專利名稱：多道熒光濾光器立方盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及ー種熒光顯微成像裝置，特別涉及到一種熒光顯微成像裝置中能夠對激發(fā)光、發(fā)射光等進行頻段修改的熒光濾光器立方盒裝置以及包含該裝置的多道熒光顯微成像裝置。
背景技術：
熒光顯微成像系統(tǒng)是目前生物醫(yī)學研究、臨床醫(yī)學研究以及制藥業(yè)研究的基礎エ具。激發(fā)熒光成像技術是在分子水平上對基因、蛋白、藥物與細胞相互作用過程進行觀察的最基本技術，在該成像技術中，是對生物樣本中所感興趣的目標物質及其隨空間的分布進行觀察，在生物熒光觀察系統(tǒng)或成像系統(tǒng)，一般需要對某種目標物質(如疾病標志物)的 一個或幾個特征波段進行成像。在現(xiàn)代分子生物實驗中，為了對感興趣的目標物質進行對比度高、特異性高、或者說靈敏度高的觀察，常常使用具有特異標定性能的熒光標志物，該熒光標定物與感興趣的目標物質的結合，使得結合產物在一定頻率的激發(fā)光照射下產生特定的波長一般長于激光光波長的熒光。常見熒光標定物質所對應的激發(fā)光波長、受激熒光波長如表一所不，常見突光發(fā)射團的激發(fā)波長分布為320到750納米,所發(fā)射的突光波長分布范圍為380納米到780納米。表一
熒光物質I激發(fā)(照明)光(納米) I探測光(納米)
DAPI,345455_
H0ECHST33342343483:
Luciferyellow425528
Fluorescein495519
TexasRed589613
H0ECHST33258345478:
AcridineOrange503530/640
Catecnolamine, Serotonin400-410455
GFP:
RFP:
DsRed
Cy5. 5:
ICG:
Quinacrine,400-440475
Acriflavine, ThioflavinS420-440475
FITC450-480515:=
AcridineOrange503530/640
Rhodamine，Propidiumiodide，TRITC410-550590
MitoTrackerRedCMXRosAlexaFluor488phalloidin如圖I所示，熒光顯微成像裝置的工作原理如下從包含有多種頻譜成分的激發(fā)光源10來的光經(jīng)過激發(fā)濾光片17過濾，激發(fā)濾光片17將光源10的長波部分或不需要頻率部分過濾出去，剰余的允許進入成像觀察照明光路的短波激發(fā)光照射到二相色鏡或分光鏡19上，被二相色鏡或分光鏡19反射后Jl進入物鏡8，短波激發(fā)光經(jīng)過物鏡8的聚焦后照射到放置在載物臺6載玻片樣品7上，樣品7是含有生物制品或其它含有熒光標定物質的制片，樣品7的熒光團在短波激發(fā)光Jl照射下，瞬間產生波長短于激發(fā)光波長的發(fā)射光J2，該發(fā)射光經(jīng)過物鏡8后穿過二相色鏡或分光鏡19，透過二相色鏡或分光鏡19的發(fā)射光經(jīng)過發(fā)射濾光片18后，經(jīng)過系列反射鏡或光學裝置后進入左右目鏡12允許用戶進行觀察。發(fā)射光也可以進入數(shù)字攝像或其它光電轉換成像裝置11成像，數(shù)值圖像顯示在計算機的屏幕上。另外，熒光顯微成像裝置也會包含普通照明光源1，濾色片插板2，視場光闌3，反射鏡4、聚光鏡5等，提供對樣品普通明場觀察所需要的明場照明。如圖2所示，盒體框架、激發(fā)濾光片17、發(fā)射濾光片18和二相色鏡或分光鏡19構成一個熒光濾光器立方盒，激發(fā)濾光片17和發(fā)射濾光片18常常是在該盒子的兩個互相垂直的表面，二相色鏡或分光鏡位于激發(fā)濾光片17與發(fā)射濾光片18之間45度的夾角面上，熒光濾光器立方盒構成熒光顯微成像裝置的ー個核心部件，理想的激發(fā)濾光片17或者發(fā)射濾光片18是只允許入射光中特定頻譜波段光高透率穿過，而對其它頻率波段的光進行高效率截斷。理想的二相色鏡19對于波長較短的發(fā)射光是ー個理想的反射鏡,不會對發(fā)射光波形或強度進行修整，只是讓激發(fā)光100%反射，起到由入射方向到反射方向改向作用。對角線放置的二相色鏡19將水平入射激發(fā)光沿垂直方向反射出去照射到樣品上(使得樣品吸收激發(fā)光能量而發(fā)出波長較長的熒光)；而對于波長較長的來自于樣品的發(fā)射光來說就像ー個透明窗ロ，不會對發(fā)射光的波形進行修整或衰減，只是讓發(fā)射光100%透過。傳統(tǒng)的熒光顯微成像裝置含有并行的2到3個如圖2所示的熒光濾光器立方盒，其中一個濾光器立方盒實現(xiàn)對樣品明場照明下觀察，另外I到2各個熒光濾光器立方盒實現(xiàn)對樣品相應的I到2個熒光團的熒光觀察。如中國專利CN00217112. 0所公布的方法進行推拉的方式來改變不同的熒光濾光器立方盒進入照明/成像光路。