數(shù)次清洗沉淀,離心1，500rpm, 5min,棄上清加標(biāo)記抗體PE-Cy5-CD4抗體10 μ 1，陰性管不要加，4°C避光孵育30min。7)每管加Iml PBS緩沖液輕輕彈撥數(shù)次洗滌，離心1，500rpm，5min，棄上清，控干。8)每管加冷固定劑:500 μ 1,4%多聚甲醒；固定20min,避光放置。9)每管加Iml PBS緩沖液輕輕彈撥數(shù)次清洗,離心1，500rpm, 5min,棄上清。加500 μ 1，I %的皂素穿膜劑，避光放置lOmin。10) 1，500rpm, 5min,離心棄上清。11)在標(biāo)記為 IL-4 的管子中加 FITC-1FN- Y 抗體 0.5ug，PE-1L-4 抗體 0.125ug，在 IL-17 的管子中 FITC-1FN- Y 抗體 0.5ug, PE-1L-17 抗體 0.25ug。12)將上述3根流式管子放在暗室中，室溫孵育過夜后，上流式儀器檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果=Thl細(xì)胞比例:橋本氏甲減為(17.82% ±1.70%),⑶為(15.72%±0.86%)均高于正常對(duì)照組(12.47% ±1.09%) (P<0.05);⑶組 Th2 比例(1.78%±0.19%)顯著高于正常對(duì)照組(0.99% ±0.13%) (Ρ〈0.01)，橋本氏甲減組Th2比例(1.59% ±0.20%)，高于正常對(duì)照組(P〈0.05)。Thl7細(xì)胞比例:⑶、橋本氏甲減、對(duì)照組分別為(2.30% ±0.12%),(2.87% ±0.31 % ), (1.90% ±0.11%)。兩組患者的 Thl7 占⑶4 +細(xì)胞比例均高于對(duì)照組就，(P〈005)。
權(quán)利要求
1.一種Th細(xì)胞表面及胞內(nèi)染色的方法，其特征在于:其步驟為: 1)在一支流式測(cè)定管中加Iml肝素抗凝全血和Iml無菌的含10%小牛血清的RPMI1640培液混勻； 2)在上述管中再加入佛波酯2ul，離子霉素2ul，莫能菌素2ul;蓋上蓋子，在37°C，5%的CO2培養(yǎng)箱中培育不超過3.5小時(shí) 3)在3個(gè)流式管子內(nèi)，分別加入IFN-Y/CD4/IL-4體系，標(biāo)記為IL-4，加入IFN-Y/⑶4/IL-17體系，標(biāo)記為IL-17，以及陰性對(duì)照管；取步驟2)的全血培養(yǎng)液輕緩顛倒混勻，取出600 μ I分別加到三個(gè)流式管子中； 4)每根流式管子加4ml無菌紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻數(shù)次，放置lOmin，裂解紅細(xì)胞； 5)將裂解紅細(xì)胞后的樣本離心1，500rpm,5min,棄上清； 6)每管加ImlPBS緩沖液輕輕彈撥數(shù)次清洗沉淀,離心1，500rpm, 5min,棄上清加標(biāo)記抗體PE-Cy5-CD4抗體10 μ 1，陰性管不要加，4°C避光孵育30min ； 7)每管加ImlPBS緩沖液輕輕彈撥數(shù)次洗漆,離心1，500rpm, 5min,棄上清,控干； 8)每管加冷固定劑:500μ 1，4%多聚甲醛；固定20min，避光放置； 9)每管加ImlPBS緩沖液輕輕彈撥數(shù)次清洗，離心1，500rpm，5min，棄上清；加50(^ 1，I %的皂素穿膜劑，避光放置IOmin ； 10)I, 500rpm, 5min,離心棄上清； 11)在標(biāo)記為IL- 4的管子中加FITC-1FN-Y抗體0.5ug，PE-1L-4抗體0.125ug，在IL-17 的管子中 FITC-1FN Y 抗體 0.5ug, PE-1L-17 抗體 0.25ug ； 12)將上述3根流式管子放在暗室中，室溫孵育過夜后，上流式儀器檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Th細(xì)胞表面及胞內(nèi)染色的方法及其應(yīng)用，其步驟為刺激細(xì)胞→阻斷細(xì)胞膜表面Fc受體→細(xì)胞膜表面抗原染色→細(xì)胞固定→細(xì)胞透膜→胞內(nèi)或核內(nèi)抗原染色→流式細(xì)胞分析等步驟，可以對(duì)Th細(xì)胞表面及胞內(nèi)染色，并獲得較好的實(shí)驗(yàn)效果。可應(yīng)用于測(cè)試Th1、Th2、Th17細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例。
文檔編號(hào)G01N1/30GK103105326SQ20121058794
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2012年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月30日
發(fā)明者寧光, 謝曉雁, 楊穎 , 崔斌, 郭婷, 朱巍 申請(qǐng)人:上海市內(nèi)分泌代謝病研究所