專利名稱：一種軍團(tuán)菌電化學(xué)dna生物傳感檢測(cè)裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及電化學(xué)傳感器和預(yù)防醫(yī)學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測(cè)裝置。
背景技術(shù)：
1976年美國費(fèi)城退伍軍人協(xié)會(huì)會(huì)員中曾爆發(fā)急性發(fā)熱性呼吸道疾病，經(jīng)研究，發(fā)現(xiàn)一種致病細(xì)菌并將之命名為嗜肺軍團(tuán)菌?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)超過30種軍團(tuán)桿菌，其中至少19種是人類肺炎的病原。最常見病原體為嗜肺軍團(tuán)菌(占病例的859^90%)，該菌存在于水和土壤中，常經(jīng)供水系統(tǒng)、溶洞和霧化吸入而引起肺炎型和非肺炎型感染。除呼吸道癥狀外還有明顯的多器官損害，致死率較高。據(jù)最近的調(diào)查統(tǒng)計(jì)軍團(tuán)菌引起的醫(yī)院感染也可高達(dá)23%，還可合并其他微生物感染，形成難治性肺炎，致死率高達(dá)45%。故軍團(tuán)菌在機(jī)會(huì)感染或醫(yī)院內(nèi)感染中的位置日益被人們所重視。目前檢測(cè)軍團(tuán)菌的免疫檢測(cè)技術(shù)有免疫層析法、酶免疫法、放射免疫法、細(xì)胞計(jì)量術(shù)及免疫傳感器技術(shù)。此外，還有熒光素原位分子雜交檢驗(yàn)。但軍團(tuán)菌不易分離培養(yǎng)，種類又繁多，目前尚無簡易、快速實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法，故研究新的快速、特異、敏感的軍團(tuán)菌檢測(cè)技術(shù)是當(dāng)今軍團(tuán)菌檢驗(yàn)技術(shù)研究的首要問題。而DNA電化學(xué)生物傳感器是近幾年國際熱點(diǎn)研究的一類新型生物傳感器，它是將單鏈DNA (ssDNA)修飾到電極表面，構(gòu)成DNA修飾電極，由于電極上的探針ssDNA與溶液中的互補(bǔ)鏈雜交的高度序列選擇性，使得該ssDNA修飾電極具有極強(qiáng)的分子識(shí)別能力。在適當(dāng)條件下，ssDNA探針分子與待測(cè)序列DNA(靶序列)雜交，在電極表面形成雙鏈的DNA(dsDNA)，從而導(dǎo)致雜交前后的電極表面結(jié)構(gòu)的改變，這種雜交前后的差異可以通過電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)的響應(yīng)變化進(jìn)行測(cè)定，從而達(dá)到檢測(cè)靶序列。這種新型DNA電化學(xué)生物傳感器不僅快速、靈敏、準(zhǔn)確、廉價(jià)，還具有分子識(shí)別、分離純化基因等功能，從而在分子生物學(xué)和生物工程醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用前景。本研究將電化學(xué)生物傳感器技術(shù)應(yīng)用到軍團(tuán)菌的檢測(cè)上來，從而開辟了快速、特異、敏感的軍團(tuán)菌檢測(cè)技術(shù)的新思路與方法。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的在于提供一種軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測(cè)裝置?？赏ㄟ^軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器的設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)通過電化學(xué)方法對(duì)樣品中軍團(tuán)菌核酸進(jìn)行檢測(cè)的目的，并通過軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器、電化學(xué)工作站和計(jì)算機(jī)的連接，實(shí)現(xiàn)軍團(tuán)菌的電化學(xué)DNA生物傳感檢測(cè)，充分發(fā)揮了其快速、靈敏、準(zhǔn)確、廉價(jià)等特點(diǎn)，從而提高軍團(tuán)菌監(jiān)測(cè)和檢測(cè)的應(yīng)急反應(yīng)速度。本實(shí)用新型的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的一種軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測(cè)裝置，包括一個(gè)軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器、電化學(xué)工作站和計(jì)算機(jī)，其特點(diǎn)為軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器通過電極線與電化學(xué)工作站相連接，電化學(xué)工作站通過數(shù)據(jù)線連接計(jì)算機(jī)。所述的一種軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測(cè)裝置，其特點(diǎn)為軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器包括參比電極、輔助電極、工作電極、反應(yīng)池、磁力攪拌子和帶溫控的磁力攪拌器；反應(yīng)池放置于帶溫控的磁力攪拌器上，磁力攪拌子放置于反應(yīng)池底部，參比電極、輔助電極和工作電極放置于反應(yīng)池中的反應(yīng)液內(nèi)。