傳統(tǒng)方法是通過増加熒光濾光器立方盒的個數(shù)來增加對于可觀察的熒光團的種類。在生物突光觀察中，一般需要對用ー個樣品進行多種目標物質突光標定，形成多種熒光發(fā)光團，對ー種熒光團成像，就得有一個匹配的激發(fā)光濾光片、一個發(fā)射光(或探測光)濾光片以及ー個二相色鏡來對該突光團隨空間分布成像，之后將對應于第一種突光團的激發(fā)光濾光片、發(fā)射光濾光片和二相色鏡移出光路，而將對應的用于探測第二種熒光團的激發(fā)光濾光片、發(fā)射光濾光片和二相色鏡移進光路，實現(xiàn)對第二種熒光團的觀察，由于對應于ー種熒光團，其激發(fā)光、發(fā)射光波段是匹配的，所以一般采用插件式熒光濾光器立方盒，包含有激發(fā)濾光片，發(fā)射濾光片、二相色鏡。將熒光濾光器立方盒插入到普通顯微鏡光路中，就形成可以進行熒光觀察的生物熒光顯微鏡，對多個熒光標定物進行觀察，就得有多個熒光濾光器立方盒。使用插件式熒光濾光器立方盒來實現(xiàn)多路光信號過濾與使用兩個獨立的濾光輪盤相比，形成的系統(tǒng)體積小，價格偏低等優(yōu)點。如中國專利CN201110065302. 3 “激發(fā)熒光分子成像系統(tǒng)及一次熒光成像方法”分別使用兩個濾光輪盤激發(fā)濾光輪盤和發(fā)射濾光輪盤，濾光輪盤的體積隨著濾光片個數(shù)的増加幾乎是按二次方増加，因此適用于多道熒光觀察(道數(shù)多余3)的濾光輪盤體積龐大因為輪盤半徑較小吋，輪盤表面不能將各個濾片不重疊的展開，如果將其中一個或兩個濾光輪盤改換成帶通中心頻率可調得LCTF或A0F，所形成的熒光成像裝置體積更大，價格更貴，透過率更低。要對ー種熒光標定物進行觀察，就要有一個對應的熒光濾光器立方盒，為了方便觀察不同的熒光團，中國專利CN00217112.0 “ー種用于熒光顯微鏡的光譜波段快速轉換裝置”公開ー種將多個激發(fā)濾光片放置在激發(fā)濾光片架上，將激發(fā)濾光片架整體呈抽屜狀自該孔插入熒光濾光器立方盒，這樣用戶在使用吋，可以選擇不同的激發(fā)濾光片插入到熒光濾光器立方盒的箱體中，該方法缺點是當激發(fā)濾光片數(shù)量較大時，所形成的熒光濾光器立方盒體積大，另外用戶也不能選擇不同的發(fā)射濾光片或二相色鏡或分光鏡，而根據(jù)表一所示，不同熒光團的激發(fā)光與發(fā)射光有對應關系，或者說每種熒光團的激發(fā)光/發(fā)射光波段對是不同的，常常是當激發(fā)光濾片變換吋，發(fā)射光濾片也需要跟著變換，由于受到體積限制，使用該方法實現(xiàn)多道熒光觀察的熒光顯微成像系統(tǒng)通常只能有2-3道，很難高于5道。為適應多種熒光團觀察的所需要的激發(fā)濾光片/發(fā)射濾光片/分色鏡要求，美國專利US6252664公開ー種插件式熒光濾光器立方盒，該發(fā)明使用的帶通濾光片在頻率在200到400納米波長范圍內具有幾個高通波峰，二相色鏡允許波長在415-800納米的(發(fā)射)光通過，而對200-400納米波段的發(fā)射光進行發(fā)射，該方法的缺點是需要特殊制造的濾光片，而且所觀察的熒光數(shù)難以超過10種。
發(fā)明內容本實用新型目的在于克服上述熒光濾光器立方盒存在的缺點，提供ー種結構緊湊的可以對多種熒光團進行觀察的熒光濾光器立方盒。本實用新型所采用的技術方案為ー種多道熒光濾光器立方盒，包括包含激發(fā)濾光片組、發(fā)射濾光片組、二相色鏡或分光鏡，激發(fā)濾光片與發(fā)射濾光片分別固定于立方盒相鄰的兩個垂直平面上，二相色鏡或分光鏡位于激發(fā)濾光片與發(fā)射濾光片之間45度的夾角面上，在立方盒與發(fā)射濾光片的相對面上開有孔，其要點在于所述的激發(fā)濾光片組由至少兩片激發(fā)濾光片等距離鑲嵌在激發(fā)濾光片的底襯上，激發(fā)濾光片的底襯的兩端固定于激發(fā)濾光片轉輪上，所述的發(fā)射濾光片組由至少兩片發(fā)射濾光片等距離鑲嵌在發(fā)射濾光片的底襯上，發(fā)射濾光片的底襯的兩端固定于發(fā)射濾光片轉輪上。本實用新型將原先平放的激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片卷曲起來，象膠卷一祥，使一個熒光濾光器立方盒可以存有多個激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片，可以對多種熒光團進行觀察，結構緊湊。所述的固定激發(fā)濾光片的底襯上下兩端邊緣開有定位齒孔，在立方盒上固定有與定位齒孔相配合的定位裝置。所述的固定發(fā)射濾光片的底襯上下兩端邊緣開有定位齒孔，在立方盒上固定有與定位齒孔相配合的定位裝置。、[0017]二相色鏡或分光鏡是二相色鏡組或分光鏡組，由至少兩片二相色鏡濾光片或分光鏡等距離鑲嵌在底襯上，二相色鏡或分光鏡的底襯的兩端固定于二相色鏡轉輪上。所述的固定二相色鏡的底襯上下兩端邊緣開有定位齒孔，在立方盒上固定有與定位齒孔相配合的定位裝置。上述的定位裝置可以為與齒孔相嚙合的齒輪，其原理結構與使用膠圈的相機相似。