專利名稱：檢測硝基呋喃類藥物殘留的膠體金試紙卡的制作方法
技術領域：
本實用新型屬于獸藥殘留的免疫化學速測技術領域，具體涉及一種檢測試紙卡。
背景技術：
硝基呋喃類藥物是人工合成的具有5-硝基 呋喃基本結構的廣譜抗菌藥物，主要是指呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因，硝基呋喃類藥物因有非常好的抗菌作用和藥動力學的特性，曾經被廣泛應用，并作為禽類、水產和豬的促生長添加劑。但在長時間的實驗研究過程中發(fā)現，硝基呋喃類藥物和代謝物均可以使實驗動物發(fā)生癌變和基因突變，因此此類藥物禁止在治療和飼料中使用。用來檢測呋喃妥因代謝物的最常用方法是HPLC，LC-MS和LC-MS/MS，由于復雜的儀器設備和繁瑣的過程，不適合現場監(jiān)控和大量樣本篩查。

實用新型內容本實用新型的目的在于針對上述不足提供一種敏感度高、成本低、操作簡單、檢測時間短的試紙卡。本實用新型的試紙卡包括底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜和吸水墊，與常規(guī)試紙卡不同的是，其中的結合物釋放墊不是完全覆蓋在樣品吸收墊之下，而是部分區(qū)域覆蓋于樣品吸收墊之下，優(yōu)選結合物釋放墊的二分之一至三分之一區(qū)域覆蓋于樣品吸收墊之下。這樣做的好處是可以延長檢測結果觀察時間，樣品吸收墊也可以將檢測液體充分吸收與金標抗體完全接觸充分反應，再層析至反應膜上進行反應，可以有效的減少誤差。還可以防止檢測樣本中一些干擾成份使金標抗體中的蛋白失去活性，影響金標抗體與包被原的結合。所述反應膜上分別包被有硝基呋喃類藥物半抗原-載體蛋白偶聯物構成的檢測線印跡“ I ”和包被羊抗鼠IgG構成的質控線印跡“ I ”。從而可以用于硝基呋喃類藥物殘留的檢測。本實用新型試紙卡的底板為可PVC板或者是其它硬質而不吸水的材料；反應膜可為硝酸纖維素膜或者醋酸纖維素膜；樣品吸收墊可由玻璃棉或聚酯材料制成；結合物釋放墊可由纖維制成，結合物釋放墊層包被有抗體-膠體金結合物。在樣品吸收墊與結合物釋放墊及吸水層上覆蓋有保護膜，在玻璃棉和纖維層一側約O. 4cm處噴制樣品標記線。偶聯硝基呋喃類藥物載體蛋白可用卵血清蛋白、或人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血藍蛋白等，在反應膜上的檢測線印跡和質控線的對照印跡組合排列可為“ 11 ”本實用新型試紙卡具有如下有益效果I.特異性強，敏感度高。硝基呋喃類藥物快速檢測試紙卡以膠體金標記高親和力的單克隆為基礎制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無價健形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結合，膠體金對單克隆特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率。因此，快速檢測試紙卡具有較高的特異性和敏感性。對飼料中呋喃唑酮檢測靈敏度為5μ g/kg ;對飼料中呋喃它酮檢測靈敏度為3 μ g/kg ;對飼料中呋喃西林檢測靈敏度為
