專利名稱：檢測呋喃它酮代謝物的化學(xué)發(fā)光試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及檢測呋喃它酮代謝物(AMOZ)殘留量的化學(xué)發(fā)光試劑盒(CLEIA)，特別是檢測畜禽組織(肌肉、肝臟)和水產(chǎn)品AMOZ殘留量的CLEIA試劑盒。
技術(shù)背景 呋喃它酮屬于硝基呋喃類抗菌藥，在臨床上主要用于雞白痢、雞大腸桿菌病、雞球蟲病等各種腸道感染性疾病的治療及用作豬、禽類和水產(chǎn)促生長的添加劑。但有關(guān)研究證明，呋喃它酮及其代謝物具有相當大的毒性和副作用，能誘導(dǎo)有機體基因突變及致畸胎，且能誘發(fā)癌癥。歐盟早在1990年就頒布2377/90/EEC條例，將硝基呋喃類藥物及其代謝物列為A類禁用藥，規(guī)定其在動物源性食品中的最高殘留量為l.Oyg/kg。1995年起歐盟、日本、美國等開始禁止這類抗菌劑在食用的畜禽及水產(chǎn)動物中使用，并嚴格執(zhí)行對輸入的食用魚、蝦及禽類進行殘留檢測。中國農(nóng)業(yè)部2002年2月發(fā)布《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》中，明文禁止在所有食品動物的所有用途中使用硝基呋喃類藥物。但是，由于其價格便宜，藥效好，在很多國家還在繼續(xù)違規(guī)使用。為了保障人民健康及擴大與世界各國動物源性食品貿(mào)易往來，必須對動物源性食品中呋喃它酮進行檢測。由于呋喃它酮在體內(nèi)很快就能被代謝，而在組織中結(jié)合的代謝產(chǎn)物(AMOZ)則能存留較長的一段時間，所以藥殘監(jiān)測部門經(jīng)常以檢測其代謝產(chǎn)物-AMOZ為手段達到檢測呋喃唑酮殘留的目的。目前，呋喃它酮檢測方法主要有微生物法、色譜法、免疫分析法等。微生物法是測定抗生素殘留的經(jīng)典方法，具有前處理簡單、經(jīng)濟、批量大等優(yōu)點，但精確度、準確度和特異性不高。色譜法應(yīng)用較普遍，精確度和靈敏度高，但因其流程繁瑣、設(shè)備昂貴、檢測速度慢等原因，很難實現(xiàn)現(xiàn)場檢測和普及推廣。酶聯(lián)免疫檢測法具有簡單、快速、處理樣本量大、靈敏度較高、特異性強等諸多優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于殘留檢測，但在實踐中很容易出現(xiàn)各種各樣的問題，如加樣時間是否一致，洗板是否徹底，加樣量是否一致等，導(dǎo)致易出現(xiàn)假陽性結(jié)果等缺點。基于化學(xué)發(fā)光強度和被測物含量之問的關(guān)系建立的分析方法叫化學(xué)發(fā)光分析法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析包含兩個部分，即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)。化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法具有特異性強、穩(wěn)定快速、檢測范圍寬、操作簡單自動化程度高、試劑穩(wěn)定且有效期長(6 18個月)等優(yōu)點，其檢測限比酶聯(lián)免疫法和理化檢測方法高幾個數(shù)量級。本研究旨在建立AMOZ殘留化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，為擁有自主知識產(chǎn)權(quán)檢測產(chǎn)品技術(shù)的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

實用新型內(nèi)容本實用新型所要解決的問題是提供一種小巧輕便的AMOZ殘留量檢測試劑盒，其操作簡便，檢測快速、準確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，需要的技術(shù)含量不高，可進行一次連續(xù)多個樣品中AMOZ殘留量的測定，減少了檢測樣本所需要的時間。[0007]本實用新型的技術(shù)方案是一種檢測AMOZ殘留量的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的化學(xué)發(fā)光板、14瓶試劑，化學(xué)發(fā)光板是采用96孔試劑板作為固相載體，在微孔中預(yù)包被呋喃它酮代謝物偶聯(lián)抗原制成的檢測板；14瓶試劑分別為7瓶呋喃它酮代謝物標準品溶液、酶標抗體濃縮液、酶標抗體稀釋液、化學(xué)發(fā)光液A液、化學(xué)發(fā)光液B液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、衍生化試劑。