激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片、二相色鏡或分光鏡可以是柔軟可以彎曲的或是薄底襯不能明顯大幅度彎曲的濾光片。 激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片、二相色鏡或分光鏡所固定的底襯可以是相同的材料也可不同，但其結構與固定方式和膠卷相似，兩端卷曲，中間處于使用狀態(tài)中的部分是平整的，即位于立方盒表面、對角面上的部分是平整的。轉輪可以是相同的，也可根據(jù)各自的實際情況而不同。本實用新型的二相色鏡或分光鏡也是多個的，這也是本實用新型對現(xiàn)有技術ー個大改進，有了多個二相色鏡或分光鏡就能方便地選擇所需要的二相色鏡或分光鏡置于光路中，而不用更換系統(tǒng)。所述的襯底是整塊柔軟可以重復卷曲的材料，激發(fā)濾光片、濾光片、二相色鏡或分光鏡鑲嵌在柔軟襯底的表面，底襯背面有高于激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片、二相色鏡或分光鏡·的支撐凸起物。這樣當襯底在軸輪帶動下卷曲時，支撐凸起物與襯底的背面接觸，而濾光片表面不與襯底材料背面有摩擦接觸。同樣所述的襯底可以是多塊帶有定位齒孔的材料的組合，相鄰襯底之間由柔軟帶有定位齒孔的材料連接，激發(fā)濾光片、濾光片、二相色鏡或分光鏡鑲嵌在柔軟襯底的表面，底襯背面有高于激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片、二相色鏡或分光鏡的支撐凸起物。所述的激發(fā)濾光片兩端的轉輪、濾光片兩端的轉輪和二相色鏡或分光鏡兩端的轉輪分別與電機轉動軸相連。方便使用時能通過計算機進行控制操作。激發(fā)濾光片組帶有計算機可以自動識別的標定相應濾片的標記；發(fā)射濾光片組帶有計算機可以自動識別的標定相應濾片的標記；二相色鏡或分光鏡組帶有計算機可以自動識別的標定相應濾片/分光鏡的標記。所述的標記為條形碼或磁條。在計算機廣泛應用的現(xiàn)代，在激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片、二相色鏡或分光鏡帶有計算機可以自動識別的標記，方便其在使用過程中可能通過計算機進行選擇，為自動檢測提供可能。所述的發(fā)射濾光片組中包含ー個空白透通孔，允許發(fā)射光源的所有頻率成分未經(jīng)任何修改地通過。二相色鏡或分光鏡組包含ー個空白透通孔，不對任何入射的激發(fā)光進行反射，只是允許從樣品來的光全部透過。激發(fā)濾光片組包含的濾片為窄帶帶通濾片，濾片組的峰值透過濾覆蓋300納米到750納米，單個激發(fā)濾光片直徑在10毫米到40毫米之間，一般選擇25毫米；在短波段(入< 600納米)，單個激發(fā)濾光片的峰值透過率中心波長可以是逐漸遞增的，ー個激發(fā)濾光片與相鄰激發(fā)濾光片的峰值透過率中心波長的差值的絕對值大于或等于5納米，濾片組可以包含2-46個激發(fā)濾光片。發(fā)射濾光片組包含的濾片為窄帶帶通濾片，濾片組的峰值透過濾覆蓋380納米到780納米，單個發(fā)射濾光片直徑在10毫米到40毫米之間，一般選擇25毫米；在短波段(入< 600納米)，單個發(fā)射濾光片的峰值透過率中心波長可以是逐漸遞增的，ー個發(fā)射濾光片與相鄰居發(fā)射濾光片的峰值透過率中心波長的差值的絕對值大于或等于5納米，發(fā)射濾光片組可以包含高達2-41個發(fā)射濾光片。分光鏡組包含的分光鏡為長波通過短波反射分光鏡，二相色相鏡組或分光鏡組發(fā)射與透過分界波長覆蓋300納米到750納米，單個分光鏡片邊長在10毫米到40毫米之間，一般選擇26毫米X 36毫米矩形分光鏡；在短波段即\ ( 600納米，單個二相色鏡或分光鏡的發(fā)射與透過分界波長是逐漸遞增的，ー個二相色鏡或分光鏡與相鄰二相色鏡或分光鏡發(fā)射與透過分界波長的差值的絕對值大于或等于5納米，分光鏡組包含高達2-46個分光鏡片。綜上所述，本實用新型可以在較小體積內很容易實現(xiàn)大量的濾片的存儲。該發(fā)明的優(yōu)點隨著所需要觀察的熒光團種的數(shù)量的增多而更明顯的顯現(xiàn)。本實用新型所設計的多道熒光濾光器立方盒激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片、二相色鏡或分光鏡的識別及選擇操縱控制都做了與計算機對接的設計，因此利用本實用新型的多道熒光濾光器立方盒制作的多道熒 光顯微成像裝置，可以通過計算機進行控制，能夠對多于10種熒光團進行觀察，使用本實用新型所提供的多道熒光濾光器立方盒的熒光成像設備可以既對空間高分辨率成像，還可以對光譜高分辨率成像。