2μ g/kg ;對飼料中呋喃妥因檢測靈敏度為2 μ g/kg。2.操作簡便快速。使用快速檢測試紙卡時無需任何其它試劑，只要將樣品用滴管滴入試劑卡孔內，滴加3滴(約100微升)，加后計時，5 8min內觀察結果。3.顯示檢測結果形象、直觀準確?？焖贆z測試紙卡以顯示紅線色“ I ”及“ I I ”印跡作為檢測線的陽性和陰性標記，即在硝酸纖維素膜上顯示一條紅線“ I ”印跡表示在被檢測樣品液中含有硝基呋喃類藥物，兩條紅線“ 11 ”印跡表示在被檢測樣品中不含硝基呋喃類藥物，結果判定形象、直觀、準確、簡單明了，不容易出現陰性和假陽性誤判。4.成本低，投資少。使用快速檢測試紙條，不需另配儀器設備及其他試劑，使現場檢測一步到位，成本低廉，投資少，見效快。 5.易于大范圍推廣應用。快速檢測試紙卡操作簡單，人人都操作，能較好滿足不同層次人員的需要，如專業(yè)化驗、海關檢疫、衛(wèi)生防疫、質量監(jiān)測、動物產品加工、集化養(yǎng)殖到個體養(yǎng)殖等，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。

圖I為硝基呋喃類藥物快速檢測試紙卡結構示意圖，其中，I、樣品吸收墊；2、結合物釋放墊；3、反應膜；4、吸水墊；5、檢測線；6、質控線；7、底板；圖2為硝基呋喃類藥物快速檢測試紙卡俯視結構不意圖，其中8_1和8_2是覆蓋在試紙卡兩端的保護膜，9為標記線；圖3為硝基呋喃類藥物快速檢測試紙卡陰性(圖3. a)、陽性(圖3. b)、無效(圖
3.c)顯色示意圖，其中T質控區(qū)，C為檢測區(qū)。
具體實施方式
實施例I試紙卡的組裝參見圖I、圖2 :樣品吸收墊I用玻璃棉制成，結合物釋放墊層2為吸附有硝基呋喃類藥物單克隆抗體-膠體金標記物的纖維層，反應膜層3，采用硝酸纖維素膜，吸水墊4為吸水材料層制成，5為檢測區(qū)包被有硝基呋喃類藥物-載體蛋白偶聯物，6為質控區(qū)包被有羊抗鼠IgG構成質控線，底板7為PVC背襯，用塑料薄片條制成，在PVC背襯上按順序粘附硝酸纖維素膜、吸水墊、結合物釋放墊和樣本墊，將樣本墊覆蓋在結合物釋放墊三分之一處，8-1為白色保護膜，覆蓋在樣品吸收墊和結合物釋放墊上，在樣品吸收墊和結合物釋放墊交界處對應保護膜8-1位置偏向于樣品吸收墊一方O. 5cm處印有標記線9，9的右端印有箭頭及max字樣，濾紙層4即為吸水層(手柄端)上覆蓋有淺藍色保護膜8-2。要制成硝基呋喃類藥物快速檢測試紙卡首先需制備偶聯硝基呋喃類藥物載體蛋白，制備檢測線，制備膠體金，用于制備金標抗體纖維，其次須制備羊抗鼠IgG抗體，用于制作質控線。以下是相關材料的制備方法I.硝基呋喃類藥物半抗原的合成取1.41g 2-醛基-5-硝基呋喃與2. 0-3. Og氨基丁酸溶入150ml甲醇中，加入
5-10ml三乙胺，室溫下反應10-20小時，稀鹽酸酸化，乙酸乙酯萃取，蒸除溶劑后柱層析得到硝基呋喃類藥物半抗原。2.包被原的制備-硝基呋喃類藥物半抗原與卵清蛋白偶聯物的合成取步驟I)制備的到半抗原18mg,溶解于I. 5mL DMF中；取36mg EDC用O. 2ml水充分溶解后于加入上述DMF中，室溫下攪拌24h，得到A液；稱取0VA60mg，使之充分溶解在
5.3mLPBS (PH7. 2)中，得到B液；將上述得到的A液逐滴緩慢滴加到B液中，并于室溫下攪拌24h ;用O. 01mol/LPBS,4°C透析3d每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質，分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?、免疫原的制備取步驟I)制備的半抗原25mg，溶解于I. 5mL DMF中，取50mg EDC用O. 2ml水充分溶解后于加入上述DMF中，室溫下攪拌24h，即可得到反應液C ;稱取BSA60mg，使之充分溶解在4. 3mL PBS (PH 7. 2)中，得到D液；將反應液C逐滴緩慢滴加到D液中，并于室溫下攪拌24h,用O. Olmol/IPBS 4°C透析3d每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質，分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?.