檢測AMOZ殘留量的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒還包括一張蓋板膜、放置試劑的15個下凹瓶位、一個自封袋、一份說明書和一份質(zhì)檢報告；蓋板膜是塑料硬膜；標準品溶液、酶標AMOZ抗體濃縮液、酶標AMOZ抗體稀釋液、化學(xué)發(fā)光液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液用塑料瓶盛放，衍生化試劑用玻璃瓶盛放，下凹瓶位 由塑料泡沫制成；盒體是硬紙盒?；瘜W(xué)發(fā)光板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條化學(xué)發(fā)光反應(yīng)微孔條組成，每個可拆裝化學(xué)發(fā)光反應(yīng)微孔條有8個反應(yīng)孔，每個反應(yīng)孔預(yù)包被呋喃它酮代謝物偶聯(lián)抗原，96孔試劑板為不透明的聚苯乙烯化學(xué)發(fā)光板，放于真空鋁鉬袋內(nèi)；蓋板膜大小與化學(xué)發(fā)光板橫切面大小一致；將14瓶試劑用不同大小、不同顏色的試劑瓶盛裝并固定在下凹瓶位中與酶標板、蓋板膜、自封袋、說明書、質(zhì)控報告一同封裝在硬紙盒內(nèi)，以便于攜帶和運輸。14瓶試劑分別為標準品溶液7瓶，ImL/瓶；濃縮酶標抗體I瓶，ImL ;酶標抗體稀釋液I瓶，7mL ;化學(xué)發(fā)光液A液I瓶，8mL ;化學(xué)發(fā)光液B液I瓶，8mL ;濃縮洗滌液I瓶，40mL ；濃縮復(fù)溶液I瓶，50mL ;衍生化試劑I瓶，15mg。每一個試劑盒中的試劑足夠進行96次測定(包括標準分析孔)，既可進行一次連續(xù)多個樣品的檢測，也可以將板孔拆開多次檢測。將剩下的放回鋁箔袋中并用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測結(jié)果的準確性。檢測時，樣本中含有的AMOZ將和包被AMOZ偶聯(lián)抗原競爭結(jié)合抗AMOZ抗體，加入發(fā)光液，測量各孔發(fā)光強度值，再與標準曲線比較計算出相應(yīng)濃度值再乘以其樣品前處理的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中AMOZ的殘留量。其操作簡便易行。經(jīng)實驗表明本試劑盒具有很高的靈敏度畜禽組織(肌肉、肝臟)和水產(chǎn)品樣本的最低檢測限為O. Ing/mL，回收率為85± 15%，相對于其他AMOZ檢測方法，本試劑盒所需儀器較少，所需成本較低。本實用新型的有益效果是能快速、簡便、靈敏、準確地用于動物組織中呋喃它酮代謝物殘留量的檢測。

圖I為本實用新型化學(xué)發(fā)光板的側(cè)面縱剖面圖(長為8. 55cm)；圖2為本實用新型化學(xué)發(fā)光板的側(cè)面橫剖面圖(長為12. 8cm)；圖3為本實用新型化學(xué)發(fā)光板的俯視圖；圖4為本實用新型蓋板膜平面圖；圖5為本實用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖6為本實用新型固定泡沫模具的俯視圖；圖7為本實用新型盒體與固定泡沫模具的側(cè)視圖。參見附圖化學(xué)發(fā)光反應(yīng)微孔條(2)預(yù)包被AMOZ偶聯(lián)抗原(3)固定于化學(xué)發(fā)光板的外框支撐架(I)上，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于化學(xué)發(fā)光板置水浴或恒溫箱內(nèi)反應(yīng)時封蓋化學(xué)發(fā)光反應(yīng)微孔條(2);半透明塑料試劑瓶(5)分別用于封裝40mL濃縮洗滌液和50mL復(fù)溶工作液；黑色塑料試劑瓶(6)分別用于封裝8mL化學(xué)發(fā)光液A液和8mL化學(xué)發(fā)光液B液，棕色玻璃試劑瓶(6)分別用于封裝15mg衍生化試劑——2-硝基苯甲醛，白色塑料試劑瓶(7)分別用于封裝ImL酶標抗體和7mL酶標抗體稀釋液，白色塑料試劑瓶(8)分別用于封裝ImL/瓶的標準品溶液；泡沫塑料模具(10)有15個瓶位，放置位置依次為40mL濃縮洗滌液瓶位(18)，50mL濃縮復(fù)溶液(11)，8mL化學(xué)發(fā)光液A液瓶位(14)，8mL化學(xué)發(fā)光液液B液瓶位(13)，15mg衍生化試劑瓶位(12)，ImL酶標AMOZ抗體濃縮液瓶位(16)，7mL酶標AMOZ抗體稀釋液瓶位(15)，7瓶ImL/瓶各種濃度的標準品溶液瓶位(17)，盒體為(9)是硬紙盒。