所述的一種軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測(cè)裝置，其特點(diǎn)為工作電極采用玻碳電極，在玻碳電極表面上設(shè)置有特異性的軍團(tuán)菌DNA探針。所述的一種軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測(cè)裝置，其特點(diǎn)為在玻碳電極表面上通過工作電極表面的-COOH基團(tuán)連接有特異性的軍團(tuán)菌DNA探針。本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)對(duì)比以往水樣中軍團(tuán)菌檢測(cè)的常規(guī)方法，本方法無需分離培養(yǎng)耗時(shí)大大減少，采用了軍團(tuán)菌特異性片段為探針可使檢測(cè)的特異性和靈敏度大大提升，并且此傳感器便于攜帶，可以用于多種環(huán)境下的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，尤其適用于現(xiàn)場(chǎng)定性檢測(cè)，做到現(xiàn)場(chǎng)快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)。

圖1為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為圖1中的軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器的工作電極的放大結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為圖2的軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器的工作電極與待檢的軍團(tuán)菌DNA片段結(jié)合的放大結(jié)構(gòu)示意圖。圖中1為軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器；2為電化學(xué)工作站；3為計(jì)算機(jī)；4為參比電極；5為輔助電極；6為工作電極；7為反應(yīng)池；8為磁力攪拌子；9為帶溫控的磁力攪拌器；10為電極線；11為數(shù)據(jù)線；12為工作電極表面的-COOH基團(tuán)；13為特異性的軍團(tuán)菌DNA探針；14為待檢的軍團(tuán)菌DNA片段。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行詳細(xì)說明如圖1、圖2和圖3所示，所述的一種軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測(cè)裝置，包括一個(gè)軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器1、電化學(xué)工作站2和計(jì)算機(jī)3，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器I通過電極線10與電化學(xué)工作站2相連接，電化學(xué)工作站2通過數(shù)據(jù)線11連接計(jì)算機(jī)3。軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器1，包括參比電極4、輔助電極5、工作電極6、反應(yīng)池7、磁力攪拌子8和帶溫控的磁力攪拌器9。反應(yīng)池7放置于帶溫控的磁力攪拌器9上，磁力攪拌子8放置于反應(yīng)池7底部，參比電極4、輔助電極5和工作電極6放置于反應(yīng)池7中的反應(yīng)液內(nèi)。電化學(xué)工作站2經(jīng)電極線10采集軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器I上通過參比電極4、輔助電極5和工作電極6的產(chǎn)生電信號(hào)，并傳輸?shù)接?jì)算機(jī)3進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。本實(shí)用新型的制作如下包括以下4個(gè)步驟(I)首先構(gòu)建軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器I中的工作電極6，先將玻碳電極進(jìn)行預(yù)處理，然后用裝有IOOmL的偶聯(lián)劑[5 mmol/L EDC (鹽酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺)_ 8 mmol/L NHS (羥基丁二酰亞胺)]浸泡后雙蒸水沖洗，N2吹干后，直接在電極表面滴加特異性的軍團(tuán)菌DNA探針13，用