圖I為使用傳統(tǒng)的熒光濾光器立方盒的熒光顯微成像系統(tǒng)圖2為現(xiàn)有的熒光濾光器立方盒示意圖圖3為本實用新型的結構示意圖圖4為使用本實用新型的多道熒光濾光器立方盒的熒光顯微成像系統(tǒng)圖5為可卷曲的發(fā)射濾光片組的結構示意圖圖6為圖5的俯視圖其中I普通照明光源2濾色片插板3視場光闌4反射鏡5聚光鏡6載物臺7樣品 8物鏡9立方盒10激發(fā)光源11光電轉換成像裝置12左右目鏡13計算機17激發(fā)濾光片18發(fā)射濾光片 19 二相色鏡或分光鏡21 二相色鏡的底襯22有機薄膜29激發(fā)濾光片轉輪32發(fā)射濾光片轉輪35 二相色鏡轉輪 41標記50孔 51激發(fā)濾光片的底襯52發(fā)射濾光片的底襯53齒孔 64支撐凸起物。
具體實施方式
如圖3、5、6所示，一種多道熒光濾光器立方盒，是對現(xiàn)有的熒光濾光器立方盒進行改進，將原先平放的激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片和二相色鏡或分光鏡卷曲起來，象膠卷ー樣，使一個突光濾光器立方盒可以存有多個激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片和二相色鏡或分光鏡，可以對多種熒光團進行觀察。它包括有盒體框架和固定于盒體框架上的激發(fā)濾光片組、發(fā)射濾光片組、二相色鏡或分光鏡組，激發(fā)濾光片17與發(fā)射濾光片18分別固定于立方盒9相鄰的兩個垂直平面上，二相色鏡或分光鏡19位于激發(fā)濾光片17與發(fā)射濾光片18之間45度的夾角面上，在立方盒9與發(fā)射濾光片18的相對面上開有孔50，激發(fā)濾光片組由至少兩片激發(fā)濾光片17等距離鑲嵌在可以卷曲的激發(fā)濾光片的底襯51上，激發(fā)濾光片的底襯51的兩端固定于激發(fā)濾光片轉輪29上，為了保證激發(fā)濾光片17在工作平面上平整，在激發(fā)濾光片的底襯51上下兩端邊緣開有定位齒孔53，在立方盒上固定有與定位齒孔53相配合的定位裝置；同樣所述的發(fā)射濾光片組由至少兩片發(fā)射濾光片18等距離鑲嵌在可以卷曲的發(fā)射濾光片的底襯52上，發(fā)射濾光片的底襯52的兩端固定于發(fā)射濾光片轉輪32上，同樣發(fā)射濾光片的底襯52上下兩端邊緣開有定位齒孔53，在立方盒上固定有與定位齒孔53相配合的定位裝置；二相色鏡或分光鏡組由至少兩片二相色鏡或分光鏡19等距離鑲嵌在可以卷曲的二相色鏡的底襯21上，二相色鏡的底襯21的兩端固定于二相色鏡轉輪35上，同理二相色鏡的底襯21上下兩端邊緣開有定位齒孔53，在立方盒上固定有與定位齒孔53相配合的定位裝置。上述的定位裝置可以為與齒孔相嚙合的齒輪或限位毛刷，其原理結構與使用膠圈的相機相似。襯底孔齒、運動裝置的牙齒凸起、以及ー些限位毛刷可以防止濾光片組運動過程中打滑、或者沿垂直運動方向的震動。激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片、二相色鏡或分光鏡可以是柔軟可以彎曲的或是薄底襯不能明顯大幅度彎曲的濾光片。激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片、二相色鏡或分光鏡所固定的底襯可以是相同的材料也可不同，但其結構與固定方式和膠卷相似，兩端卷曲，中間處于使用狀態(tài)中的部分是平整的，即位于立方盒表面、對角面上的部分是平整的。轉輪可以是相同的，也可根據(jù)各自的實際情況而不同。本實用新型的核心是將傳統(tǒng)的熒光濾光器立方盒的激發(fā)濾光片17改變?yōu)楹卸鄠€激發(fā)濾光片17的激發(fā)濾光片組；類似的，將發(fā)射濾光片18改變含有多個發(fā)射濾光片18的發(fā)射濾光片組，將二相色鏡或分光鏡19改為含有多個二相色鏡或分光鏡19的二相色鏡或分光鏡組。這樣在沒有改變突光濾光器立方盒的個數(shù)下，實現(xiàn)對眾多(ぎ5)的不同突光團的觀察。本實用新型所提供的技術方案是使用可以卷曲的濾片支撐材料來組裝激發(fā)濾光片/發(fā)射濾光片/ 二相色鏡等，只讓需要進入光路的一個激發(fā)濾光片17和一個發(fā)射濾光片18分別在立方體的兩個垂直的表面上，ー個二相色鏡在立方體的對角線上，而將其它的激發(fā)濾光片組的其余激發(fā)濾光片17、發(fā)射濾光片組的其余發(fā)射濾光片18、二相色鏡組的其余二相色鏡19等卷曲起來，以減小各自占有空間，實現(xiàn)結構緊湊之目的。圖5、圖6所示為可卷曲的發(fā)射濾光片組的結構示意圖，同樣也可是發(fā)射濾光片組、二相色鏡或分光鏡組的結構示意圖，使用多個柔軟激發(fā)濾光片17及柔軟底襯組成柔軟激發(fā)濾光片組，使用多個柔軟發(fā)射濾光片18及柔軟底襯組成柔軟發(fā)射濾光片組，使用多個柔軟二相色鏡或分光鏡19及柔軟底襯組成柔軟二相色鏡或分光鏡組。在發(fā)射濾光片的底襯52上下兩端邊緣開有定位齒孔53，激發(fā)濾光片17、發(fā)射濾光片18和二相色鏡濾光片19鑲嵌在柔軟襯底的表面，底襯背面有高于激發(fā)濾光片17、發(fā)射濾光片18、二相色鏡濾光片或分光鏡19的支撐凸起物64。