專利名稱：Ngal檢測(cè)的上轉(zhuǎn)發(fā)光快速定量試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種基于上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)免疫層析快速、定量檢測(cè)NGAL試劑盒。
背景技術(shù)：
上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒(Up-Converting Phosphor, UCP)是一種可對(duì)能量進(jìn)行上轉(zhuǎn)的稀土金屬合成物，即UCP可吸收低能量的(長(zhǎng)波長(zhǎng))紅外光，但卻發(fā)出高能量的(短波長(zhǎng))可見(jiàn)光。UCP是由幾種稀土金屬元素參雜于某些晶體的晶格中構(gòu)成的。在這種材料中有三種主要的成分:主基質(zhì)、吸收子和發(fā)射子。作為主基質(zhì)的晶體材料有:氧硫化物(如Y202S、Gd02S、La2O2S等)、氟化物(如YF3、GdF3、LaF3等)、鎵酸鹽(如YGaO3'Y3Ga5O12等)以及硅酸鹽(YSi205、YSi3O7等)等；常用作吸收子的稀土金屬離子有:鐿離子(Yb3+)、鉺離子(Er3+)、釤離子(Sm3+)等；常用作發(fā)射子的稀土金屬離子有:鉺離子(Er3+)、欽離子(Ho3+)、銩離子(Tm3+)、鋱離子(Tb3+)等。吸收子和發(fā)射子這一離子對(duì)在主基質(zhì)晶格內(nèi)適宜的空間取向和距離，是產(chǎn)生上轉(zhuǎn)發(fā)光的基礎(chǔ)。上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒UCP所具有的這種獨(dú)特光學(xué)特性，使其在床邊快速診斷領(lǐng)域發(fā)揮巨大的潛能:(I)高度的靈敏性:獨(dú)有的上轉(zhuǎn)發(fā)光現(xiàn)象確保了 UCP在檢測(cè)過(guò)程中不存在來(lái)自外界的背景干擾；(2)高度的穩(wěn)定性:UCP的發(fā)光現(xiàn)象是產(chǎn)生于結(jié)構(gòu)內(nèi)部的純粹物理過(guò)程，因而完全避免了來(lái)自檢測(cè)樣品腐蝕及自身衰變導(dǎo)致的發(fā)光淬滅；(3)高度靈活性:UCP具有的可自由組合的多樣化特征光譜，使其適用于多重分析；(4)高度的安全性:無(wú)機(jī)惰性、紅外光激發(fā)、可見(jiàn)光發(fā)射使得基于UCP檢測(cè)對(duì)于檢測(cè)者、被檢測(cè)樣品、環(huán)境均無(wú)危害。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin, NGAL)是1993年在中性粒細(xì)胞內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn)的，與炎癥、胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答、趨化作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及多種腫瘤的發(fā)生于發(fā)展等過(guò)程相關(guān)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，NGAL蛋白在多種疾病發(fā)生過(guò)程中具有特異性表達(dá)變化的特點(diǎn)，使得NGAL成為檢測(cè)疾病的生物標(biāo)志物。近年美國(guó)臨床化學(xué)協(xié)會(huì)(AACC)年度會(huì)議的研究結(jié)果發(fā)表得知檢測(cè)尿中中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白可能有助于臨床醫(yī)生檢測(cè)心臟移植患者環(huán)孢霉素誘導(dǎo)的毒性，以及調(diào)節(jié)環(huán)孢霉素劑量以預(yù)防其對(duì)腎臟造成的不可逆?zhèn)?。中?guó)專利200580048175研究在急性腎衰竭(ARF)、急性腎小管壞死(ATN)和急性腎小管間質(zhì)性腎病(ATIN)發(fā)病的早期，尿液和血液中NGAL水平顯著增加，因此NGAL是早期檢測(cè)腎臟對(duì)缺血性損傷的標(biāo)志物。目前，檢測(cè)NGAL方法主要有酶聯(lián)免疫法(中國(guó)專利200810237423.X)、基于抗體免疫的微型柱測(cè)試法(中國(guó)專利200580048175)和膠乳免疫比濁法(中國(guó)專利20101036227.0)。酶聯(lián)免疫法操作容易受到酶活性變化的影響，結(jié)果不太準(zhǔn)確；膠乳比濁法反應(yīng)特異性不好，所需試劑比較復(fù)雜。