用于預(yù)處理包埋的生物樣本的不混溶兩相系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本申請(qǐng)?zhí)峁┯糜诎竦纳飿颖镜念A(yù)處理的不混溶兩相系統(tǒng)，包括向預(yù)處理容器中放入在其表面上具有包埋的生物樣本的至少一個(gè)支撐物，向預(yù)處理容器加入至少一種形成層的試劑，向預(yù)處理容器加入載體成分，使形成層的試劑形成在載體成分的頂部且含量為使至少一種形成層的試劑接觸至少一部分的包埋的生物樣本。包埋的生物樣本的處理可以包括，在染色組織化學(xué)分析或其他工序之前，從包埋的生物樣本中去除包埋介質(zhì)、目標(biāo)物修復(fù)以及酶封閉。系統(tǒng)還包括使預(yù)處理方法自動(dòng)化的裝置和程序。
【專利說(shuō)明】用于預(yù)處理包埋的生物樣本的不混溶兩相系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本公開涉及領(lǐng)域?yàn)樯飿颖镜奶幚?，具體為包埋的生物樣本的預(yù)處理，例如在染色、組織化學(xué)分析或其他工序之前從包埋的生物樣本中去除包埋介質(zhì)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及在工序中應(yīng)用具有浸泡槽和表面薄層的兩相系統(tǒng)，以從包埋的生物樣本中除去包埋介質(zhì)。本發(fā)明涉及一種高效和有成本效益的方法和組合物，以用于去除包埋的生物樣本中的包埋介質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0002]樣本處理，例如在免疫組織化學(xué)(“IHC”)應(yīng)用中，以及在其他的化學(xué)和生物學(xué)分析中，可能涉及至少一個(gè)處理順序或處理操作指南，作為至少一個(gè)樣本的分析的一部分。通常情況下，這樣的處理操作指南由需要分析的組織或個(gè)人(如附屬于醫(yī)院的病理學(xué)家或組織學(xué)家)來(lái)制定，還可以由待執(zhí)行的特定分析的要求來(lái)限定。
[0003]在樣本分析的準(zhǔn)備中，可以取得生物樣本并以某種保存形式將其貼附在玻片或其他載體上。作為一個(gè)實(shí)例，樣本諸如組織層或組織切片可以保存在甲醛中并包埋在石蠟或其他包埋介質(zhì)中，用切片機(jī)進(jìn)行切片。然后，組織切片可以貼附在玻片上。用石蠟保存的樣本可以進(jìn)行脫石蠟，通過(guò)脫石蠟過(guò)程除去包埋樣本的石蠟。此外，目標(biāo)物或樣本可以進(jìn)行目標(biāo)物修復(fù)，該工序?qū)⒛繕?biāo)物或樣本修復(fù)到適合染色操作的狀態(tài)。
[0004]術(shù)語(yǔ)“染色”是指一種工序，即對(duì)樣本的某些部分進(jìn)行處理，以顯示或突出樣本的特征。作為染色的結(jié)果，在可見光范圍內(nèi)或在其他電磁波范圍內(nèi)，如紫外線范圍內(nèi)，試圖顯現(xiàn)的特性可以獲得不同的顏色。在某些情況下，染色可以引起可檢測(cè)到的特性變化，如樣本的熒光、磁性、電性或放射性特性的變化。樣本的染色包括一系列的處理步驟，稱為處理的操作指南。典型的處理操作指南可以包括洗滌、試劑與樣本特定部分的結(jié)合、試劑的任何活化，并且每個(gè)處理步驟可以包括多個(gè)單獨(dú)的處理。
[0005]診斷應(yīng)用，例如免疫組織化學(xué)(IHC)、原位雜交(ISH)和特殊染色，可能涉及例如脫石蠟、目標(biāo)物修復(fù)和染色等步驟的處理順序或處理操作指南。在某些應(yīng)用中，這些步驟可以手動(dòng)進(jìn)行，可能創(chuàng)建出時(shí)間密集型的操作指南，并需要人員積極參與到樣本處理中。即使在自動(dòng)執(zhí)行時(shí)，在這類應(yīng)用中也存在不足。已經(jīng)做出嘗試來(lái)使樣本處理自動(dòng)化，以滿足對(duì)于便利的樣本處理和更少的手動(dòng)繁瑣操作的需求。
[0006]為保存生物樣本以供其他分析，已使用不同類型的包埋介質(zhì)。“包埋介質(zhì)”可以是任何組合物，該組合物在室溫下是固體，并于組織學(xué)中用于包埋或以其他方式支撐組織學(xué)或其他分析用的生物樣本，組織學(xué)或其他分析為例如免疫組織化學(xué)、原位雜交、特殊染色和傳統(tǒng)的染料染色。包埋介質(zhì)的實(shí)例包括，但不限于，臘、石臘、paramat> paraplats、peelaway石臘、組織冷凍介質(zhì)、人體冷凍凝膠(cryonic gel)、0CT? (“最佳切割溫度”)包埋化合物、Polyfin?、聚酯蠟。
[0007]“蠟”可以是用于包埋組織化學(xué)或其他化學(xué)和生物學(xué)分析用的生物樣本的組合物。蠟在室溫下是固體；通常由高級(jí)烴類的復(fù)合混合物組成，高級(jí)烴類通常包括高級(jí)脂肪酸和高級(jí)二醇的酯；可以是礦物質(zhì)，天然或合成來(lái)源；比脂更硬和更易碎；溶于油和脂，并可以任選地包含增強(qiáng)其樣本包埋性的添加劑。石蠟是組織化學(xué)領(lǐng)域中最常用的礦物蠟的實(shí)例。石蠟是疏水性物質(zhì)，通常通過(guò)石油的蒸餾來(lái)制備，且主要是固體飽和烴的混合物。石蠟(蠟)通常由高級(jí)聚烯烴組成，且通常包含聚合物，或加入有二甲基亞砜(“DMSO”)。多年來(lái)石蠟被用作制備生物樣本的包埋介質(zhì)，這些生物樣本用于在切片機(jī)中切片，以制備組織學(xué)檢查的樣本切片。
[0008]本公開中所用的“組織化學(xué)”，一般是指如下技術(shù)和方法:免疫組織化學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、組織病理學(xué)、特殊染色、顯微技術(shù)以及分子探針在例如原位雜交中的使用。
[0009]如在本公開中所用的術(shù)語(yǔ)“脫石蠟”包括石蠟或其他在本申請(qǐng)中所描述的包埋介質(zhì)的去除。在染色前，通常需要脫石蠟，以便在隨后的染色過(guò)程中接觸到抗體或探針?biāo)槍?duì)的目標(biāo)物。用于脫石蠟的溶劑為，例如二甲苯、二甲苯取代物和甲苯。通常在脫石蠟中使用的溶劑可能是有毒的、易燃的、并造成環(huán)境危害。
[0010]傳統(tǒng)的手工脫石蠟過(guò)程包括，例如將包埋的樣本浸入二甲苯(FisherScientific, Cat.#X5~4)浴、甲苯浴或 Hi StO-C I ear? (National DiagnosticsInc.，Cat.#HS-200)浴中直至包埋介質(zhì)溶解的步驟。脫石蠟后的樣本隨后進(jìn)行洗滌和再水化，以除去溶劑，并使用醇濃度逐漸降低的一系列醇溶液(通常作為浸泡樣本的浴)使樣本再水化。例如，樣本可以再水化，通過(guò)將其浸泡在95%乙醇的第一浴中兩次，浸潰在70%乙醇的第二浴中兩次，以及浸入水性緩沖液的第三浴。
[0011]燃料的閃點(diǎn)是其能夠與空氣形成可燃性混合物的最低溫度。在此溫度，當(dāng)移除點(diǎn)火源時(shí)，蒸汽可停止燃燒。稍高的溫度，燃點(diǎn)，被定義為當(dāng)蒸汽被點(diǎn)燃后持續(xù)燃燒的溫度。如上所述，二甲苯是易燃、易揮發(fā)和有毒的有機(jī)溶劑；二甲苯具有約137°C的低沸點(diǎn)，和約29°C的低閃點(diǎn)，I至6%的爆炸下限。相似地，醇，尤其是乙醇，是易燃的，并具有約78°C的低沸點(diǎn)，約17°C的低閃點(diǎn)，3.5至15%的爆炸下限，因此容易形成爆炸性空氣混合物中的一部分。然而，稀釋的醇溶液，如10%或20%的乙醇水溶液，能夠比傳統(tǒng)上使用的乙醇溶液(70至95%的乙醇水溶液)具有顯著更高的閃點(diǎn)和沸點(diǎn)。