O.2%SDS洗滌后用電化學(xué)工作站測(cè)其阻抗值；(2)搭建軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器1，將反應(yīng)池7放置于帶溫控的磁力攪拌器9上，磁力攪拌子8放置于反應(yīng)池7底部，在電極支架上固定上參比電極4、輔助電極5和工作電極6，調(diào)節(jié)支架高低，將參比電極4、輔助電極5和工作電極6放置于反應(yīng)池7中的反應(yīng)液內(nèi)。(3)電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)平臺(tái)的搭建，軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器I通過電極線10與電化學(xué)工作站2相連接，電化學(xué)工作站2通過數(shù)據(jù)線11連接計(jì)算機(jī)3。實(shí)驗(yàn)過程先將本實(shí)用新型的軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測(cè)裝置按上述步驟組裝，打開電源、電化學(xué)工作站2和計(jì)算機(jī)3 ;將待檢測(cè)的樣品放入反應(yīng)池7中，將表面修飾特異性的軍團(tuán)菌DNA探針13的工作電極6浸沒在待測(cè)樣本溶液中35°C雜交40min后并雜交連接上待檢的軍團(tuán)菌DNA片段14，用0. 2%SDS洗滌3分鐘，用電化學(xué)工作站2在0. OOlmol/L鐵氰電對(duì)(K3Fe(CN)6/ K4 Fe (CN) 6)溶液中測(cè)定雜交后的阻抗值，測(cè)定條件為方法選擇為交流阻抗法，初始電位選擇為即時(shí)開路電位，高頻選擇100000Hz，低頻選擇1Hz，振幅為0. 005V ;或在2X l(T5mol/L亞甲藍(lán)溶液中富集5min后于0. 02mol/L Tris-HCl溶液做差分脈沖伏安法(DPV)掃描，測(cè)定條件為方法選擇為差分脈沖伏安法，初始電位為-1V終止電位為IV，電位增量為0. 004V，振幅為0. 05V，脈沖寬度為0. 2秒。通過交流阻抗譜圖判斷分析，當(dāng)雜交后雙鏈的阻抗值大于雜交前單鏈阻抗值則表明樣本中含有軍團(tuán)菌屬；通過差分脈沖伏安法譜圖判斷分析，當(dāng)雜交后雙鏈的DPV峰值小于雜交前單鏈的DPV峰值則表明樣本中含有軍團(tuán)菌屬。
權(quán)利要求1.一種軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測(cè)裝置，包括一個(gè)軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器(I)、電化學(xué)工作站(2)和計(jì)算機(jī)(3)，其特征在于軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器(I)通過電極線(10 )與電化學(xué)工作站(2 )相連接，電化學(xué)工作站(2 )通過數(shù)據(jù)線(11)連接計(jì)算機(jī)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測(cè)裝置，其特征在于軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器(I)包括參比電極(4)、輔助電極(5)、工作電極(6)、反應(yīng)池、磁力攪拌子(8)和帶溫控的磁力攪拌器(9);反應(yīng)池(7)放置于帶溫控的磁力攪拌器(9)上，磁力攪拌子(8)放置于反應(yīng)池(7)底部，參比電極(4)、輔助電極(5)和工作電極放置于反應(yīng)池(7)中的反應(yīng)液內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測(cè)裝置，其特征在于工
作電極(6)采用玻碳電極，在玻碳電極表面上設(shè)置有特異性的軍團(tuán)菌DNA探針(13)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測(cè)裝置，其特征在于在玻碳電極表面上通過工作電極表面的-COOH基團(tuán)(12)連接有特異性的軍團(tuán)菌DNA探針(13)。
專利摘要本實(shí)用新型公開一種軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA生物傳感檢測(cè)裝置，將DNA電化學(xué)生物傳感技術(shù)應(yīng)用于軍團(tuán)菌的檢測(cè)。通過軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器的設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)通過電化學(xué)方法對(duì)樣品中軍團(tuán)菌核酸進(jìn)行檢測(cè)的目的，并通過軍團(tuán)菌電化學(xué)DNA傳感器、電化學(xué)工作站和計(jì)算機(jī)的連接，實(shí)現(xiàn)軍團(tuán)菌的電化學(xué)DNA生物傳感檢測(cè)，充分發(fā)揮了其快速、靈敏、準(zhǔn)確、廉價(jià)等特點(diǎn)，從而提高軍團(tuán)菌監(jiān)測(cè)和檢測(cè)的應(yīng)急反應(yīng)速度。使用該裝置無需分離培養(yǎng)，耗時(shí)大大減少，采用了軍團(tuán)菌特異性片段為探針可使檢測(cè)的特異性和靈敏度大大提升，并且此傳感器便于攜帶，可以用于多種環(huán)境下的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，尤其適用于現(xiàn)場(chǎng)定性檢測(cè)，做到現(xiàn)場(chǎng)快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N27/48GK202870030SQ20122053643
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月18日
發(fā)明者蔡怡珊, 肖武, 黃金寶, 劉愛林, 鄭暉, 劉海濤 申請(qǐng)人:福建國際旅行衛(wèi)生保健中心