硝基呋喃類藥物-載體蛋白偶聯物的鑒定將載體蛋白、硝基呋喃類藥物半抗原、硝基呋喃類藥物-載體蛋白偶聯物用PH7. 4的PBS配成O. 5mg/ml的溶液，以O. Olmol/L pH7. 4PBS調零，用紫外分光光度計在波長200-800nm范圍內掃描，得到載體蛋白、硝基呋喃類藥物半抗原、硝基呋喃類藥物-載體蛋白偶聯物的吸收曲線。三者出現不同的吸收曲線，表明硝基呋喃類藥物與載體蛋白偶聯成功。5.抗硝基呋喃類藥物單克隆抗體的制備5. I動物免疫將免疫原注入到Balb/c小鼠體內，免疫劑量為80 μ g/只，使其產生多克隆抗體。細胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按5 I比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA法測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直接到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。5. 2細胞凍存和復蘇將硝基呋喃類藥物單克隆雜交瘤細胞株用凍存液制成I X IO8個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)。5. 3單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油O. 4ml/只，7天后腹腔注射硝基呋喃類藥物單克隆雜交瘤細胞株5X IO5個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，純化后的腹水放入_20°C環(huán)境保存。6.硝基呋喃類藥物單克隆抗體和膠體金標記物的制備膠體金的制備用雙蒸去離子水將I %氯金酸稀釋成O. 01%，置磁力加熱棒攪拌器上攪拌煮沸，每IOOml 0.01%氯金酸加入21111 I %檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，至液體呈紅色時停止加熱，冷卻至室溫后補足失水。制備好的膠體金外觀應純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期為一個月。[0040]硝基呋喃類藥物單克隆抗體-膠體金標記物的制備在磁力攪拌下，用O. lmol/L碳酸鉀調膠體金的pH值至8. 2，按每毫升膠體金溶液加入50-100 μ g抗體加入硝基呋喃類藥物抗體，繼續(xù)攪拌混勻30min，加入10% BSA至終濃度為I %，靜置30min。12000rpm、4°C離心30min，棄上清液，沉淀用復溶緩沖液洗滌兩次，用初始膠體金體積1/20的復溶緩沖液將沉淀重懸，置4°C備用，保存60天。復溶緩沖液用含牛血清白蛋白(BSA)O. 02 O. I %，吐溫-200. 05 0.2%，PVP-300吡咯烷酮O. 3%,O. 02mol/L pH9. O的硼酸復溶緩沖液。7.羊抗鼠IgG抗體的制備羊抗鼠抗抗體的制備以山羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體山羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。8.