[0012]由于二甲苯和醇的危險(xiǎn)特性，開發(fā)更安全的脫石蠟方法將是有利的。已做出努力來(lái)用毒性更小和更少揮發(fā)的溶劑來(lái)代替脫石蠟過(guò)程中的二甲苯。例如，萜烯油和異烷烴，已被證明產(chǎn)生與二甲苯相當(dāng)?shù)拿撌炞饔?。然而，即使在使用這些替代溶劑時(shí)，仍然需要一系列的醇洗滌，也被稱為再水化過(guò)程，在水洗滌前除去溶劑，以實(shí)現(xiàn)與大部分類型的染色的相容性,例如免疫組織化學(xué)染色。
[0013]BioGenex Laboratories的美國(guó)專利6,632,598、美國(guó)專利申請(qǐng)公開2003/0175852A1和國(guó)際專利申請(qǐng)W002/23156A1記載了用于從蠟包埋生物樣本中除去蠟的的組合物和方法，其中可以消除二甲苯的使用，且在隨后的洗滌步驟中減少或消除醇的使用。其中記載的的組合物包含溶解石蠟的有機(jī)溶劑、極性有機(jī)溶劑和表面活性劑。溶解石蠟的有機(jī)溶劑的實(shí)例包括芳香烴、脂肪烴、萜烯、其他油類和石油餾出物。極性有機(jī)溶劑包括，例如酮和低級(jí)醇。醇可以是，例如，乙醇、乙二醇、異丙醇、丙二醇及其混合物。
[0014]BioGenex Laboratories公開的組合物和方法的缺點(diǎn)是，即使可以減少或消除脫石蠟后的醇浴的使用，所公開的脫石蠟組合物的極性有機(jī)溶劑包含醇。因此，所公開的脫石蠟組合物具有與使用醇浴或進(jìn)行洗滌的脫石蠟方法相同的缺點(diǎn)。[0015]Camiener的美國(guó)專利5，344，637記載了使用有機(jī)含環(huán)化合物來(lái)替代I Iisuvdoanx和二甲苯作為溶劑的方法。該溶劑用于取代在被固定的生物材料中的醇或其他脫水劑，并從蠟包埋的生物材料中除去蠟。該溶劑包含5被％至IOOwt %的化合物，所述化合物選自飽和的有機(jī)含環(huán)化合物的未取代和取代衍生物(單獨(dú)的或存在于氫化芳香族石油餾出物中)、及其組合。溶劑經(jīng)CBG Biotech出售，商標(biāo)為Formula83?。FormuIa83?的缺點(diǎn)是其119至145°C的相對(duì)低的沸點(diǎn)，及其普通可燃性。伴隨著僅為7 V的低閃點(diǎn)，和僅為1.3voI %的爆炸下限(LEL)(即在7°C之上的溫度)，F(xiàn)ormula83TM可以與空氣形成可燃混合物，從而造成危險(xiǎn)狀況。此外，F(xiàn)ormula83?是有機(jī)溶劑的共混物，應(yīng)采取個(gè)人安全防范措施，例如應(yīng)使用手套和護(hù)目鏡。
[0016]Ventana Medical Systems, Inc.的美國(guó)專利申請(qǐng)公開 2004/0002163 和國(guó)際專利申請(qǐng)公開W003/089240A1描述了自動(dòng)化玻片染色系統(tǒng)，應(yīng)用于對(duì)貼附在顯微鏡玻片上的生物組織切片的染色。組織樣本通過(guò)使樣本與脫石蠟液在高于對(duì)組織樣本進(jìn)行包埋的石蠟的熔點(diǎn)的溫度下接觸，從而進(jìn)行脫石蠟。之后漂洗掉液化的石蠟。脫石蠟液是水性類液體，當(dāng)包埋介質(zhì)是熔點(diǎn)在50和57°C之間的石蠟時(shí)，通常加熱到60至70°C之間的溫度。
[0017]Ventana Medical Systems, Inc.的美國(guó)專利 6，855，559 和 6，544，798、國(guó)際專利申請(qǐng)公布W099/44030和W000/14507公開了包埋介質(zhì)的去除，無(wú)需使用有機(jī)溶劑，通過(guò)加熱樣本的一側(cè)，使樣本玻片干燥并使包埋介質(zhì)溶解。之后，洗掉溶解的包埋介質(zhì)。在免疫組織化學(xué)(“ IHC”)、原位雜交(“ ISH”)或其他組織化學(xué)或細(xì)胞化學(xué)操作之前，在自動(dòng)化儀器上將包埋介質(zhì)從生物樣本中去除。
[0018]根據(jù)W099/44030的公開，通過(guò)單個(gè)玻片的精確控制加熱，使得包埋在組織中的石蠟熔化并浮在水溶液中，從而實(shí)現(xiàn)包埋組織的脫石蠟，其中石蠟在水溶液中沖洗掉?？梢酝ㄟ^(guò)徑向排列在玻片傳送帶四周的加熱臺(tái)來(lái)實(shí)現(xiàn)加熱，玻片傳送帶上可以放置帶組織樣本的玻片。
[0019]利用熱來(lái)去除包埋介質(zhì)也在Torstein Ljungmann等人的國(guó)際申請(qǐng)W02005/057180 中公開。
[0020]用熱除去包埋介質(zhì)的方法和系統(tǒng)的缺點(diǎn)是，其可能是緩慢的過(guò)程，因?yàn)槭灠竦纳飿颖疽?分鐘至60分鐘的期間經(jīng)受升高的溫度。另一個(gè)缺點(diǎn)是除去組織切片中的最后石蠟殘留時(shí)的效率較低。還有一個(gè)缺點(diǎn)是，所使用的加熱元件需要在放置生物樣本的表面與加熱元件之間保持充足的接觸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021]本申請(qǐng)的一個(gè)方面是提供與已知方法相比改進(jìn)的脫石蠟方法。
[0022]因此，本申請(qǐng)的一個(gè)目的是，在例如實(shí)驗(yàn)室處理生物樣本時(shí)，減少火災(zāi)和爆炸的風(fēng)險(xiǎn)?；?、廢料、工人的安全等，可能是具有各種移動(dòng)自動(dòng)裝置和電路的復(fù)雜自動(dòng)化設(shè)備中的相關(guān)因素，并且是具有培訓(xùn)不足的人員的實(shí)驗(yàn)室中的相關(guān)因素。本公開的目的還在于，減少對(duì)實(shí)驗(yàn)室中通風(fēng)設(shè)備和空氣流通的需求。
[0023]另外，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式意在，使用不混溶兩相系統(tǒng)，為豎式(vertical)的操作模式提供簡(jiǎn)化的方法，其中玻片用最小體積的上層以及下層或載體層進(jìn)行豎式處理。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供組織化學(xué)分析用的包埋的樣本的預(yù)處理方法的更簡(jiǎn)單自動(dòng)化，使得成本降低和環(huán)境條件改善，這是因?yàn)?除其他原因外)所使用的溶劑量減少。
[0024]在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施方式中，已公開一種去除方法，在玻片上幾乎不留或根本不留包埋介質(zhì)殘留物，并且該方法可以去除不同種類的包埋介質(zhì)。例如，在石蠟的情況下，各種石蠟切片可以源自各種石蠟類型和混合物。因?yàn)檫@些包埋介質(zhì)的殘留物可能妨礙染色以及形態(tài)學(xué)樣式和信息，具有去除不同殘留物的方法是有利的。這是可取的，因?yàn)闃颖局械氖灇埩粑锟赡軐?duì)ISH法造成問(wèn)題，并且由于IHC變得更加定量化和標(biāo)準(zhǔn)化，任何包埋介質(zhì)殘留物均可能會(huì)降低或改變?nèi)旧珡?qiáng)度，從而導(dǎo)致錯(cuò)誤的解讀。
[0025]本公開的實(shí)施方式還旨在提供與已有方法相比，從包埋的生物樣本中除去包埋介質(zhì)的更簡(jiǎn)化方法。此外，實(shí)施方式的目的是使處理自動(dòng)化，并使人工處理降至最低。
