專利名稱：小鼠聚集蛋白聚糖酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及ー種小鼠聚集蛋白聚糖酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒。
背景技術(shù)：
聚集蛋白聚糖酶在關(guān)節(jié)軟骨破壞中起重要的作用，對(duì)聚集蛋白聚糖酶I和聚集蛋白聚糖酶-2的雙重抑制能布效防止關(guān)節(jié)軟骨的破壞。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、白介素-1、腫瘤壞死因子-α活化T細(xì)胞核因子、轉(zhuǎn)錄因子Runx、制瘤素M、lxB激酶抑制物、金屬蛋白酶抑制物、a2巨球蛋白、環(huán)孢素、雷公藤內(nèi)酷、n-3脂肪酸和血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域単元等。聚集蛋白聚糖酶(aggrecanase)屬于帶有血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域單元的裂解素和金屬蛋白酶家族，目前已經(jīng)明確的聚集蛋白酶聚糖酶包括聚集蛋白聚糖酶-l(ADAMTS-4)、聚集蛋白聚糖酶-2(ADAMTS-5)和ADAMTS-8。聚集蛋白聚糖為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的主要成分之一,通常認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)在關(guān)節(jié)軟骨的破壞中起決定性的作用。聚集蛋白聚糖的降解酶主要為MMPs和聚集蛋白聚糖酶。近年研究發(fā)現(xiàn)，在骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis)軟骨破壞中，聚集蛋白聚糖酶引起的關(guān)節(jié)軟骨破壞比MMPs引起的聚集蛋白聚糖核心蛋白降解大約提前3周，同時(shí)抑制聚集蛋白聚糖酶-I和聚集蛋白聚糖酶_2能有效防止關(guān)節(jié)軟骨破壞?；谛∈箨P(guān)節(jié)炎模型的研究結(jié)果，證明無(wú)論在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中，取出ADAMTS-5(聚集蛋白聚糖酶-2)活性都能對(duì)抗聚集蛋白聚糖降解與保護(hù)軟骨作用，而去除ADAMTS-4并不能終止軟骨的破壞。這兩項(xiàng)研究結(jié)果有力地支持了在關(guān)節(jié)炎疾病的軟骨破壞中，聚糖蛋白聚糖酶_2才是主要的聚集蛋白聚糖酶。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供ー種小鼠聚集蛋白聚糖酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，包括盒蓋、內(nèi)部的酶標(biāo)板和盒體，其中酶標(biāo)板包括固相載體和包被層，其特征在干所述固相載體為設(shè)置有多個(gè)微孔的微孔板，所述包被層附著在所述固相載體的微孔表面。優(yōu)選的，上述固相載體為96孔聚苯こ烯試劑板。優(yōu)選的，上述包被層包被小鼠聚集蛋白聚糖抗體。優(yōu)選的，上述酶標(biāo)板為透明酶標(biāo)包被板。優(yōu)選的，上述固相載體為12孔X8條。本試劑盒采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本加入到預(yù)先包被小鼠聚集蛋白聚糖(Agc)抗體透明酶標(biāo)包被板中，溫育足夠時(shí)間后，洗滌除去未結(jié)合的成分，再加入酶標(biāo)工作液，溫育足夠時(shí)間后，洗滌除去未結(jié)合的成分。依次加入底物A、B，底物(TMB)在辣根過氧化物酶(HRP)催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物，在酸的作用下變成黃色，顔色的深淺與樣品中小鼠聚集蛋白聚糖(Agc)濃度呈正相關(guān)，450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值，計(jì)算樣本中小鼠聚集蛋白聚糖(Agc)含量。

圖I是本實(shí)用新型酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本實(shí)用新型試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。圖中1_固相載體；2-微孔；3_包被層；4-盒蓋；5_酶標(biāo)板；6-盒體。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)ー步描述。本實(shí)用新型提供的小鼠聚集蛋白聚糖酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒制備的主要的技術(shù)路線如下本試劑盒應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)抑制酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定血清或血漿樣本中Agc的水平。制備過程如下使用96孔聚苯こ烯試劑板(PS)作為固相載體，先將其置于紫外光下輻照2小時(shí)，使PS板活化。在試劑板微孔條上預(yù)先包被一定濃度的Agc，4°C過夜，經(jīng)洗板及牛血清白蛋白封閉處理后制成包被好的酶標(biāo)板。檢測(cè)時(shí)，依次加入待測(cè)標(biāo)本及生物素化的Agc抗體，形成酶標(biāo)板上包被的Agc和標(biāo)本中的Agc競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗Agc抗體的局面，再通過親和素化辣根過氧化物酶(HRP)放大信號(hào)，以3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)及硫酸分別作為底物及終止液，完成人Agc的ELISA試劑盒的制備。ELISA試劑盒較RIA試劑盒有諸多優(yōu)點(diǎn)，通過與Phoenix Pharmaceuticals, Inc.生產(chǎn)的RIA試劑盒進(jìn)行比較，可見其操作更簡(jiǎn)單、無(wú)需特殊的實(shí)驗(yàn)條件且對(duì)環(huán)境和操作人員影響小，適用于普通實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。ELISA試劑盒與RIA試劑盒比較結(jié)果如表I所示。
ELISA試劑盒RIA試劑盒
樣本前處理_不需__抽提樣本中多肽
所需樣本量50ulIml
操作時(shí)間5小時(shí)2天
靈敏度6.8pg/ml3 lpg/ml
權(quán)利要求1.一種小鼠聚集蛋白聚糖酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，包括盒蓋(4)、內(nèi)部的酶標(biāo)板(5)和盒體￠)，其中酶標(biāo)板(5)包括固相載體(I)和包被層(3)，其特征在于所述固相載體(I)為設(shè)置有多個(gè)微孔的微孔板(2)，所述包被層(3)附著在所述固相載體(I)的微孔表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小鼠聚集蛋白聚糖酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，其特征是，所述固相載體(I)為96孔聚苯乙烯試劑板。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小鼠聚集蛋白聚糖酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，其特征是，所述包被層(3)包被小鼠聚集蛋白聚糖抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小鼠聚集蛋白聚糖酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，其特征是，所述酶標(biāo)板(5)為透明酶標(biāo)包被板。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小鼠聚集蛋白聚糖酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，其特征是，所述固相載體⑴為12孔X8條。
專利摘要本實(shí)用新型提供了一種小鼠聚集蛋白聚糖酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒，包括盒蓋(4)、內(nèi)部的酶標(biāo)板(5)和盒體(6)，其中酶標(biāo)板(5)包括固相載體(1)和包被層(3)，所述固相載體(1)為設(shè)置有多個(gè)微孔的微孔板(2)，包被層(3)附著在所述固相載體(1)的微孔表面。本試劑盒采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法將標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本加入到預(yù)先包被小鼠聚集蛋白聚糖(Agc)抗體透明酶標(biāo)包被板中，溫育足夠時(shí)間后，洗滌除去未結(jié)合的成分，再加入酶標(biāo)工作液，溫育足夠時(shí)間后，洗滌除去未結(jié)合的成分。依次加入底物，在辣根過氧化物酶(HRP)催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物，在酸的作用下變成黃色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值，計(jì)算樣本中小鼠聚集蛋白聚糖(Agc)含量。
文檔編號(hào)G01N33/545GK202583198SQ20122024732
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月30日
發(fā)明者勵(lì)娟青 申請(qǐng)人:勵(lì)娟青