硝基呋喃類藥物快速檢測試紙卡實施檢測原理當硝基呋喃類藥物檢測試紙卡樣品墊端滴加待測樣品溶液后，待檢溶液通過金標抗體棉中的金標抗體一起向反應膜擴散，并最終滲入濾紙中，擴散過程中檢測硝基呋喃類藥物可與金標抗體相結合，進而封閉金抗體上硝基呋喃類藥物的抗原結合點，阻止金標抗體與反應膜上偶聯硝基呋喃類藥物半抗原-載體蛋白的檢測印跡結合，不能顯示檢測印跡，而羊抗鼠IgG抗體則可與金標抗體結合，質控區(qū)顯色，形成一條紅色對照印跡“ I ”，呈一條印跡為陽性，相反樣本溶液中無硝基呋喃類藥物則不能阻止金標抗體與纖維素膜上偶聯硝基呋喃類藥物的載體蛋白檢測印跡結合，檢測區(qū)顯示紅色印跡“ I ”，同樣羊抗鼠IgG抗體也與金標抗體結合，質控區(qū)也顯示紅色對照印跡“ I ”，形成兩條紅線“ 11 ”陰性標記，如果纖維素膜上沒有紅色標記顯示，則試紙卡無效。9.硝基呋喃類藥物快速檢測試紙卡檢測實施列操作方法9. I樣本前處理稱取I. 0±0· 05g飼料樣品至聚苯乙烯離心管中，加入5_15ml 50%的甲醇水溶液(量取50ml甲醇和50ml去離子水混勻備用)渦動，靜置，取上清液用于檢測。9. 2用試紙卡檢測將樣品用滴管滴入試劑卡孔內，滴加3滴，加后計時，5 8min內觀察結果。超過IOmin樣品檢測判讀無效。9. 3檢測結果分析硝基呋喃類藥物在樣品中濃度高于試紙的樣本最低檢測限時，膠體金抗體與硝基呋喃類藥物結合，從而在檢測區(qū)內因為競爭反應不會與硝基呋喃類藥物半抗原-偶聯物結合而不出現紅色條帶，呈陽性。陰性樣品在檢測過程中由于缺少抗體抗原競爭反應，將會在檢測區(qū)與質控區(qū)內出現紅色條帶。陽性；當質控區(qū)顯示一條紅色條帶，而檢測區(qū)不顯色，快速檢測試紙卡以顯示紅線色“ I ”，判為陽性，如圖3中間圖所示。陰性當質控區(qū)顯示一條紅色條帶，檢測區(qū)同時也顯示出一條紅色條帶，且檢測區(qū)顏色接近或淺于質控區(qū)時，快速檢測試紙卡以顯示紅線色為“ 11 ”，判為陰性，如圖3左圖所
/Jn ο無效當質控區(qū)不顯示出紅色條帶，則無論檢測區(qū)顯示出紅色條帶與否，該試紙卡判為無效，如圖3右圖所示。
權利要求1.一種檢測硝基呋喃類藥物殘留的膠體金試紙卡，包括底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜和吸水墊，其特征在于，結合物釋放墊的二分之一至三分之一區(qū)域覆蓋于樣品吸收墊之下。
2.如權利要求I所述的試紙卡，其特征在于，結合物釋放墊的三分之一區(qū)域覆蓋于樣品吸收墊之下。
3.如權利要求I或2所述的試紙卡，其特征在于，在試紙卡的兩端分別覆蓋有保護膜。
4.如權利要求I或2所述的試紙卡，其特征在于，所述底板為PVC板，所述反應膜為硝酸纖維素膜。
5.如權利要求I或2所述的試紙卡，其特征在于，所述的樣品吸收墊由玻璃棉或聚酯材料制成。
6.如權利要求I或2所述的試紙卡，其特征在于，所述的結合物釋墊層由纖維制成。
專利摘要本實用新型提供了一種檢測試紙卡，包括底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、結合物釋放墊、反應膜和吸水墊，結合物釋放墊的部分區(qū)域覆蓋于樣品吸收墊之下。在反應膜層上具備包被有硝基呋喃類藥物半抗原-載體蛋白偶聯物構成的檢測線和包被有羊抗鼠IgG構成質控線；結合物釋放墊包被有硝基呋喃類藥物單克隆抗體的膠體金標記物。采用本實用新型試紙卡是可以延長檢測結果觀察時間，樣品吸收墊也可以將檢測液體充分吸收與金標抗體完全接觸充分反應，再層析至反應膜上進行反應，可以有效的減少誤差。還可以防止檢測樣本中一些干擾成份使金標抗體中的蛋白失去活性，影響金標抗體與包被原的結合。
文檔編號G01N33/558GK202720228SQ20122013829
公開日2013年2月6日 申請日期2012年4月1日 優(yōu)先權日2012年4月1日
發(fā)明者何方洋, 萬宇平, 陶光燦, 孫震, 崔海峰, 馮靜, 余厚美, 何麗霞, 田甜, 湯慶彩 申請人:北京勤邦生物技術有限公司