[0026]在本申請(qǐng)的另一個(gè)實(shí)施方式中，已公開使用溶劑來(lái)脫石蠟的方法，其在目標(biāo)物修復(fù)之前不需要再水化的后續(xù)步驟。在本申請(qǐng)的另一個(gè)實(shí)施方式中，已公開在一個(gè)室中進(jìn)行脫石蠟、再水化和目標(biāo)物修復(fù)的方法和裝置。
[0027]另外，本發(fā)明的實(shí)施方式旨在提供一種豎式操作的簡(jiǎn)化方法，使用不混溶兩相系統(tǒng)，其中玻片使用最少體積的上層以及下層或載體層進(jìn)行豎式處理。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供組織化學(xué)分析所用的包埋的樣本的預(yù)處理方法的更簡(jiǎn)單自動(dòng)化，使得降低成本并且改善環(huán)境條件，因?yàn)?除其他原因外)使用減少量的溶劑。
[0028]總結(jié)
[0029]本申請(qǐng)的實(shí)施方式通過(guò)例如，使用高效、無(wú)毒的有機(jī)溶劑來(lái)除去包埋介質(zhì)，以及使得使用者直接應(yīng)用水性緩沖液而無(wú)需使用極性有機(jī)溶劑(例如醇)的多次漂洗來(lái)進(jìn)一步處理生物樣本(即，再水化)，從而達(dá)成上述目的。
[0030]本申請(qǐng)的另一個(gè)實(shí)施方式提供，使用比現(xiàn)有方法少很多的有機(jī)溶劑量，從包埋的生物樣本中去除包埋介質(zhì)的方法。因此，出于經(jīng)濟(jì)原因，沒(méi)有必要考慮重復(fù)使用溶劑。
[0031]本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)意識(shí)到，脫石蠟后有可能可以直接應(yīng)用水性緩沖液，而無(wú)需使用極性有機(jī)溶劑，例如醇。已知的使用有機(jī)溶劑的方法,試圖通過(guò)使用與兩相均相容的溶齊U(例如，醇)，在脫石蠟后從純的有機(jī)相逐漸變?yōu)樗?。與此相反，本申請(qǐng)使用兩相系統(tǒng)，且不使用與兩相均混容的醇。
[0032]本發(fā)明的發(fā)明人還意識(shí)到，可能可以使用簡(jiǎn)化的、快速的和自動(dòng)化的溶劑兩相系統(tǒng)，以除去包埋介質(zhì)和水性洗滌溶液，從而取得例如與使用溶劑的傳統(tǒng)方法等同或者更好的脫石蠟結(jié)果。
[0033]此外，本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，固體包埋介質(zhì)，例如石蠟，能夠通過(guò)將溶劑擴(kuò)散到固體表面來(lái)降低它們自身的熔點(diǎn)從而迅速溶解。此過(guò)程可以在不同于或遠(yuǎn)離包埋介質(zhì)的原始熔點(diǎn)的溫度下進(jìn)行，例如在室溫下。
[0034]本申請(qǐng)涉及根據(jù)獨(dú)立權(quán)利要求所述的方法、裝置、以及具有溶劑的兩相系統(tǒng)的使用，以從包埋的生物樣本中去除包埋介質(zhì)。其他實(shí)施例限定在從屬權(quán)利要求中。
[0035]在本申請(qǐng)的另一個(gè)實(shí)施方式中，在去除包埋介質(zhì)、生物樣本的再水化及目標(biāo)物修復(fù)后，應(yīng)用試劑來(lái)封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。在本申請(qǐng)的另一個(gè)實(shí)施方式中，將包埋介質(zhì)的去除、生物樣本的再水化及目標(biāo)物修復(fù)、以及應(yīng)用試劑以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性組合到單一操作中。該實(shí)施方式可以稱為4合I方法?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0036]結(jié)合到本申請(qǐng)并構(gòu)成本申請(qǐng)一部分的附圖，示例說(shuō)明本申請(qǐng)的多個(gè)非限制性實(shí)施方式，并與說(shuō)明書一起解釋本申請(qǐng)的原理。
[0037]圖1示出用于生物樣本的自動(dòng)化預(yù)處理和加工的預(yù)處理模塊的分解圖。
[0038]圖2A示出用于生物樣本的自動(dòng)化預(yù)處理和加工的插入有玻片架的預(yù)處理模塊的正交視圖。
[0039]圖2B示出用于生物樣本的自動(dòng)化預(yù)處理和加工的插入有玻片架的預(yù)處理模塊的截面圖。
[0040]圖3A示出在液體進(jìn)入裝置之前的插入有玻片架的預(yù)處理模塊的長(zhǎng)邊示意圖。
[0041]圖3B示出稍后當(dāng)?shù)诙鄬雍偷谝幌嘁后w加到裝置中時(shí)的預(yù)處理模塊的長(zhǎng)邊示意圖。
[0042]圖3C示出稍后當(dāng)增加的第一相液體加到裝置并移動(dòng)第二相層來(lái)掃過(guò)玻片的預(yù)處理模塊的長(zhǎng)邊示意圖。
[0043]圖3D示出稍后當(dāng)增加的第一相液體加到裝置從而使液體達(dá)到滿位，但在第二相層通過(guò)溢出去除之前的預(yù)處理模塊的長(zhǎng)邊示意圖。
[0044]圖4示出當(dāng)?shù)诙鄬油ㄟ^(guò)溢出移除到溢出通道且第一相液體保留在裝置中時(shí)的插入有玻片架的預(yù)處理模塊的截面示意圖。
[0045]圖5示出基于溶劑類兩相預(yù)處理法的方法流程圖。
[0046]圖6示出液化石蠟兩相預(yù)處理的方法流程圖。
[0047]圖7示出使用烘烤和干燥的預(yù)處理法的流程圖。
[0048]圖8示出用于生物樣本的自動(dòng)化預(yù)處理和加工的，玻片架在模塊外部的預(yù)處理模塊的側(cè)視圖。
[0049]圖9示出用于帶烘烤和干燥的預(yù)處理方法的預(yù)處理模塊的截面示意圖，示出環(huán)繞所插入玻片的氣流。
[0050]圖10示出，用兩相系統(tǒng)(圖1Oa(Histoclear 1_ )和圖1Ob (Isopar G))脫石臘的組織樣本顯示出比用3合I緩沖液(圖1Oc)和傳統(tǒng)二甲苯脫石蠟法(圖1Od)進(jìn)行脫石蠟的組織樣本更好的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0051]本文公開的簡(jiǎn)單且有效的方法基于形成層的試劑在包埋的生物樣本表面上的傳輸，從而除去包埋介質(zhì)。形成層的試劑位于載體成分的頂部，其中載體成分不參與溶解石蠟。因?yàn)閮煞N溶液不混溶，形成兩相系統(tǒng)。在本申請(qǐng)的內(nèi)容中，術(shù)語(yǔ)“不混溶”應(yīng)被理解為，不能混合或達(dá)到均一性，即放在一起時(shí)，兩種溶液基本上不能均一混合。
[0052]形成層的試劑具有比載體成分更低的密度，因此形成兩相系統(tǒng)中的上相。在本公開中，該層也可以稱為“上層”或“第二相層”。在形成層的試劑是溶劑的實(shí)施方式中，也可以稱為“溶劑層”。載體成分作為兩相系統(tǒng)中的第一相，并且可以稱為“下層”，“第一相層”，或“溶劑載體層”。
[0053]在本申請(qǐng)中所用的“生物樣本” 一般是指細(xì)胞的任何集合，或松散或在組織中，其可以貼附在支撐物上。非窮舉的例子包括器官切片、腫瘤切片、體液、涂片、冰凍切片、血液、細(xì)胞學(xué)制品、微生物和細(xì)胞系。
[0054]“支撐物”一般是指可以放置至少一種生物樣本以做進(jìn)一步分析的任何媒介。這包括任何支撐物，例如試管、芯片、陣列、盤、或玻片如顯微鏡玻片。如本文所用的“樣本支架”包括任何支撐物，例如載體、試管、芯片、陣列、盤、或玻片如顯微鏡玻片，其可以支撐至少一個(gè)生物樣本。
[0055]“樣本支架”或“支撐支架”也可以包括能夠支撐一組支撐物的設(shè)備，例如可容納一組玻片的架。