當發(fā)射濾光片組卷曲起來時，其正面將要與其背面接觸，為避免摩擦損壞光學發(fā)射濾光片18，可以是在發(fā)射濾光片(柔軟光學膜層)18上覆蓋透明有機薄膜22 (如環(huán)氧樹脂)，也可以是將發(fā)射濾光片(柔軟光學膜層)18深深地嵌入在低于軟發(fā)射濾光片的底襯52的表面，使得發(fā)射濾光片(柔軟光學膜層)18四周的底襯材料都高于發(fā)射濾光片18的表面，發(fā)射濾光片四周的底襯材料也可以是ー些間斷性支撐凸起64，或可以是一面使用保護膜一面使用支撐凸起，還可以是別的方法，激發(fā)濾光片組和二相色鏡組的截面也類似(圖略)。支撐凸起物64僅起到隔離作用，也可布置于底襯表面，即底襯表面有高于激發(fā)濾光片17、發(fā)射濾光片18、二相色鏡或分光鏡19的支撐凸起物64，當襯底在軸輪帶動下卷曲時，支撐凸起物與襯底背面接觸而濾光片表面不與襯底材料背面接觸(圖略)。這些濾鏡的具體制造方法可如中國專利申請CN201110379628. 3 “ー種可編程多光譜軟底襯濾光片系統(tǒng)”所公布方法。先使用物理方法在真空環(huán)境下在普通耐高溫底襯材料如玻璃底襯上鍍介電系多層膜、或者介電金屬膜系多層膜、或者全金屬膜系多層膜。這些光學多層膜本生都是柔軟可以彎曲的，只是為了耐鍍膜及隨后催化工藝所需要高溫環(huán)境所使用的普通襯底如玻璃材料等不能彎曲。第二步是將鍍好的濾片的柔軟光學膜層17轉換到可以卷曲的底襯材料上。該方法同樣適用于發(fā)射濾光片薄膜18及由此組成的發(fā)射濾光片組。二相色鏡或分光鏡組所包含的二相色鏡或分光鏡19是柔軟可以彎曲的，這些ニ相色鏡或分光鏡的具體制造方法可如中國專利申請CN201110379628. 3 “ー種可編程多光·譜軟底襯濾光片系統(tǒng)”所公布方法。單個柔軟二相色鏡的制造エ序與濾鏡類似，只是所選的具體膜層數(shù)目不同。對應于激發(fā)濾光片組的每個激發(fā)濾光片17有一個標記(可編程編碼器)41 ；類似地，對應于發(fā)射濾光片組的每個發(fā)射濾光片18有一個標記(可編程編碼器)；對應于二相色鏡或分光鏡組的每個二相色鏡19有一個標記(可編程編碼器)。這些標記(可編程編碼器)可以是條形碼，或磁條，或是數(shù)目不同的透光孔，也可以是數(shù)字或別的在對應的傳感器的協(xié)助下適于計算機對運動到光路的激發(fā)濾光片/發(fā)射濾光片/ 二相色鏡等自動識別的標記。發(fā)射濾光片組還可以包含ー個空白透通孔，不對來自樣品的光源的頻率作任何修改，以方便提供普通照明光源的明場觀察。在第二個實施方案中，激發(fā)濾光片組所包含的激發(fā)濾光片為薄底襯不能明顯大幅度彎曲的濾光片，發(fā)射濾光片組所包含的發(fā)射濾光片是薄底襯不能明顯大幅度彎曲的；二相色鏡或分光鏡組所包含的二相色鏡或分光鏡是薄底襯不能明顯大幅度彎曲的二相色鏡或分光鏡組；將這些濾光片及分色鏡使用多塊帶有定位齒孔53的材料的組合，相鄰襯底塊之間由柔軟帶有定位齒孔的材料連接；激發(fā)濾光片17、發(fā)射濾光片18、二相色鏡或分光鏡19鑲嵌在襯底材料上表面之中，一塊襯底材料鑲嵌ー塊激發(fā)濾光片17、發(fā)射濾光片18、二相色鏡或分光鏡19。這樣雖然ー塊濾鏡及其襯底不能彎曲，多塊濾鏡組合卻由于濾鏡間的柔軟連接而變得可以卷曲。在這ー個具體實施方案中，卷曲起來的濾鏡組每ー個卷層不是嚴格的圓周，而是由多邊形近似的圓周，每ー個邊包含一個濾鏡及其底襯材料。本實用新型的具體實施方案還可以是使用方案一中的柔軟激發(fā)濾光片膜17、柔軟發(fā)射濾光片膜18、柔軟二相色鏡或分光鏡19組裝在方案ニ中的可卷曲底襯中，還可以使用上述方案ニ中的薄型(非柔軟)激發(fā)濾光片17、薄型(非柔軟)發(fā)射濾光片18、薄型(非柔軟)二相色鏡或分光鏡19組裝在方案一中的整塊柔軟可卷曲底襯中。所述的激發(fā)濾光片17兩端的轉輪、發(fā)射濾光片18兩端的轉輪和二相色鏡或分光鏡19兩端的轉輪分別與電機轉動軸相連。[0059]激發(fā)濾光片組包含的濾片為窄帶帶通濾片17，濾片組的峰值透過濾覆蓋300納米到750納米，單個激發(fā)濾光片直徑在10毫米到40毫米之間，一般選擇25毫米；在短波段(X < 600納米)，單個激發(fā)濾光片17的峰值透過率中心波長可以是逐漸遞增的，ー個激發(fā)濾光片17與相鄰激發(fā)濾光片17的峰值透過率中心波長的差值的絕對值大于或等于5納米，濾片組可以包含2-46片(甚至92片)激發(fā)濾光片17。發(fā)射濾光片組包含的濾片為窄帶帶通濾片，濾片組的峰值透過濾覆蓋380納米到780納米，單個發(fā)射濾光片直徑在10毫米到40毫米之間，一般選擇25毫米；在短波段(入< 600納米)，單個發(fā)射濾光片的峰值透過率中心波長可以是逐漸遞增的，ー個發(fā)射濾光片18與鄰居發(fā)射濾光片18的峰值透過率中心波長的差值的絕對值大于或等于5納米，濾片組可以包含2-41片(甚至82片)發(fā)射濾光片18。