具體實施方式
具體實施例一樣本的前處理I、配液配液I :衍生化試劑向裝有2-硝基苯甲醛的試劑瓶中加IOmL甲醇溶解混勻。配液2 :0. lmol/L磷酸氫二鉀溶液稱取22. 8g三水合磷酸氫二鉀加入IL去離子水溶解混勻。配液3 lmol/L鹽酸溶液量取8. 3mL濃鹽酸加入去離子水定容至100mL。配液4 lmol/L氫氧化鈉溶液稱取4. Og氫氧化鈉加IOOmL去離子水溶解混勻。配液5 :復(fù)溶工作液用去離子水將2 X濃縮復(fù)溶液按I :1體積比進行稀釋(I份
2X濃縮復(fù)溶液+1份去離子水)用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4°C環(huán)境可保存一個月。配液6:洗滌液工作液用去離子水將20 X濃縮洗滌液按I :19體積比進行稀釋(I份20X濃縮洗滌液+19份去離子水)用于酶標板的洗滌，洗滌工作液在4°C環(huán)境可保存一個月。2、樣本處理步驟(I)用均質(zhì)器均質(zhì)樣本，稱取I. 0±0. 05g均質(zhì)后的樣本，加入4mL去離子水、0. 5mLlmol/L鹽酸溶液和100 μ L衍生化試劑，用渦旋儀渦動2min ；(2)在37°C過夜孵育16h，分別加入5mL 0. lmol/L磷酸氫二鉀溶液、0. 4mL ImoI/L氫氧化鈉溶液和5mL乙酸乙酯，用渦旋儀渦動30s，3000 rpm以上，室溫(20 25°C )離心5min ；(3)取2. 5mL乙酸乙酯相至IOmL干燥玻璃試管中，于5(T60°C水浴氮氣流下吹干；加入ImL正己烷，用渦旋儀渦動lmin，再加入ImL復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動30s充分混勻；(4)3000 rpm以上，室溫(20 25°C )離心5min ;除去上層有機相，取下層水相50μ 用于分析。組織樣本稀釋倍數(shù)為2具體實施例二 使用試劑盒的操作步驟I、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(2(T25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。5、酶標抗體工作液配置用酶標抗體稀釋液將酶標抗體濃縮液按9:1稀釋(9份酶標抗體稀釋液+1酶標抗體濃縮液)。6、加標準 品/樣本/酶標抗體工作液加標準品/樣本50 μ L到對應(yīng)的微孔中，直接加入酶標抗體工作液50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15min。7、洗板小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μ L/孔，充分洗滌7次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。8、發(fā)光液配制根據(jù)發(fā)光液的使用量，將A液和B液按I: I混合，搖勻后使用，(注現(xiàn)配現(xiàn)用)每孔加入新配制的發(fā)光底物ΙΟΟμ ，震蕩約30秒左右，室溫放置3分鐘。9、測定加入底物3分鐘后，用光子計數(shù)儀測量。具體實施例三結(jié)果判定(I)發(fā)光百分比的計算，標準品或樣本的發(fā)光百分比等于標準品或樣本的發(fā)光強度值的平均值(雙孔)除以O(shè)濃度標準品的發(fā)光強度度值，再乘以100%，即
發(fā)光百分比(％)=^^χ00%
RLUoRLU—標準溶液或樣本溶液的平均發(fā)光強度值RLU0-O濃度標準溶液的平均發(fā)光強度值(2)標準曲線的繪制與計算以標準品發(fā)光百分比為縱坐標，以標準品濃度(ng/mL)的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的發(fā)光百分比代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中AMOZ實際濃度。具體實施例四注意事項I、室溫低于20°C或試劑及樣本沒有回到室溫(2(T25°C)會導(dǎo)致所有標準的光子計數(shù)值偏低。2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。3、每加一種試劑前需要將其搖勻。4、不要使用過了有效期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試齊U，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。6、儲存條件保存試劑盒于21 °C，不要冷凍，將不用的微孔板放進自封袋重新密封。標準物質(zhì)和無色的化學(xué)發(fā)光劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。7、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25°C，溫度過高或過低將導(dǎo)致光子計數(shù)計數(shù)值和靈敏度發(fā)生變化。