[0056]“樣本支架”也可指更大規(guī)模的支撐物，例如容納至少一個(gè)更小支撐物的玻片支持架，例如多個(gè)玻片架，其中各個(gè)架含有多個(gè)玻片。支架是可拆卸的、固定的、和/或保持在允許運(yùn)動(dòng)的狀態(tài)(例如垂直、水平或繞一個(gè)或多個(gè)軸旋轉(zhuǎn))。在一個(gè)實(shí)施方式中，樣本支架可以用作樣本保持裝置。樣本架的可替換實(shí)例包括旋轉(zhuǎn)傳送帶、托盤、架、載體、支架、隔室或用于處理和加工樣本和樣本載體的其他運(yùn)輸裝置，其中任何一個(gè)均可以是至少部分可移動(dòng)的。
[0057]如本文所用的“除去包埋介質(zhì)”或“包埋介質(zhì)的除去”是指，從包埋的生物樣本中去除充分量的包埋介質(zhì)，從而使得樣本可以進(jìn)行進(jìn)一步的處理和/或分析。通常，這樣的分析是組織學(xué)分析，如免疫組織化學(xué)或原位雜交，且應(yīng)去除的包埋介質(zhì)的量是足以允許所選擇分析技術(shù)接觸到樣本中至少一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)的量。當(dāng)包埋介質(zhì)是蠟或石蠟時(shí)，這個(gè)過(guò)程也可以稱為“脫蠟”或“脫石蠟”。
[0058]兩相系統(tǒng)是指相對(duì)小體積的溶劑可以用來(lái)從包埋的生物樣本中去除包埋介質(zhì)例如石蠟的預(yù)處理系統(tǒng)。例如，去除包埋介質(zhì)的試劑，例如Histoclear II?,可以加在載體成分的頂部。載體成分可以是例如去離子水(“DI水”)或目標(biāo)物修復(fù)緩沖溶液。溶劑(例如Histoclear 1膽或Clearify?),具有比水更低的密度，因此將浮在水的頂部，由此產(chǎn)生液體兩相系統(tǒng)。
[0059]可以通過(guò)將在表面上含有包埋的生物樣本的支撐物或樣本支架放置到容器中，并將兩相系統(tǒng)的試劑引入預(yù)處理槽或容器中來(lái)執(zhí)行該方法。在脫石蠟過(guò)程中，載體成分的體積會(huì)改變。例如，載體成分的體積可能會(huì)增加，從而引起上層溶劑朝向容器或預(yù)處理槽的頂部或上端部輸送，因此，穩(wěn)定地掃過(guò)包埋的生物樣本。在一個(gè)實(shí)施方式中，溶劑層立即部分覆蓋包埋的生物樣本。在另一實(shí)施方式中，溶劑層立即完全覆蓋包埋的生物樣本。
[0060]在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施方式中，兩相系統(tǒng)提供用于包埋的樣本的脫石蠟的改進(jìn)方法和裝置。兩相在移動(dòng)中與樣本接觸是有益的。當(dāng)溶劑首次接觸到石蠟時(shí)，開始溶解石蠟。溶劑的運(yùn)動(dòng)可以協(xié)助一些石蠟脫離樣本。此后，載體成分與樣本以及溶劑和/或石蠟的殘留物接觸，洗掉溶劑和/或石蠟。任何被洗掉的溶劑和/或石蠟將會(huì)漂浮并與上相混合。如有必要，此過(guò)程可重復(fù)多次，直到實(shí)現(xiàn)樣本的最佳脫石蠟和洗滌。
[0061]根據(jù)本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施方式，此過(guò)程可以重復(fù)3次，即沿著玻片向上一次，然后沿著玻片向下，然后沿著玻片向上，然后進(jìn)入溢出。根據(jù)樣本和包埋介質(zhì)的類型不同，如果需要，也可以重復(fù)該過(guò)程更多次數(shù)。也可以操作更少的次數(shù)，例如只有一次，即，使溶劑層沿玻片向上移動(dòng)并進(jìn)入溢出。
[0062]在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施方式中，生物樣本的包埋介質(zhì)去除、再水化和目標(biāo)物修復(fù)，通過(guò)三個(gè)獨(dú)立的工序?qū)崿F(xiàn)，之后可以是應(yīng)用試劑來(lái)封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。這可以通過(guò)應(yīng)用本申請(qǐng)的兩相脫石蠟系統(tǒng)來(lái)完成。封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性的試劑可以加入載體成分。因此，當(dāng)用于溶解包埋介質(zhì)的溶劑最后一次掃過(guò)樣本時(shí)，包含封閉劑的載體成分與樣本接觸，并基本上封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。如前面所提及的，當(dāng)應(yīng)用兩相系統(tǒng)時(shí)，再水化的步驟不是必要的，因此樣本可以直接進(jìn)行至目標(biāo)物修復(fù)。
[0063]在本申請(qǐng)的另一個(gè)實(shí)施方式中，生物樣本的包埋介質(zhì)去除、再水化及目標(biāo)物修復(fù)，以及應(yīng)用試劑以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，可以組合到單一的步驟中。這個(gè)實(shí)施方式可以稱為4合I法。
[0064]基于非溶劑的過(guò)程，通常被稱為3合1，通常用在與福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣本中表位的目標(biāo)物修復(fù)相關(guān)的免疫組織化學(xué)中。3合I過(guò)程包括，在染色前對(duì)福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片進(jìn)行脫石蠟、再水化和熱誘導(dǎo)表位修復(fù)(HIER)的步驟，應(yīng)用單一的試劑(例如，DAKO ;S2375)。3合I試劑與包埋的樣本接觸，且試劑和/或樣本加熱到包埋介質(zhì)的熔點(diǎn)以上。包埋介質(zhì)熔化，能夠從樣本中移除。
[0065]當(dāng)在容器或預(yù)處理槽中進(jìn)行3合I工序時(shí)，本申請(qǐng)的裝置和方法可以用于從容器或預(yù)處理槽中去除熔化的包埋介質(zhì)，而包埋介質(zhì)不會(huì)與樣本再次接觸。這是有利的，因?yàn)槿绻コ陌窠橘|(zhì)與樣本再次接觸，可能會(huì)在樣本上留下包埋介質(zhì)殘留物。熔化的包埋介質(zhì)的密度比3合I試劑的密度更低，因此，浮在3合I試劑的頂部，形成兩相系統(tǒng)。之后，通過(guò)本文所述的溢出，并且根據(jù)本申請(qǐng)的方法和裝置，上層(即包埋介質(zhì))從容器或預(yù)處理槽中去除。
[0066]在本申請(qǐng)的另一實(shí)施方式中，脫石蠟、再水化、目標(biāo)物修復(fù)和應(yīng)用試劑來(lái)封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，可以組合成單一試劑中的單一過(guò)程，也稱為4合I。4合I試劑與3合I的類似，也就是說(shuō)，其能夠執(zhí)行脫蠟、再水化和目標(biāo)物修復(fù)的步驟，但其還包括內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉的步驟。過(guò)氧化物酶會(huì)影響在染色中使用另一過(guò)氧化物酶例如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的染色，因?yàn)樗鼈兇呋嗤牡孜?。傳統(tǒng)的3合I工序和試劑不涉及酶封閉步驟，其會(huì)延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間，從而增加檢測(cè)成本，不管是對(duì)于自動(dòng)化和手動(dòng)操作。傳統(tǒng)的3合I手動(dòng)操作還涉及酶封閉步驟所需的增加的手工時(shí)間。4合I應(yīng)用意味著，以前僅用于修復(fù)免疫目標(biāo)物的加熱步驟，現(xiàn)在包括脫蠟、再水化、目標(biāo)物修復(fù)和過(guò)氧化物酶封閉。