因此，應(yīng)用上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析技術(shù)開(kāi)發(fā)NGAL快速檢測(cè)試劑應(yīng)用于床邊快速診斷具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本實(shí)用新型提供一種基于上轉(zhuǎn)發(fā)光法的測(cè)定NGAL免疫層析定量試劑盒，具有準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)。本實(shí)用新型的試紙條檢測(cè)原理是通過(guò)一系列表面修飾與活化，上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒UCP可與生物活性分子相結(jié)合，利用UPT生物傳感器，對(duì)在層析過(guò)程中通過(guò)特異免疫反應(yīng)結(jié)合于檢測(cè)區(qū)與質(zhì)控區(qū)上的UCP顆粒進(jìn)行掃描分析，從而利用由UPT快速定量檢驗(yàn)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)精確定量或定性。本實(shí)用新型的提供的技術(shù)方案是:一種NGAL檢測(cè)的上轉(zhuǎn)發(fā)光快速定量試劑盒，包括在底襯上依次粘貼的樣品墊、結(jié)合墊、分析膜和吸水紙，所述結(jié)合墊上包被有上轉(zhuǎn)發(fā)光UCP顆粒標(biāo)記的NGAL抗體I，所述分析膜上設(shè)有平行的檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測(cè)區(qū)包被有NGAL抗體II或NGAL抗原，所述質(zhì)控區(qū)包被有羊抗鼠IgG。所述上轉(zhuǎn)發(fā)光UCP顆粒的直徑為50_350nm。所述NGAL抗體I和NGAL抗體II為配對(duì)單抗或單抗-多抗配對(duì)。所述NGAL抗原為人NGAL。本實(shí)用新型NGAL檢測(cè)的上轉(zhuǎn)發(fā)光快速定量試劑盒的制備方法為: (I)結(jié)合墊制備:將UCP-NGAL抗體I用ρΗ7.5的0.03Μ PBS緩沖液(含有2%BSA和2%海藻糖)稀釋至終濃度為2mg/ml，充分混勻后噴于結(jié)合墊上，37°C烘干備用；(2)分析膜制備:用點(diǎn)樣儀在分析膜上不同位置分別噴點(diǎn)NGAL抗體II (或NGAL抗原)和羊抗鼠IgG抗體，作為檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，37°C烘干備用；(3)樣品墊制備:將樣品墊放入pH 7.2的0.03M PBS緩沖液(含5mg/mlBSA和0.l%TritonX-100)中浸泡l_2h，然后37°C烘干備用；⑷試劑盒組裝:將樣品墊、結(jié)合墊、分析膜和吸水紙依次粘貼在底襯上，切割成指定寬度試紙條即可。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實(shí)用新型具有以下有益技術(shù)效果:本實(shí)用新型檢測(cè)試劑盒基于轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)與免疫層析技術(shù)結(jié)合在定量檢測(cè)NGAL的應(yīng)用，使得NGAL檢測(cè)無(wú)本底干擾、檢測(cè)結(jié)果更加靈敏；與現(xiàn)有技術(shù)相比，該試劑盒穩(wěn)定性更聞。

圖1 NGAL檢測(cè)的上轉(zhuǎn)發(fā)光快速定量試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。其中，1、底襯；2、樣品墊；3、結(jié)合墊；4、分析膜；5、吸水紙；6、檢測(cè)區(qū)；7、質(zhì)控區(qū)。
具體實(shí)施方式
[0029]
以下結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)一步詳細(xì)描述，所述是對(duì)本實(shí)用新型的解釋而不是限定。如圖1所示，一種NGAL檢測(cè)的上轉(zhuǎn)發(fā)光快速定量試劑盒，包括在底襯I上依次粘貼的樣品墊2、結(jié)合墊3、分析膜4和吸水紙5，所述結(jié)合墊3上包被有上轉(zhuǎn)發(fā)光UCP顆粒標(biāo)記的NGAL抗體I，所述分析膜4上設(shè)有平行的檢測(cè)區(qū)6和質(zhì)控區(qū)7，所述檢測(cè)區(qū)6包被有NGAL抗體II或NGAL抗原，所述質(zhì)控區(qū)7包被有羊抗鼠IgG。所述上轉(zhuǎn)發(fā)光UCP顆粒的直徑為50_350nm。所述NGAL抗體I和NGAL抗體II為配對(duì)單抗或單抗-多抗配對(duì)。所述NGAL抗原為人NGAL。實(shí)施例1本實(shí)用新型NGAL檢測(cè)的上轉(zhuǎn)發(fā)光快速定量試劑盒的制備方法1:(I)結(jié)合墊3制備:將50nmUCP顆粒與NGAL單克隆抗體I共價(jià)偶聯(lián)得到UCP-NGAL單克隆抗體I，然后用PH7.5的0.03M PBS緩沖液(含有2%BSA和2%海藻糖)稀釋至終濃度為2mg/ml，充分混勻后噴于結(jié)合墊上，37°C烘干備用；⑵分析膜4制備:以pH 7.2的PBS緩沖液將NGAL單克隆抗體II或NGAL多克隆抗體和兔抗鼠IgG抗體分別配置成0.2mg/ml和0.3mg/ml的溶液,再用噴膜儀在分析膜4上以I μ 1/cm的量分別劃線作為檢測(cè)區(qū)6和質(zhì)控區(qū)7，37°C烘干備用；(3)樣品墊2制備:將樣品墊2放入pH 7.2的0.03M PBS緩沖液(含5mg/mlBSA和