分光鏡組包含的分光鏡為長波通過短波反射分光鏡，二相色相鏡組或分光鏡組發(fā)射與透過分界波長覆蓋300納米到750納米，單個分光鏡片邊長在10毫米到40毫米之間，一般選擇26毫米X 36毫米矩形分光鏡；在短波段即\ ( 600納米，單個二相色鏡或分光 鏡19的發(fā)射與透過分界波長是逐漸遞增的，ー個二相色鏡或分光鏡19與相鄰二相色鏡或分光鏡19發(fā)射與透過分界波長的差值的絕對值大于或等于5納米，分光鏡組包含高達2-46個分光鏡片。如圖4所示，本實用新型所提供的多道熒光濾光器立方盒可以引入到倒置或正置顯微成像系統(tǒng)中，配以頻譜寬的光源如鹵素燈、汞燈等或多個成像用激光光源，以及ー套軟件及控制系統(tǒng)就構成多道熒光顯微成像裝置。該多道熒光顯微成像裝置包含正置或倒置顯微成像裝置、本實用新型所提供的多道熒光濾光器立方盒9、激發(fā)光系統(tǒng)、以及控制系統(tǒng)。其中正置或倒置顯微成像系統(tǒng)包含照明光源I經(jīng)過濾光片2、視場光闌3、反射鏡4、聚光鏡5后Jl照射到放置在自動載物臺6上待觀察樣品7，來自待測樣品7的透射光(或者反射光)J2經(jīng)過物鏡8及其它光學儀器后進入觀察目鏡12或數(shù)字攝像系統(tǒng)11，數(shù)字攝像系統(tǒng)獲得圖像顯示在計算機13的屏幕。多道突光濾光器立方盒9包含激發(fā)濾光片組、發(fā)射濾光片組、二相色鏡或分光鏡組。激發(fā)光系統(tǒng)包括具有激發(fā)光所需頻譜的光源10及相應光斑整形裝置?？刂葡到y(tǒng)包括有計算機13，計算機內存有激發(fā)濾光片運動、發(fā)射濾光片運動和ニ相色鏡或分光鏡運動的控制軟件，控制系統(tǒng)與多道熒光濾光器立方盒9相連，控制激發(fā)濾光片運動、發(fā)射濾光片運動、二相色鏡或分光鏡運動、識別激發(fā)濾光片組標記41、識別發(fā)射濾光片組標記、識別二相色鏡組標記；控制系統(tǒng)與顯微成像裝置相連，控制其攝像系統(tǒng)11、載物臺6、物鏡轉換器8。該多道熒光顯微成像裝置提供常規(guī)明場觀察的方法如下在操作員手工或計算機軟件及控制系統(tǒng)自動控制下，激發(fā)光源10將關閉，不提供激發(fā)光；二相色鏡組將其包含的透光孔移入光路，發(fā)射鏡組將其包含的透光孔移入光路；普通照明光源I將提供照明光，照明光源I經(jīng)過濾光片2、視場光闌3、反射鏡4、聚光鏡5后照射到放置在自動載物臺6上待觀察樣品7，來自待測樣品7的透射光(或者反射光)經(jīng)過物鏡8、穿過二相色鏡組的透光孔及發(fā)射濾鏡組的透光孔及其它光學儀器后進入觀察目鏡12或數(shù)字攝像系統(tǒng)11，數(shù)字攝像系統(tǒng)獲得圖像顯示在計算機13的屏幕。[0068]該多道熒光顯微成像裝置提供對某樣品No. I熒光物質的觀察方法如下首先對樣品進行普通明場觀察，并調節(jié)樣品感興趣區(qū)域(ROI)在視場中位置；其次對用戶將感興趣的No. I熒光物質的名稱利用軟件系統(tǒng)系統(tǒng)所提供的用戶界面輸入到計算機，計算機將利用該軟件系統(tǒng)所包含的熒光物質及它們的激發(fā)光波段Xia /峰值發(fā)射光的頻譜、1B信息顯示給用戶供核對；之后在操著員手工或計算機軟件及控制系統(tǒng)自動控制下，明場照明光源I將關閉，激發(fā)光源10發(fā)光,提供激發(fā)光；之后控制系統(tǒng)控制二相色鏡組的運動，將選擇對應于No. I熒光物質的二相色鏡進入光路，同時將其它二相色鏡移出光路；控制系統(tǒng)控制激發(fā)濾光片組的運動，將選擇峰值透過率包含波段、IA的激發(fā)濾光片17進入光路，同時將其它激發(fā)濾光片17移出光路；控制系統(tǒng)控制發(fā)射濾光片組的運動，將選擇峰值透過率包含波段、IB的發(fā)射濾光片18進入光路，同時將其它發(fā)射濾光片18移出光路； 再后，控制系統(tǒng)將控制數(shù)子攝像系統(tǒng)11的隱光，開始收集來自樣品的滅光。從包含有多種頻譜成分的激發(fā)光源10來的光經(jīng)過激發(fā)濾光片17過濾，激發(fā)濾光片17將光源10的長波部分或不需要頻率部分過濾出去，剰余的允許進入成像觀察照明光路的短波激發(fā)光照射到二相色鏡19上，被二相色鏡19反射后進入物鏡8。短波激發(fā)光經(jīng)過物鏡8的聚焦后照射到放置在載物臺6載玻片樣品7上。樣品7是含有生物制品或其它含有熒光標定物質的制片，樣品7的熒光團在短波激發(fā)光J1照射下，瞬間產生波長短于激發(fā)光波長的發(fā)射光J2，該發(fā)射光經(jīng)過物鏡8后穿過二相色鏡19，透過二相色鏡19的發(fā)射光經(jīng)過發(fā)射濾光片18后，經(jīng)過系列反射鏡或光學裝置后進入數(shù)字攝像系統(tǒng)11 ；最后，控制系統(tǒng)將控制數(shù)字攝像系統(tǒng)11停止曝光，結束對來自樣品的特定波段的熒光的收集，并將所獲得的圖像顯示在計算機13屏幕上。該多道熒光顯微成像裝置提供對某樣品N種(N S 2)熒光物質的觀察方法如下首先對樣品進行普通明場觀察，并調節(jié)樣品感興趣區(qū)域(ROI)在視場中位置；其次將用戶將感興趣的N種熒光物質的名稱利用軟件系統(tǒng)所提供的用戶界面輸入到計算機，計算機將利用該軟件系統(tǒng)所包含的熒光物質及它們的激發(fā)光波段