[0067]相比于傳統(tǒng)的獨(dú)立單元操作，用于免疫組織化學(xué)的4合I試劑減少所涉及的步驟數(shù)量。此外，4合I緩沖液使得四個(gè)步驟同時(shí)進(jìn)行，從而降低檢測(cè)時(shí)間。對(duì)于完全自動(dòng)化、半自動(dòng)化、和手動(dòng)進(jìn)行的檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間可以減少。在手動(dòng)進(jìn)行的檢測(cè)中，也減少所需的手工時(shí)間。可以使用用于熱誘導(dǎo)表位修復(fù)的任何加熱裝置來(lái)使用4合I方法。通常以傳統(tǒng)順序執(zhí)行這些步驟，將花費(fèi)40至60分鐘。使用4合I的總檢測(cè)時(shí)間可以減少到，例如，20至40分鐘。該時(shí)間可以用來(lái)在4合I緩沖液中加熱玻片。處理時(shí)間的減少將使得實(shí)驗(yàn)室人員在一個(gè)工作日內(nèi)執(zhí)行兩輪或更多輪免疫組織化學(xué)檢測(cè)。處理時(shí)間的減少也將改善檢測(cè)的工作流程。4合I工序可結(jié)合，例如，DAKO的目標(biāo)物修復(fù)緩沖液S2367和S1699進(jìn)行使用。
[0068]在至少一個(gè)實(shí)施方式中，4合I工序可以涉及首先烘烤玻片，然后在4合I緩沖液中加熱玻片例如約20至40分鐘，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。例如，在標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)工序中，在二甲苯中的脫石蠟可能進(jìn)行兩次，每次花費(fèi)約5分鐘，然后在醇中的再水化可能進(jìn)行四次，每次花費(fèi)約5分鐘，然后熱誘導(dǎo)表位修復(fù)例如約20至40分鐘，然后酶封閉可能花費(fèi)約10分鐘，然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。[0069]在本申請(qǐng)的至少一個(gè)實(shí)施方式中，石蠟包埋的組織切片直接放置在含有4合I緩沖液的容器中并加熱。可以通過(guò)本領(lǐng)域中通常已知的設(shè)備和方法例如水浴，向工序供熱。加熱后，玻片在洗滌緩沖液中洗滌，并在隨后相應(yīng)地進(jìn)展到實(shí)驗(yàn)室使用的免疫組織化學(xué)方法。通過(guò)使用4合I試劑，將有效地封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，同時(shí)在加熱后的洗滌步驟中，切片上的石蠟將熔化并洗去。在至少一個(gè)實(shí)施方式中，成功地使用濃度為0.075%至
0.00005%，例如0.075%至0.0000025 %的過(guò)氧化氫。雖然先前已嘗試使用過(guò)氧化氫作為抑制劑，結(jié)果不盡如人意，直到發(fā)明本文公開的添加非常低濃度的概念。
[0070]在本申請(qǐng)的另一個(gè)實(shí)施方式中，執(zhí)行染色后清潔工序來(lái)進(jìn)一步降低樣本中石蠟或溶劑殘留的可能性。根據(jù)此實(shí)施方式，染色的樣本或生物樣本還暴露于能夠溶解任何殘留物的成分中。例如，在封片之前，將染色的生物樣本暴露于能夠溶解任何石蠟介質(zhì)的溶劑中。
[0071]本申請(qǐng)的實(shí)施方式還涉及系統(tǒng)、裝置、組合物和方法，用于處理生物樣本，尤其是包埋的生物樣本的預(yù)處理，例如通過(guò)溶劑的方式從包埋的生物樣本中去除包埋介質(zhì)。
[0072]本申請(qǐng)還涉及用于自動(dòng)化生物樣本處理裝置的控制、管理、追蹤、監(jiān)控、時(shí)序安排、和診斷的軟件和硬件。根據(jù)本申請(qǐng)的系統(tǒng)、方法和裝置使得玻片上或其他載體或基質(zhì)(玻片)上的生物樣本可以在自動(dòng)處理裝置(例如自動(dòng)染色裝置(染色機(jī)))中進(jìn)行自動(dòng)預(yù)處理，從而使生物樣本的整個(gè)處理可以在單個(gè)儀器上自動(dòng)地進(jìn)行。
[0073]溶劑一般具有快速軟化、液化或溶解包埋介質(zhì)的性質(zhì)。溶劑在室溫下，即在約19至250C或更高，例如高達(dá)40°C或60°C時(shí)，在數(shù)分鐘內(nèi)或甚至例如在數(shù)秒鐘內(nèi)溶解例如石蠟。形成層的試劑可以基于物理性質(zhì)進(jìn)行選擇，物理性質(zhì)包括快速擴(kuò)散到包埋介質(zhì)中從而溶解包埋介質(zhì)的能力。溶解的包埋介質(zhì)在此后將很容易去除或在去除前被進(jìn)一步稀釋。
[0074]在形成層的試劑是溶劑的實(shí)施方式中，除其他性質(zhì)外，溶劑可以具有低粘度、低氣味、以及在儲(chǔ)存和使用過(guò)程中的高穩(wěn)定性。低粘度促使溶劑向樣本輸送，確保溶劑快速鋪展在樣本上并滲透入組織，且在洗滌過(guò)程中易于除去。
[0075]如在本申請(qǐng)中使用的，具有低粘度的溶劑是指，室溫下動(dòng)力粘度低于500cP的溶齊U。在一些實(shí)施方式中，可以使用粘度低于85cP，例如粘度低于30cP的溶劑或溶劑混合物。低粘度溶劑的非窮舉實(shí)例是植物油，例如粘度為約25至150cp的大豆油、玉米油、油菜籽油、橄欖油或其他天然油，而其相應(yīng)的單醇酯，如甲酯，可以具有10至50cP或更低的粘度。
[0076]在本申請(qǐng)的至少一個(gè)實(shí)施方式中，溶劑在化學(xué)上不活躍，以防止樣本的改變。換言之，溶劑不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，即穩(wěn)定，以防止樣本的改變。一般來(lái)說(shuō)，在室溫下，溶劑能夠在溶液中容納高濃度的包埋介質(zhì)，例如石蠟。從而，可以使用最小體積的溶劑并防止包埋介質(zhì)例如石蠟的析出。
[0077]在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施方式中，溶劑具有高沸點(diǎn)、低可燃性、高閃點(diǎn)或無(wú)閃點(diǎn)。在本申請(qǐng)的另一個(gè)實(shí)施方式中，溶劑不易燃。這類溶劑的實(shí)例，例如，油，可用在食品應(yīng)用中作為例如食用油；用在制藥工業(yè)中，用于例如溶解和穩(wěn)定藥物；用在化妝品行業(yè)中作為例如潤(rùn)膚劑；以及用在涂料行業(yè)中作為例如稀釋劑。
[0078]在優(yōu)選實(shí)施方式中，本申請(qǐng)的溶劑或作用劑對(duì)于人以及大體環(huán)境為低毒性或無(wú)毒性，使得可以方便消滅以及廢品處理。
[0079]在實(shí)施方式中，對(duì)合適溶劑或溶劑混合物的選擇可以通過(guò)使用Hansen溶解度模型來(lái)完成，該模型總結(jié)了溶劑或包埋介質(zhì)在三維空間的分散、極性和氫鍵特性。
[0080]例如密度、蒸氣壓、蒸發(fā)速率、閃點(diǎn)、沸點(diǎn)等的性能可以更容易地進(jìn)行調(diào)整以適應(yīng)實(shí)際使用，并仍然保持可接受程度的溶解能力。對(duì)于各特定溶劑的各個(gè)參數(shù)值，可以從各種文獻(xiàn)來(lái)源處得到。在文獻(xiàn)中也有計(jì)算或估計(jì)不常用溶劑的參數(shù)的方法。