0.l%TritonX-100)中浸泡30min，然后37°C烘干備用；⑷試劑盒組裝:將樣品墊2、結(jié)合墊3、分析膜4和吸水紙5依次粘貼在底襯I上，切割成指定寬度試紙條即可。方法2: (I)結(jié)合墊3制備:將350nmUCP顆粒與NGAL單克隆抗體I共價(jià)偶聯(lián)得到UCP-NGAL單克隆抗體I，然后用PH7.5的0.03M PBS緩沖液(含有2%BSA和2%海藻糖)稀釋至終濃度為2mg/ml，充分混勻后噴于結(jié)合墊上，37°C烘干備用；(2)分析膜4制備:以pH 7.2的PBS緩沖液將人NGAL和兔抗鼠IgG抗體分別配置成0.2mg/ml和0.3mg/ml的溶液，再用噴膜儀在分析膜4上以I μ 1/cm的量分別劃線作為檢測(cè)區(qū)6和質(zhì)控區(qū)7，37°C烘干備用；⑶樣品墊2制備:將樣品墊2放入pH 7.2的0.03M PBS緩沖液(含5mg/mlBSA和
0.l%TritonX-100)中浸泡30min，然后37°C烘干備用；⑷試劑盒組裝:將樣品墊2、結(jié)合墊3、分析膜4和吸水紙5依次粘貼在底襯I上，切割成指定寬度試紙條即可。實(shí)施例2樣品檢測(cè)將被檢測(cè)尿液滴加100-120 μ I于樣品墊2上，溶液將溶解結(jié)合墊3上標(biāo)記好的UCP顆粒，并在分析膜4上發(fā)生層析，然后在5-10min內(nèi)用UPT生物傳感器對(duì)試紙條進(jìn)行掃描，根據(jù)信號(hào)得出待測(cè)樣品中的NGAL的含量進(jìn)行定量或定性檢測(cè)。
權(quán)利要求1.一種NGAL檢測(cè)的上轉(zhuǎn)發(fā)光快速定量試劑盒，包括在底襯(I)上依次粘貼的樣品墊(2)、結(jié)合墊(3)、分析膜(4)和吸水紙(5)，其特征在于所述結(jié)合墊(3)上包被有上轉(zhuǎn)發(fā)光UCP顆粒標(biāo)記的NGAL抗體I，所述分析膜(4)上設(shè)有平行的檢測(cè)區(qū)(6)和質(zhì)控區(qū)(7)，所述檢測(cè)區(qū)(6 )包被有NGAL抗體11或NGAL抗原，所述質(zhì)控區(qū)(7 )包被有羊抗鼠IgG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述NGAL檢測(cè)的上轉(zhuǎn)發(fā)光快速定量試劑盒，其特征在于所述上轉(zhuǎn)發(fā)光UCP顆粒的直徑為50-350nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述NGAL檢測(cè)的上轉(zhuǎn)發(fā)光快速定量試劑盒，其特征在于所述NGAL抗體I和NGAL抗體II為配對(duì)單抗或單抗-多抗配對(duì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述NGAL檢測(cè)的上轉(zhuǎn)發(fā)光快速定量試劑盒，其特征在于所述NGAL抗原為人NGAL。
專利摘要本實(shí)用新型公開(kāi)了一種NGAL檢測(cè)的上轉(zhuǎn)發(fā)光快速定量試劑盒，屬于臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。該試劑盒包括在底襯上依次粘貼的樣品墊、結(jié)合墊、分析膜和吸水紙，所述結(jié)合墊上包被有上轉(zhuǎn)發(fā)光UCP顆粒標(biāo)記的NGAL抗體I，所述分析膜上設(shè)有平行的檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測(cè)區(qū)包被有NGAL抗體II或NGAL抗原，所述質(zhì)控區(qū)包被有羊抗鼠IgG。本試劑盒采用上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)與免疫技術(shù)結(jié)合，具有準(zhǔn)確、快速、定量檢測(cè)的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/558GK202956384SQ20122049740
公開(kāi)日2013年5月29日 申請(qǐng)日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者蘇恩本, 顏彬, 沈小娟, 王勇 申請(qǐng)人:南京基蛋生物醫(yī)藥有限公司