入NA/峰值發(fā)射光的頻譜、、m信息顯示給用戶供核對；再次實現(xiàn)對No. I熒光物質隨空間分布的數(shù)字成像。第一歩操著員手工或計算機軟件及控制系統(tǒng)自動控制下，明場照明光源I將關閉，對含有、1A頻譜的激發(fā)光源10供電并切入光路，提供激發(fā)光；第二步，控制系統(tǒng)控制二相色鏡組的運動，將選擇對應于No. I熒光物質的二相色鏡進入光路，同時將其它二相色鏡移出光路；控制系統(tǒng)控制激發(fā)濾光片組的運動，將選擇峰值透過率包含波段、IA的激發(fā)濾光片17進入光路，同時將其它激發(fā)濾光片17移出光路；控制系統(tǒng)控制發(fā)射濾光片組的運動，將選擇峰值透過率包含波段入IB的發(fā)射濾光片18進入光路，同時將其它發(fā)射濾光片18移出光路；第三步，控制系統(tǒng)將控制數(shù)字攝像系統(tǒng)11的曝光，開始收集來自樣品的熒光。從包含有多種頻譜成分的激發(fā)光源10來的光經(jīng)過激發(fā)濾光片17過濾，激發(fā)濾光片17將光源10的長波部分或不需要頻率部分過濾出去，剰余的允許進入成像觀察照明光路的短波激發(fā)光照射到二相色鏡19上，被二相色鏡19反射后進入物鏡8。短波激發(fā)光經(jīng)過物鏡8的聚焦后照射到放置在載物臺6載玻片樣品7上。樣品含有生物制品或其它含有熒光標定物質的制片，樣品7的熒光團在短波激發(fā)光照射下，瞬間產生波長短于激發(fā)光波長的發(fā)射光，該發(fā)射光經(jīng)過物鏡8后穿過ニ相色鏡19。透過二相色鏡19的發(fā)射光經(jīng)過發(fā)射濾光片18后，經(jīng)過系列反射鏡或光學裝置后進入數(shù)字攝像系統(tǒng)11 ;第四步，控制系統(tǒng)將控制數(shù)字攝像系統(tǒng)11停止曝光，結束對來自樣品的特定波段的熒光的收集，并將獲得的圖像顯示在計算機13屏幕上并保存位圖像ら。重復上述對No. I熒光物質隨空間分布的數(shù)字成像中描述的第二步到第四步的過程實現(xiàn)對No. 2熒光物質隨空間分布的數(shù)字成像12，…，No. N熒光物質隨空間分布的數(shù)字成像In。對上述過程獲得的N種熒光物質的數(shù)字圖像I1, I2,…，In-行處理，并利用偽彩色將它們混合后顯示在計算機屏幕上給用戶觀察這N種熒光物質的空間位置關系。本實用新型所提供的多道熒光濾光器立方盒還可以引入到倒置或正置共聚焦顯微成像等系統(tǒng)中，形成相應的共聚焦熒光顯微成像系統(tǒng)。
權利要求1.一種多道熒光濾光器立方盒，包括有盒體框架和固定于盒體框架上的激發(fā)濾光片組、發(fā)射濾光片組、二相色鏡或分光鏡(19),激發(fā)濾光片(17)與發(fā)射濾光片(18)分別固定于立方盒(9)相鄰的兩個垂直平面上，二相色鏡或分光鏡(19)位于激發(fā)濾光片(17)與發(fā)射濾光片(18)之間45度的夾角面上，在立方盒(9)與發(fā)射濾光片(18)的相對面上開有孔(50)，其特征在于所述的激發(fā)濾光片組由至少兩片激發(fā)濾光片(17)等距離鑲嵌在激發(fā)濾光片的底襯(51)上，激發(fā)濾光片的底襯(51)的兩端固定于激發(fā)濾光片轉輪(29)上，所述的發(fā)射濾光片組由至少兩片發(fā)射濾光片(18)等距離鑲嵌在發(fā)射濾光片的底襯(52)上，發(fā)射濾光片的底襯(52)的兩端固定于發(fā)射濾光片轉輪(32)上。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種多道熒光濾光器立方盒，其特征在于所述的激發(fā)濾光片的底襯(51)上下兩端邊緣開有定位齒孔(53)，在立方盒上固定有與定位齒孔(53)相配合的定位裝置。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種多道熒光濾光器立方盒，其特征在于所述的發(fā)射濾光片的底襯(52)上下兩端邊緣開有定位齒孔，在立方盒上固定有與定位齒孔相配合的定位裝置。
4.根據(jù)權利要求I所述的一種多道熒光濾光器立方盒，其特征在于所述的二相色鏡或分光鏡是二相色鏡組或分光鏡組，由至少兩片二相色鏡或分光鏡(19)等距離鑲嵌在二相色鏡的底襯(21)上，二相色鏡的底襯(21)的兩端固定于二相色鏡轉輪(35)上。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種多道熒光濾光器立方盒，其特征在于所述的二相色鏡的底襯(21)上下兩端邊緣開有定位齒孔，在立方盒上固定有與定位齒孔相配合的定位裝置。