[0081]對(duì)于溶劑或溶劑混合物，在3維空間中的所得點(diǎn)可以表示溶質(zhì)的溶解度，大致的球形包圍這個(gè)點(diǎn)并定義對(duì)于溶質(zhì)的“交互半徑”(Ir)。在理論上而言，3維溶解度參數(shù)落入球體的溶劑可以溶解包埋介質(zhì)。
[0082]在一些實(shí)施方式中，溶劑將溶解包埋介質(zhì)。得到的液體可從樣本除去。液體的密度低于用作載體層的水性洗滌緩沖液，因此將從樣本中分離并浮到水性緩沖液的表面。
[0083]在本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方式中，溶劑的密度低于用來(lái)除去溶劑和所溶解包埋介質(zhì)的載體成分(例如洗滌緩沖液)的密度。溶劑的密度可以低于1.00g/ml。例如，如果石蠟包埋的生物樣本暴露于溶劑丨Hslo-Clearto (密度相當(dāng)于約0.84的石蠟油)，當(dāng)暴露于密度為約
1.0og/mi或由于其鹽含量而密度更高的水性洗滌緩沖液時(shí)，得到的Histo-Clear?和石蠟液體將從樣本上分離并上升至樣本的頂部，以方便除去。在一些實(shí)施方式中，大部分的包埋介質(zhì)被溶劑取代并在用載體成分(包括例如水性緩沖液)洗滌玻片之前溶解。
[0084]溶劑與載體成分的密度差將加強(qiáng)從樣本中分離包埋介質(zhì)的效率?？梢酝ㄟ^(guò)操作例如水性洗滌緩沖液中的鹽含量以及溶劑的確切混合來(lái)增加所述密度差。
[0085]根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，兩相系統(tǒng)創(chuàng)建在容器或預(yù)處理槽內(nèi)，之后將支撐物上的包埋的生物樣本放入兩相系統(tǒng)中。由此，用于除去包埋介質(zhì)的溶劑，將在與樣本接觸時(shí)除去生物樣本的包埋介質(zhì)。之后，處理過(guò)的生物樣本可以很容易地在單獨(dú)容器中洗滌，以除去任何殘余的溶劑。
[0086]根據(jù)本申請(qǐng)的另一個(gè)實(shí)施方式，將用于除去包埋介質(zhì)的形成層的試劑，例如溶劑，放入容器或預(yù)處理槽中，之后將載體成分引入容器中。這引起用于除去包埋介質(zhì)的溶劑從容器底部朝向容器或預(yù)處理槽的頂部或上端部輸送。將用于除去包埋介質(zhì)的溶劑在包埋的生物樣本上傳輸?shù)姆椒梢宰兓幻撾x本申請(qǐng)的范圍。因而，已放置在容器中的支撐物上的包埋的生物樣本將與兩個(gè)液相接觸。當(dāng)形成層的試劑在包埋的生物樣本上傳輸時(shí)，用于除去包埋介質(zhì)的形成層的試劑將與包埋的生物樣本接觸并開始除去包埋介質(zhì)。當(dāng)形成層的試劑已經(jīng)通過(guò)生物樣本時(shí)，更低位的載體成分層基本上用作洗滌溶液，漂洗不含包埋介質(zhì)和溶劑的生物樣本。幾分鐘的孵育后，將載體溶液引入到容器的過(guò)程可以停止或重復(fù)例如二、三或四次。
[0087]當(dāng)包埋介質(zhì)已經(jīng)從包埋的生物樣本中去除后，形成層的試劑或溶劑層可以在容器的底部，或在容器的頂部。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，當(dāng)溶劑在容器的底部時(shí)，可以重復(fù)使用或通過(guò)在容器底部的出口進(jìn)行去除，且任何多余的溶劑可以從生物樣本中漂洗掉。
[0088]按照本申請(qǐng)的另一個(gè)實(shí)施方式，載體溶液的體積可以增加至超過(guò)可包含在容器或預(yù)處理槽中的體積，從而通過(guò)溢出而從容器中除去大部分形成層的試劑，例如排出到排水管中。之后，目標(biāo)物修復(fù)可以在同一容器中通過(guò)施加熱和所需的方法步驟來(lái)進(jìn)行。
[0089]通過(guò)采用溢出法，載體溶液可以用作洗滌溶液/漂洗溶液，減少添加溶液的需要或步驟。此外，這種方法還防止將用于除去包埋介質(zhì)的溶劑攜帶到其他后續(xù)處理步驟中，有助于使交叉污染降至最低。[0090]在一些實(shí)施方式中，在脫石蠟后，樣本可以用醇或稀釋的醇溶液漂洗，其可以除去任何殘留的溶劑。例如，可以使用乙醇溶液。合適的乙醇濃度的例子是水中的10%乙醇、20%乙醇或30%乙醇。這些成分成功地從樣本去除任何殘余的溶劑，但具有足夠高的閃點(diǎn)和沸點(diǎn)，因此消除了火災(zāi)或爆炸的危險(xiǎn)并且毒性降低。這樣的乙醇洗滌可以在脫石蠟后的任何時(shí)間進(jìn)行，但要在向樣本應(yīng)用抗體或探針之前。
[0091]可以在同一容器中將不混溶兩相系統(tǒng)與目標(biāo)物修復(fù)進(jìn)行組合，與現(xiàn)有技術(shù)相比，既不需要使用二甲苯，也不需要使用醇。用于除去包埋介質(zhì)的溶劑也稱為上層、上相、或上層溶劑，這些術(shù)語(yǔ)可以互換使用。在本申請(qǐng)中所用的溶劑包括能夠溶解包埋介質(zhì)的有機(jī)溶齊?。合適溶劑的例子包括，但不限于，氫化萘、環(huán)烷烴、d-檸檬烯、石蠟烴/異烷烴、石蠟基二醇醚(paraffinic-glycol etheter)、燒烴或其組合物。
[0092]環(huán)烷烴的銷售品牌為Formula83TM和Histochoice ;d_檸檬烯的銷售品牌為Americlear、Bioclear> Clearene、Hemo-DE、Histoclear> HistoSolve X、Master Clear 和Safsolv0 石臘烴 / 異燒烴的銷售品牌為 Clearify、ClearinglOO、Clear Rite3、IsoparL、Isopar G、Isopar H、Micro—Clear、Micro—Clear—HC、Micro—Clear—R、Paraclear、SafeClear>Safe Clear II>Shandon XY、Slide_Brite、Xy-Less、XS-3。石臘基二醇醚混合物的銷售品牌為Pro-Par。
[0093]溶劑的其他例子是Histo-Clear豪或Histo-Clea成II，其為高級(jí)油的復(fù)合混
合物。Histo-Clear? 是由 National Diagnostics, Atlanta, GA 銷售的有機(jī)溶劑的商品
名。HistoClear (CltlH16)是在植物中發(fā)現(xiàn)的天然存在的烴類。IlistO-Clear?也已知為
1-甲基-4 (1-甲基乙烯基)環(huán)己燒對(duì)薄荷_1，8- 二稀、d—朽1樣稀、Safsolv (商品名，由 BrodiSpecialty Products, Ltd.銷售)、histolene、雙戍烯。Fisher Scientific 的citrisolv,是d_朽1檬烯類溶劑,也可以用作安全的二甲苯和乙酸乙酯替代品。
[0094]Clearify?和HI StO-C Iear(R) 能是特別有用的溶劑，因?yàn)樵S多包埋介質(zhì)，例如石蠟，含有高聚物，難以用溫?zé)岬乃韵礈烊芤?例如水性緩沖液)除去。Isopar也非常有用，因?yàn)槠錃馕遁^小且相對(duì)便宜。
[0095]有用溶劑的其他例子是烷烴類，包括戊烷、庚烷、己烷、辛烷和更高的類似物和支鏈異構(gòu)體，包括十二烷；甲苯、氯苯、1-甲基萘、二異丁基甲酮、聯(lián)苯和各種鹵化溶劑，及其混合物。
[0096]合適溶劑的其他例子是基于動(dòng)物、植物或礦物來(lái)源的油或混合物。植物油可以是精油和天然油。天然油與動(dòng)物油脂相似。天然油是天然存在的長(zhǎng)鏈脂肪酸的甘油三酯，其可生物降解并具有低毒性。粗制天然油可以通過(guò)例如除去游離脂肪酸，漂白和在真空下汽提以除去氣味、香料和一些色素形成產(chǎn)物，在萃取后變成精制油。
