專利名稱：1型糖尿病自身抗體譜檢測試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于糖尿病血清學(xué)診斷領(lǐng)域，特別涉及一種I型糖尿病自身抗體譜檢測試紙。
背景技術(shù)：
糖尿病(DM)是一組由于胰島素分泌缺陷，或胰島素作用缺陷，或二者兼之所引起的以高血糖為特征的代謝疾病，目前分為四型1 型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)、特殊類型糖尿病和妊娠糖尿病。其中I型和2型糖尿病最常見，因兩者的病因?qū)W和發(fā)病機(jī)理不同，其臨床防治措施也有所不同，故目前國際和國內(nèi)糖尿病防治指南仍規(guī)定需予區(qū)分。I型糖尿病(TlDM)主要由于胰島β細(xì)胞自身免疫性破壞導(dǎo)致胰島素絕對缺乏引起，其特征表現(xiàn)為外周血中出現(xiàn)針對胰島β細(xì)胞相關(guān)分子的自身抗體。這些自身抗體作為免疫學(xué)監(jiān)測指標(biāo)，使血清學(xué)分型診斷成為可能。事實(shí)上目前已有4種自身抗體常規(guī)應(yīng)用于臨床TlDM的診斷一胰島細(xì)胞抗體(ICA)、胰島素自身抗體(ΙΑΑ)、谷氨酸脫羧酶抗體(GADA )、蛋白酪氨酸磷酸酶抗體(I A— 2Α )。ICA是應(yīng)用最早的TlDM免疫學(xué)標(biāo)志，在新發(fā)糖尿病中陽性率為70%_90%，但隨病程延長而診斷價值下降較快是其致命的缺陷，病程2-5年患者陽性率僅20%。IAA在TlDM的兒童中出現(xiàn)早，隨年齡增長陽性率下降，各類研究顯示在成人中一般都低于40%，其檢測還會受到因使用外源性胰島素注射治療而產(chǎn)生的胰島素抗體的干擾。GADA在TlDM發(fā)病前期和發(fā)病時的陽性率較高為60%-80%，而在T2DM中僅為3. 2%。該抗體在體內(nèi)存在時間較長，甚至在診斷10 20年仍可檢出。ΙΑ-2Α存在于55%-75%的新發(fā)TlDM患者，在正常對照人群陽性率僅為1%，同時其陽性率隨病程延長變化較小，抗體水平在初診后的6年中下降輕微，具有較好的檢測價值。但GADA和ΙΑ-2Α并非胰島細(xì)胞高度特異，在其他自身免疫性疾病如甲狀腺相關(guān)疾病、風(fēng)濕類疾病中也可以檢測到。近年來發(fā)現(xiàn)的一種定位于胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素分泌顆粒膜上的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體8(ZnTS)蛋白具有高度β細(xì)胞特異性，對胰島素的合成、儲存和分泌具有調(diào)控作用，其自身抗體已被認(rèn)定為一個重要的獨(dú)立的TlDM免疫標(biāo)志物。ΖηΤ8Α最早可在處于糖尿病前期的2歲兒童中檢出，其滴度隨病程進(jìn)展呈上升趨勢，在晚青春期新發(fā)TlDM患者中達(dá)峰值。在長病程的成年患者中檢出率優(yōu)于GADA、ΙΑ-2Α。2007年Wenzlau等學(xué)者報道了利用放射免疫法對223例新發(fā)TlDM血清樣本的檢測結(jié)果，60% 80%的患者ΖηΤ8Α陽性，而在健康對照組中〈2%，在2型糖尿病組中〈3 %。更難得的是ΖηΤ8Α在上述其他自身抗體陰性的患者中仍有26%的檢出率。由此可見單一自身抗體的檢測價值十分有限。一個不爭的事實(shí)是，聯(lián)合檢測多種抗體可提高敏感性、特異性和準(zhǔn)確度。而自身抗體陽性的種類數(shù)對于預(yù)測發(fā)病較單一抗體的滴度更有意義。現(xiàn)有的組合檢測IAA、GADA和ΙΑ-2Α可以使診斷率提高到94%，將ΖηΤ8Α加入到組合檢測后可以使自身抗體陽性個體的數(shù)量增加到98%，同時使兩種或多種自身抗體陽性個體的數(shù)量上升到82%。