6.根據(jù)權利要求I或4所述的一種多道熒光濾光器立方盒，其特征在于所述的襯底是整塊柔軟可以重復卷曲的材料，激發(fā)濾光片(17)、發(fā)射濾光片(18)和二相色鏡或分光鏡(19)鑲嵌在柔軟襯底的表面，底襯背面有高于激發(fā)濾光片(17)、發(fā)射濾光片(18)、二相色鏡或分光鏡(19)的支撐凸起物(64)。
7.根據(jù)權利要求I或4所述的一種多道熒光濾光器立方盒，其特征在于所述的襯底是由多塊帶有定位齒孔的材料的組合，相鄰襯底之間由柔軟帶有定位齒孔的材料連接，激發(fā)濾光片(17)、發(fā)射濾光片(18)和二相色鏡或分光鏡(19)鑲嵌在柔軟襯底的表面，底襯背面有高于激發(fā)濾光片(17)、發(fā)射濾光片(18)、二相色鏡或分光鏡(19)的支撐凸起物(64)。
8.根據(jù)權利要求I或4所述的一種多道熒光濾光器立方盒，其特征在于所述的激發(fā)濾光片(17)兩端的激發(fā)濾光片轉輪(29)、發(fā)射濾光片(18)兩端的發(fā)射濾光片轉輪(32)和二相色鏡或分光鏡(19)兩端的二相色鏡轉輪(35)分別與電機轉動軸相連。
9.根據(jù)權利要求I或4所述的一種多道熒光濾光器立方盒，其特征在于激發(fā)濾光片組帶有計算機可以自動識別的標定相應濾片的標(41);發(fā)射濾光片組帶有計算機可以自動識別的標定相應濾片的標記；二相色鏡或分光鏡組帶有計算機可以自動識別的標定相應濾片/分光鏡的標記。
10.根據(jù)權利要求9所述的一種多道熒光濾光器立方盒，其特征在于所述的標記為條形碼或磁條。
11.根據(jù)權利要求I所述的一種多道熒光濾光器立方盒，其特征在于所述的發(fā)射濾光片組中包含一個空白透通孔，允許發(fā)射光源的所有頻率成分未經(jīng)任何修改地通過。
12.根據(jù)權利要求4所述的一種多道熒光濾光器立方盒，其特征在于所述的二相色鏡或分光鏡組包含一個空白透通孔，不對任何入射的激發(fā)光進行反射，只是允許從樣品來的光全部透過。
13.根據(jù)權利要求I所述的一種多道熒光濾光器立方盒，其特征在于所述的激發(fā)濾光片組包含的濾片為窄帶帶通濾片，濾片組的峰值透過濾覆蓋300納米到750納米，單個激發(fā)濾光片直徑在10毫米到40毫米之間，一般選擇25毫米；在短波段即λ < 600納米，單個激發(fā)濾光片(17)的峰值透過率中心波長是逐漸遞增的，一個激發(fā)濾光片與相鄰激發(fā)濾光片(17)的峰值透過率中心波長的差值的絕對值大于或等于5納米，濾片組包含2-46個激發(fā)濾光片(17)。
14.根據(jù)權利要求I所述的一種多道熒光濾光器立方盒，其特征在于所述的發(fā)射濾光片組包含的濾片為窄帶帶通濾片，濾片組的峰值透過濾覆蓋380納米到780納米，單個發(fā)射濾光片直徑在10毫米到40毫米之間，一般選擇25毫米；在短波段即λ ( 600納米，單個發(fā)射濾光片(18)的峰值透過率中心波長是逐漸遞增的，一個發(fā)射濾光片與相鄰發(fā)射濾光片的峰值透過率中心波長的差值的絕對值大于或等于5納米，發(fā)射濾光片組包含2-41個發(fā)射濾光片(18)。
15.根據(jù)權利要求4所述的一種多道熒光濾光器立方盒，其特征在于所述的分光鏡組包含的分光鏡為長波通過短波反射分光鏡，二相色相鏡組或分光鏡組發(fā)射與透過分界波長覆蓋300納米到750納米，單個分光鏡片邊長在10毫米到40毫米之間，一般選擇26毫米χ36毫米矩形分光鏡；在短波段即λ < 600納米，單個二相色鏡或分光鏡(19)的發(fā)射與透過分界波長是逐漸遞增的，一個二相色鏡或分光鏡(19)與相鄰二相色鏡或分光鏡(19)發(fā)射與透過分界波長的差值的絕對值大于或等于5納米，分光鏡組包含高達2-46個分光鏡片。
專利摘要一種多道熒光濾光器立方盒,包括包含激發(fā)濾光片組、發(fā)射濾光片組、二相色鏡或分光鏡，激發(fā)濾光片與發(fā)射濾光片分別固定于立方盒相鄰的兩個垂直平面上，二相色鏡或分光鏡位于激發(fā)濾光片與發(fā)射濾光片之間45度的夾角面上，在立方盒與發(fā)射濾光片的相對面上開有孔，其要點在于所述的激發(fā)濾光片組由至少兩片激發(fā)濾光片等距離鑲嵌在底襯上,底襯的兩端固定于轉輪上，所述的發(fā)射濾光片組由至少兩片發(fā)射濾光片等距離鑲嵌在底襯上，底襯的兩端固定于轉輪上。本實用新型可以在較小體積內很容易實現(xiàn)大量的濾片的存儲，能夠對多于10種熒光團進行觀察，使用多道熒光濾光器立方盒的熒光成像設備可以既對空間高分辨率成像，還可以對光譜高分辨率成像。
文檔編號G01N21/64GK202522517SQ20122013547
公開日2012年11月7日 申請日期2012年4月1日 優(yōu)先權日2012年4月1日
發(fā)明者孔令華 申請人:孔令華