[0097]可能令人感興趣的是低毒性或無(wú)毒性的溶劑或油，包括動(dòng)物油和植物油。植物油可以是甘油與脂肪酸的多種共混物的酯。植物油具有低毒性和低可燃性，并且廣泛可得。植物油來(lái)源的例子包括，但不限于，含油種子如腰果、蓖麻子、椰子籽、亞麻籽、葡萄籽、大麻、芥末、罌粟種子、油菜籽、加拿大油菜、紅花、芝麻籽、和向日葵。植物油的其他來(lái)源包括，但不限于，杏仁、杏、鱷梨、玉蜀黍/玉米、棉花、可可籽、黃油、椰子、鐮刀菌、榛實(shí)、苦楝、橄欖、棕櫚葉和棕仁、花生、南瓜、大米、大豆和胡桃。[0098]例如，油包括，但不限于，得自玉米、大豆、棕櫚、油菜籽、向日葵籽、花生、棉籽、棕仁、和橄欖的油或油混合物。植物油可以包括，但不限于，基于辛酸和癸脂的氫化植物油、精制油及混合物。
[0099]在本申請(qǐng)的一些實(shí)施方式中，溶劑可以包括植物油的酯。酯可以是從植物油的醇解制備而來(lái)的混合脂肪酸酯。一般而言，相比于制備脂肪酸酯的植物油的粘度和穩(wěn)定性，這樣的混合脂肪酸酯具有較低的粘度和改善的抗氧化穩(wěn)定性，其可以改善第一溶劑的粘度和穩(wěn)定性。在上述酯化反應(yīng)或酯交換反應(yīng)后得到的產(chǎn)物包括，例如，支鏈或直鏈伯醇與直鏈二元羧酸的酯、支鏈單羧酸與直鏈二醇或聚乙二醇的酯、直鏈伯醇與支鏈二元羧酸的酯、以及新戊基多元醇與一元羧酸的酯。
[0100]在本申請(qǐng)的其他實(shí)施方式中，第一溶劑可以包括脂肪酸甲酯(FAME)。脂肪酸甲酯可以通過(guò)脂或脂肪酸與甲醇之間的催化反應(yīng)制備而來(lái)。具有8至18個(gè)碳原子的甲酯實(shí)際上是無(wú)毒的。例如，溶劑可以包括乳酸乙酯、大豆甲酯、或大豆乙酯。
[0101]可以通過(guò)添加抗氧化劑來(lái)降低溶劑抗降解(主要是氧化)的穩(wěn)定性。抗氧化劑的例子包括，但不限于，受阻苯酚，例如丁基化羥基甲苯(BHT)和二丁基對(duì)甲酚；特定的胺，例如苯基α-萘胺；硫和磷或同時(shí)含有這些元素的化合物；金屬酚鹽，例如苯酚二硫化物的堿土金屬化合物；硫代磷酸鹽和氨基甲酸鹽的鋅化合物，例如二烷基二硫代磷酸鋅。
[0102]另外，由電離輻射引起的自由基反應(yīng)，可以通過(guò)向溶劑中添加吸收300至400nm波長(zhǎng)的化合物來(lái)減少。這類化合物的例子是羥基二苯酮和羥基苯基苯并三唑。
[0103]在實(shí)施方式中，溶劑或試劑可以包括染料、熒光添加劑、氣味劑和/或抗微生物防腐劑。通過(guò)向溶液添加染料或氣味劑，可以對(duì)某些類型的試劑、溶劑、操作指南和儀器提供獨(dú)特外觀。
[0104]合適染料的實(shí)例包括，但不限于，不溶于水、油溶性的偶氮染料，例如1-(2，4_ 二甲基苯基偶氮)~2~輕基-萘，其為紅色；或2，3- 二甲基-4- (2-輕基-1-偶氮萘基)-偶氮苯，其為紅褐色。
[0105]可以添加氣味劑來(lái)遮蓋溶劑或試劑的本來(lái)氣味，以改善用戶對(duì)它們的接受性和認(rèn)可度。這些產(chǎn)品包括物質(zhì)，例如薄荷、松樹油和香茅油。尤其是一些天然油例如柑橘類油的獨(dú)特氣味，可以通過(guò)添加讓人愉悅的氣味劑來(lái)轉(zhuǎn)變。
[0106]抗微生物防腐劑可以添加到溶劑中，以抑制微生物的生長(zhǎng)，并從而延長(zhǎng)貯藏期限。合適的人造防腐劑的例子包括，但不限于，咪唑啉、氨基乙縮醛、六氫三嗪、惡唑烷衍生物、O-縮甲醛、苯氧基醇和異噻唑啉酮衍生物。
[0107]載體成分、載體液，也可以稱為下層、下層溶劑、下相或第一相、或第一相液。這些術(shù)語(yǔ)在本申請(qǐng)中互換使用。合適的載體成分是水和各種水性溶液，例如緩沖溶液或目標(biāo)物修復(fù)溶液。本文所提及的同時(shí)用于兩層的溶劑也可以用于4合I工序。
[0108]根據(jù)本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施方式，載體成分用作洗滌溶液，對(duì)來(lái)自生物樣本的溶劑和/或包埋介質(zhì)進(jìn)行洗滌。清潔劑可以添加到第二溶液中，以改善其洗滌能力。
[0109]當(dāng)二甲苯用于除去包埋介質(zhì)時(shí)，按常規(guī)進(jìn)行包埋的生物樣本的再水化，以從生物樣本中去除二甲苯。然而，當(dāng)使用本申請(qǐng)的方法時(shí)，再水化生物樣本不是必需的。因此，可以從包埋介質(zhì)的去除直接前進(jìn)到例如目標(biāo)物修復(fù)。
[0110]在不進(jìn)行目標(biāo)物修復(fù)的方法中(例如，由于表位的靈敏性)，利用本申請(qǐng)來(lái)去除所有的包埋介質(zhì)，提高測(cè)試的性能。當(dāng)使用傳統(tǒng)的方法來(lái)除去包埋介質(zhì)時(shí)，通常在生物樣本中殘留有少量的包埋介質(zhì)。
[0111]生物樣本的固定經(jīng)常破壞結(jié)構(gòu)或遮蓋抗體的結(jié)合位點(diǎn)，從而降低小肽(eptide)或表位的抗原性。因此，可能難以檢測(cè)對(duì)常規(guī)IHC法中福爾馬林固定敏感的表位。熱誘導(dǎo)表位修復(fù)(HIER)可以恢復(fù)抗原性，并已成功地用于檢測(cè)固定生物樣本中的多種抗原。
[0112]根據(jù)本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施方式，表位修復(fù)溶液(也稱為目標(biāo)物修復(fù)溶液)可以用作載體成分。因此，在除去包埋介質(zhì)之后，可以在生物樣本中進(jìn)行目標(biāo)物修復(fù)，其中的全部或至少大部分生物樣本完全浸在目標(biāo)物修復(fù)溶液中。用于HIER的合適溶液是例如鈣螯合劑，諸如檸檬酸鹽緩沖液、MES緩沖液或Tris-EDTA溶液。
[0113]根據(jù)本申請(qǐng)的另一個(gè)目的，包含溶劑的上相用作處于目標(biāo)物修復(fù)溶液的頂部的蓋子，以使加熱過(guò)程中的蒸發(fā)降至最低。因此，減少在裝置中的冷凝以及生物樣本的干燥和過(guò)熱。
[0114]根據(jù)本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施方式，第一溶液(溶劑或形成層的試劑)和第二溶液(載體成分)相組合，以形成兩相系統(tǒng)。在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施方式中，形成層的試劑的體積是固定的，而載體成分的體積是變化的。因此，當(dāng)載體成分的體積增加時(shí)，包含第一溶液的相在容器或預(yù)處理槽中上行，當(dāng)載體成分的體積減少時(shí)，包含形成層的試劑的相在容器中下行。當(dāng)將具有生物樣本的載體插入到容器中時(shí)，載體成分的體積是變化的，包含形成層的試劑的相在生物樣本表面上上行和下行。在該過(guò)程中，形成層的試劑去除生物樣本中的任何包埋介質(zhì)。
[0115]形成層的試劑的厚度取決于容器的尺寸、第二溶液的體積、和載有生物樣本的載體或支撐物的體積。因此，不同厚度的形成層的試劑均包含在本申請(qǐng)中。根據(jù)本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施方式，形成層的試劑的厚度可以非常小或薄。這造成所需的第一溶液的體積小、更環(huán)保、更簡(jiǎn)便、并降低成本。在一個(gè)實(shí)施方式中，形成層的試劑(也被稱為第二相或溶劑層)可以具有的厚度為約1cm。