雖然組合檢測能夠提高檢出率，但因檢測技術(shù)的手段和方法不一樣，或即使一樣也存在孔間、板間或批間差異，無法同時同一批檢測等不一致因素造成的誤差增加而影響檢測效能。現(xiàn)有血清學(xué)檢測技術(shù)中，最常采用的是ELISA法、放射免疫法以及化學(xué)發(fā)光法。ELISA法常用于單一自身抗體的檢測，而且操作過程復(fù)雜，單個指標(biāo)檢測需要4小時以上，結(jié)果判斷利用酶促瀑布效應(yīng)間接判斷而正確性差，同時需要價格昂貴的酶標(biāo)儀等實(shí)驗(yàn)室非通用設(shè)備。放射免疫法同樣常用于單一自身抗體的檢測，單個指標(biāo)檢測也需要2-4小時，還需要價格昂貴的R-計數(shù)器等專用設(shè)備，且存在放射性衰減和污染。前者導(dǎo)致需制備質(zhì)控曲線而增加操作復(fù)雜性并影響檢測準(zhǔn)確，同時使試劑盒貨架時間短。后者涉及人身安全和環(huán)境污染問題?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測時間短且靈敏度高，但專用設(shè)備費(fèi)用高昂，且與上述兩種方法一樣仍是標(biāo)記方法的間接判讀結(jié)果，未引入分子量等更為客觀的結(jié)果判讀體系，檢測正確度不理想，對每種指標(biāo)的檢測需專供設(shè)計，如多種抗體的檢測存在檢測時間長、成本較高的問題，不利于基層臨床開展。近年來出現(xiàn)的金標(biāo)免疫層析法具有檢測快速，操作簡便，不需儀器設(shè)備等多方面 的優(yōu)點(diǎn)，可用于同時一次檢測樣品中的多種抗體，為聯(lián)合檢測I型糖尿病自身抗體帶來了機(jī)遇。常見的金標(biāo)試紙的排列順序依次為樣品區(qū)、金標(biāo)區(qū)、檢測區(qū)、吸水區(qū)，檢測區(qū)依次平行畫有檢測線，檢測線的長度與試紙寬度一致，當(dāng)采用間接法原理檢測多種抗體時其缺點(diǎn)在于①滴加血清到樣品區(qū)，層析至金標(biāo)區(qū)使膠體金標(biāo)記抗體復(fù)融，待測物與膠體金標(biāo)記抗體結(jié)合后一起向檢測區(qū)層析，但是由于血清中的非特異性IgG競爭結(jié)合膠體金標(biāo)記抗體的干擾，造成膠體金標(biāo)記抗體的非目的性消耗，導(dǎo)致靈敏度下降；②由于金標(biāo)墊中的膠體金標(biāo)記抗體含量一定，當(dāng)其與第一條檢測線形成復(fù)合物后，剩余的膠體金標(biāo)記抗體再與下一條檢測線反應(yīng)時因濃度下降而造成靈敏度降低。尤其當(dāng)前一條檢測線呈強(qiáng)陽性反應(yīng)時，因大量膠體金標(biāo)記抗體的消耗導(dǎo)致位置靠前的檢測線顯色深，位置靠后的檢測線顯色淺或不顯色，易導(dǎo)致假陰性的發(fā)生。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供一種I型糖尿病自身抗體“譜”檢測試紙，該檢測試紙能夠一次同時聯(lián)合檢測上述五種糖尿病自身抗體，克服了上述檢測方法的缺陷，誤差小而檢測效能提高，無需專用儀器設(shè)備，操作簡便，結(jié)果判讀直觀，費(fèi)用低廉而便于推廣。本實(shí)用新型的技術(shù)方案如下一種I型糖尿病自身抗體譜檢測試紙，包括基板，沿基板縱向依次排列粘貼有緩沖液加入墊，膠體金標(biāo)記物墊、樣品墊、層析膜、吸收墊，吸收墊上沿基板橫向排列設(shè)置有與五種抗原檢測線相對應(yīng)的標(biāo)識區(qū)，所述層析膜上設(shè)置有質(zhì)控線和與標(biāo)識區(qū)對應(yīng)的五種抗原檢測線，五種抗原檢測線呈線段沿基板橫向排列成直線，各種抗原檢測線之間不相連，所述質(zhì)控線位于抗原檢測線與標(biāo)識區(qū)之間。