權(quán)利要求1.一種檢測呋喃它酮代謝物的化學(xué)發(fā)光試劑盒，其特征在于包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的化學(xué)發(fā)光板、14瓶試劑，化學(xué)發(fā)光板是采用96孔試劑板作為固相載體，在微孔中預(yù)包被呋喃它酮代謝物偶聯(lián)抗原制成的檢測板，14瓶試劑分別為7瓶呋喃它酮代謝物標準品溶液、酶標抗體濃縮液、酶標抗體稀釋液、化學(xué)發(fā)光液A液、化學(xué)發(fā)光液B液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、衍生化試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測呋喃它酮代謝物的化學(xué)發(fā)光試劑盒，其特征在于還包括一張蓋板膜、放置試劑的15個下凹瓶位、一個自封袋、一份說明書和一份質(zhì)檢報告；96孔試劑板為不透明的聚苯乙烯化學(xué)發(fā)光板，放于真空鋁鉬袋內(nèi)；蓋板膜是塑料硬膜；標準品溶液、酶標AMOZ抗體濃縮液、酶標AMOZ抗體稀釋液、化學(xué)發(fā)光液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液用塑料瓶盛放，衍生化試劑用玻璃瓶盛放，下凹瓶位由塑料泡沫制成；盒體是硬紙盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測呋喃它酮代謝物的化學(xué)發(fā)光試劑盒，其特征在于化學(xué)發(fā)光板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條化學(xué)發(fā)光反應(yīng)微孔條組成，每個可拆裝化學(xué)發(fā)光反應(yīng)微孔條有8個反應(yīng)孔，每個反應(yīng)孔預(yù)包被呋喃它酮代謝物偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與化學(xué)發(fā)光板橫切面大小一致；標準品溶液7瓶，ImL/瓶；濃縮酶標抗體I瓶，ImL ;酶標抗體稀釋液I瓶，7mL ;化學(xué)發(fā)光液A液I瓶，8mL ;化學(xué)發(fā)光液B液I瓶，8mL ;濃縮洗滌液I瓶，40mL ;濃縮復(fù)溶液I瓶，50mL ;衍生化試劑I瓶，15mg。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測呋喃它酮代謝物的化學(xué)發(fā)光試劑盒。該試劑盒包括96孔化學(xué)發(fā)光板、呋喃它酮代謝物(AMOZ)標準品溶液、酶標抗體濃縮液、酶標抗體稀釋液、化學(xué)發(fā)光液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、衍生化試劑、自封袋、蓋板膜、說明書和質(zhì)檢報告。采用間接競爭CELIA方法，在發(fā)光板微孔中預(yù)包被AMOZ偶聯(lián)抗原，樣本中含有的AMOZ將和包被AMOZ偶聯(lián)抗原競爭結(jié)合抗AMOZ抗體，加入發(fā)光液，測量各孔發(fā)光強度值，再與標準曲線比較計算出相應(yīng)濃度值再乘以其樣品前處理的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中AMOZ的殘留量。與儀器分析技術(shù)相比具有使用方便、靈敏度高等特點，可在動物組織中AMOZ的殘留量檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號G01N21/76GK202794039SQ201220500290
公開日2013年3月13日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者何方洋, 萬宇平, 陶光燦, 羅曉琴, 聶雯瑩, 韓京朋, 馮月君, 羅貴昆 申請人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司