所述五種抗原檢測線分別包被有ICA對應(yīng)抗原、GADA對應(yīng)抗原、IAA對應(yīng)抗原、ΙΑ—2A對應(yīng)抗原、ZnT8A對應(yīng)抗原。質(zhì)控線上包被有膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體。上述技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別在于I.由于樣品墊位于層析膜之前，樣品先與檢測線反應(yīng)，避免了樣品先與膠體金標(biāo)記物墊反應(yīng)過程中非特異性IgG競爭結(jié)合膠體金標(biāo)記抗體的干擾，減少了膠體金標(biāo)記抗體的非目的性消耗，提高了檢測靈敏度；2.五種抗原檢測線呈線段沿基板橫向排列成直線，各種抗原的檢測線之間不相連，避免了因檢測線依次重疊排列而導(dǎo)致的隨反應(yīng)進(jìn)程的進(jìn)行致靈敏度逐漸下降的不利因素，減少了假陰性的發(fā)生。3.層析膜上的抗原檢測線包被的五種抗原為ICA對應(yīng)抗原、GADA對應(yīng)抗原、IAA對應(yīng)抗原、ΙΑ—2A對應(yīng)抗原、ZnT8A對應(yīng)抗原，即為ICA檢測線、GADA檢測線、IAA檢測線、ΙΑ—2Α檢測線、ΖηΤ8Α檢測線，可以在同樣條件下一次同時聯(lián)合檢測五種糖尿病自身抗體。所述吸收墊上與檢測線對應(yīng)的標(biāo)識區(qū)內(nèi)標(biāo)注有待測抗體的名稱，便于結(jié)果讀取。本實(shí)用新型所述試紙克服了背景技術(shù)所述的因檢測技術(shù)的手段和方法不一樣，或即使一樣也存在孔間、板間或批間差異，無法同時同一批檢測等不一致因素造成的誤差增加的缺陷。因此，本實(shí)用新型所述試紙檢測效能提高。 采用本實(shí)用新型所述檢測試紙開展檢測，無需專用儀器設(shè)備，結(jié)果判讀直觀，費(fèi)用低廉而便于推廣。
以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本實(shí)用新型作進(jìn)一步的說明。

圖I為本實(shí)用新型I型糖尿病自身抗體譜檢測試紙實(shí)施例的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
參見圖1，1型糖尿病自身抗體譜檢測試紙，包括基板，沿基板縱向依次排列粘貼有緩沖液加入墊，膠體金標(biāo)記物墊、樣品墊、層析膜、吸收墊，其中，基板采用塑料板，緩沖液加入墊I、膠體金標(biāo)記物墊2、樣品墊3由玻璃纖維材料或其他纖維材料制成，層析膜4由硝酸纖維膜制成，吸收墊5由吸水性強(qiáng)的濾紙制成。膠體金標(biāo)記物墊2內(nèi)吸附有金標(biāo)抗人IgG，本實(shí)施例中采用的是金標(biāo)兔抗人IgG。吸收墊上沿基板橫向排列設(shè)置有與五種抗原檢測線相對應(yīng)的標(biāo)識區(qū)，所述層析膜上設(shè)置有質(zhì)控線和與標(biāo)識區(qū)對應(yīng)的五種抗原檢測線，五種抗原檢測線呈線段沿基板橫向排列成直線，各種抗原檢測線為等長線段，各種抗原檢測線之間不相連。所述層析膜上的抗原檢測線41與抗原標(biāo)識區(qū)之間設(shè)置一條質(zhì)控線42，質(zhì)控線42沿基板橫向布置，質(zhì)控線上包被有膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體，本實(shí)施例中采用的是羊抗兔IgG。層析膜上的五種抗原檢測線分別包被有ICA對應(yīng)抗原、GADA對應(yīng)抗原、IAA對應(yīng)抗原、IA — 2A對應(yīng)抗原、ZnT8A對應(yīng)抗原，五種抗原檢測線自上而下依次排列為ICA檢測線、GADA檢測線、IAA檢測線、ΙΑ—2Α檢測線、ΖηΤ8Α檢測線。吸收墊5沿基板橫向排列設(shè)置有標(biāo)識區(qū)，自上而下分別標(biāo)注為ICA、GADA、IAA、IA — 2A、ZnT8A。使用時，先在樣品墊3滴加血清，然后向緩沖液加入墊加入I滴加緩沖液。反應(yīng)過程如下血清先從樣品墊3中向?qū)游瞿?層析。隨后緩沖液加入墊I中的緩沖液層析至膠體金標(biāo)記物墊2中，在復(fù)融金標(biāo)兔抗人IgG的同時沖向?qū)游瞿?，推動血清向?qū)游瞿?層析，使血清中的特異性抗體先與檢測線41中的對應(yīng)抗原結(jié)合，生成抗原一抗體復(fù)合物；緩沖液帶動金標(biāo)兔抗人IgG往右層析到檢測線41,金標(biāo)兔抗人IgG與抗原一抗體復(fù)合物反應(yīng)形成抗原一抗體一金標(biāo)抗體復(fù)合物，此時待測抗體對應(yīng)的檢測線41顯色；緩沖液帶動金標(biāo)兔抗人IgG繼續(xù)往右層析，到達(dá)質(zhì)控線42后與羊抗兔IgG反應(yīng)，此時質(zhì)控線42顯色；多余緩沖液繼續(xù)向右層析被吸收墊5吸收。 結(jié)果判讀若質(zhì)控線42顯色，同時檢測線41顯色則對應(yīng)的抗體為陽性，可通過吸收墊5上對應(yīng)標(biāo)識區(qū)標(biāo)注的抗體名稱判定是哪一種抗體；若質(zhì)控線42不顯色，則代表本次檢測無效或試紙失效。
權(quán)利要求1.一種I型糖尿病自身抗體譜檢測試紙，包括基板，沿基板縱向依次排列粘貼有緩沖液加入墊，膠體金標(biāo)記物墊、樣品墊、層析膜、吸收墊，其特征在于吸收墊上沿基板橫向排列設(shè)置有與五種抗原檢測線相對應(yīng)的標(biāo)識區(qū)，所述層析膜上設(shè)置有質(zhì)控線和與標(biāo)識區(qū)對應(yīng)的五種抗原檢測線，五種抗原檢測線呈線段沿基板橫向排列成直線，各種抗原檢測線之間不相連，所述質(zhì)控線位于抗原檢測線與標(biāo)識區(qū)之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的I型糖尿病自身抗體譜檢測試紙，其特征在于所述五種抗原檢測線分別包被有ICA對應(yīng)抗原、GADA對應(yīng)抗原、IAA對應(yīng)抗原、IA — 2A對應(yīng)抗原、ZnT8A對應(yīng)抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的I型糖尿病自身抗體譜檢測試紙，其特征在于質(zhì)控線上包被有膠體金標(biāo)記抗體的抗抗體。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種1型糖尿病自身抗體譜檢測試紙，包括基板，沿基板縱向依次排列粘貼有緩沖液加入墊，膠體金標(biāo)記物墊、樣品墊、層析膜、吸收墊，吸收墊上沿基板橫向排列設(shè)置有與五種抗原檢測線相對應(yīng)的標(biāo)識區(qū)，所述層析膜上設(shè)置有質(zhì)控線和五種抗原檢測線，五種抗原檢測線呈線段沿基板橫向排列成直線，各種抗原檢測線之間不相連，所述質(zhì)控線位于抗原檢測線與標(biāo)識區(qū)之間。該檢測試紙聯(lián)合1型糖尿病五種自身抗體在同樣條件下一次同時完成檢測，能夠減少分次檢測的差異，使多種自身抗體不同的診斷效能互補(bǔ)提升；能夠排除樣品血清中非特異性IgG的干擾；能夠克服因檢測線重疊排列引起的隨反應(yīng)進(jìn)程致靈敏度逐漸下降的缺陷。
文檔編號G01N33/558GK202631539SQ20122028891
公開日2012年12月26日 申請日期2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月19日
發(fā)明者陳兵, 李濤, 程立慶, 徐靜, 張玲 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院