[0116]包含形成層的試劑的相在包埋的生物樣本表面上運(yùn)行一次或通過(guò)一次，通常會(huì)引起足量的脫石蠟，從而使得生物樣本可以進(jìn)一步完備以進(jìn)行目標(biāo)物修復(fù)或其他處理步驟。本公開也將用于優(yōu)化包埋介質(zhì)的去除的額外運(yùn)行或通過(guò)考慮在內(nèi)。
[0117]用于預(yù)處理包埋的生物樣本的本方法的一個(gè)實(shí)施方式，包括提供兩相不混溶系統(tǒng)，上相能夠降低包埋介質(zhì)的熔點(diǎn)或溶解包埋介質(zhì)，下相用作載體溶劑；將包埋的生物樣本暴露于不混溶兩相系統(tǒng)，從而液化包埋介質(zhì)；通過(guò)溢出過(guò)程除去上相；任選地用漂洗溶液(例如去離子水(“DI水”)或目標(biāo)物修復(fù)溶液)漂洗樣本。
[0118]本申請(qǐng)的實(shí)施方式還包括:提供容器，其中提供至少一部分的不混溶兩相系統(tǒng)。所述容器，在本公開中也可以稱為處理槽、浸泡槽或預(yù)處理槽。在實(shí)施方式中，將樣本暴露于不混溶兩相系統(tǒng)的步驟包括將樣本浸在處理槽中的步驟。在一些實(shí)施方式中，樣本豎直放置在處理槽中。
[0119]本申請(qǐng)的一些實(shí)施方式還提供供給裝置，以向包埋的生物樣本供應(yīng)不混溶兩相系統(tǒng)。供給裝置可以包含溶劑源、供給噴嘴和將溶劑由源頭供應(yīng)到供給噴嘴的供給管，由此溶劑可以經(jīng)噴嘴供給到樣本。在本申請(qǐng)的另一個(gè)實(shí)施方式中，形成層的試劑、或溶劑，可以經(jīng)入口或閥引入預(yù)處理槽。[0120]在一些實(shí)施方式中，使包埋的生物樣本暴露于不混溶兩相系統(tǒng)的步驟，包括用載體成分(也稱為下層或載體層)沖洗樣本的任選步驟。任選漂洗步驟可通過(guò)與兩相系統(tǒng)中使用的相同的載體成分或通過(guò)不同的載體成分來(lái)完成。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)入口或供給裝置將載體成分供給到預(yù)處理槽，從而完成漂洗。在一些實(shí)施方式中，樣本在下層或載體層的連續(xù)流動(dòng)下漂洗一段預(yù)定時(shí)間。按照其他實(shí)施方式，樣本在數(shù)個(gè)漂洗期間用下層或載體層漂洗；各個(gè)漂洗期具有預(yù)定的時(shí)間長(zhǎng)度，且兩個(gè)漂洗期通過(guò)預(yù)定時(shí)間長(zhǎng)度的非漂洗期隔開。在某些情況下，在樣本已經(jīng)被不混溶兩相系統(tǒng)漂洗后，任選的漂洗步驟可能不是必要的，因?yàn)槌浞至康陌癫牧弦呀?jīng)被去除且玻片充分潔凈。
[0121]上述的漂洗步驟，也稱為不混溶兩相系統(tǒng)漂洗循環(huán)，可以重復(fù)需要的次數(shù)，例如兩次或三次或更多次。
[0122]在實(shí)施方式中，在將新的不混溶兩相系統(tǒng)供給至樣本之前，從樣本中除去已經(jīng)供給至樣本的不混溶兩相系統(tǒng)。
[0123]本申請(qǐng)的實(shí)施方式還可以提供機(jī)械裝置，以用于從容器或預(yù)處理槽中去除不混溶兩相系統(tǒng)。例如，上部水平移動(dòng)條，將上層從預(yù)處理容器中移至例如排水管。不混溶兩相系統(tǒng)可以例如通過(guò)配置成將不混溶兩相系統(tǒng)從樣本上吹落的鼓風(fēng)機(jī)而完全或部分地除去，或者溶劑可以通過(guò)配置成抽吸溶劑的抽吸裝置而去除。作為替代方案，鼓風(fēng)機(jī)可以配置有額外的抽吸能力，由此不混溶兩相系統(tǒng)可以通過(guò)鼓風(fēng)機(jī)吹走或抽吸。此外，可以通過(guò)溢出來(lái)首先除去上層并收集上層來(lái)去除不混溶兩相系統(tǒng)。
[0124]在一些實(shí)施方式中，供給裝置，例如供給管、供給噴嘴、入口，還包含鼓風(fēng)機(jī)或氣體噴嘴，用于將氣體吹到載玻片上以干燥玻片或吹走載玻片上可能存在的液體，例如上層、下層、不混溶兩相系統(tǒng)、或任選的其他洗滌溶液。
[0125]在一些實(shí)施方式中，也可以使用離心機(jī)來(lái)除去液體，例如，上層、下層、不混溶兩相系統(tǒng)、或任選的其他洗滌溶液，從而通過(guò)離心機(jī)的離心力的方式除去液體。離心機(jī)可以配置成繞一個(gè)或多個(gè)旋轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)。旋轉(zhuǎn)軸線可以是在玻片平面中的軸或與玻片平面平行的軸，或垂直于玻片平面的軸。
[0126]在一些實(shí)施方式中，玻片放置在一個(gè)或多個(gè)入附著點(diǎn)上或放置在固定裝置上，這樣使得玻片緩慢地或快速地傾斜或旋轉(zhuǎn)，以協(xié)助有效地從玻片上除去液體。
[0127]在一些實(shí)施方式中，從樣本去除液體，通過(guò)引力的方式進(jìn)行。載有樣本的玻片可以例如放置成豎直位置，由此由于引力或通過(guò)溢出，液體將流出玻片。
[0128]在實(shí)施方式中，提供洗滌溶液來(lái)從樣本中洗掉可能殘留的液化包埋介質(zhì)的任選步驟，包括提供用于供給洗滌溶液的洗滌溶液供給裝置的步驟。洗滌溶液供給裝置可以包含洗滌溶液源、洗滌溶液供給噴嘴和用于將洗滌溶液從源頭經(jīng)供給噴嘴或入口供給至樣本的洗滌溶液供給管。在一些實(shí)施方式中，洗滌溶液的供給和樣本的洗滌是自動(dòng)控制的。在一些實(shí)施方式中，溶劑供給噴嘴以及可能地部分溶劑管配置成，行使洗滌溶液供給噴嘴以及可能地部分洗滌溶液管的功能。
[0129]按照實(shí)施方式，載體成分、下層或載體層或任選的漂洗溶液是能夠除去液化包埋介質(zhì)的水性緩沖溶液，并與上層不混溶。在一個(gè)實(shí)施方式中，載體層可以是DI水。水性緩沖溶液的實(shí)例是，但不限于，Tris-緩沖鹽水吐溫20 (“TBST”)、PBS、H印es、MES緩沖液和傳統(tǒng)的IHC和ISH目標(biāo)物修復(fù)溶液。[0130]本申請(qǐng)的一些實(shí)施方式還包括，在去除包埋介質(zhì)，即脫蠟或脫石蠟之前，任選地用含有疏水性染料例如偶氮染料、蘇丹黑或油紅O的洗滌溶液來(lái)漂洗包埋的生物樣本。染料可以選擇為，可以通過(guò)所使用的相機(jī)給出高對(duì)比度的畫面。例如，染料可以非共價(jià)鍵結(jié)合至包埋介質(zhì)以及組織。在洗滌后，包埋的生物樣本將著色，而周圍的玻片幾乎未著色。成像裝置諸如相機(jī)攝取的著色的包埋的生物樣本以及玻片的圖像可以進(jìn)行分析，由此著色的包埋的生物樣本及其尺寸和在玻片或支撐物上的位置可以一同檢測(cè)。這些信息可以被例如染色機(jī)使用，以限定試劑滴加區(qū)域、所需的試劑體積，并確保染色過(guò)程的質(zhì)量。在包埋介質(zhì)的去除過(guò)程中除去染料。染料可以進(jìn)一步用來(lái)確認(rèn)包埋介質(zhì)的去除，例如脫蠟或脫石蠟，以及確認(rèn)洗滌是有效的。
[0131]傳統(tǒng)上而言，進(jìn)行按序的醇處理，以在組織中從有機(jī)相變到水相。本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N方法，其中當(dāng)完整除去包埋介質(zhì)時(shí)，生物樣本處于水性環(huán)境中，且包埋介質(zhì)已經(jīng)被水性成分(載體成分)取代。因此，基本上消除對(duì)隨后的傳統(tǒng)再水化步驟的需求。通過(guò)基本上消除傳統(tǒng)的醇步驟，使整個(gè)過(guò)程簡(jiǎn)化，從而避免醇的不便之處，即易燃性和毒性。
[0132]本申請(qǐng)的方法，使得可以從脫蠟或脫石蠟過(guò)程中減少?gòu)U料的含量。此外，由于通常不在本申請(qǐng)中使用純的醇或高濃度的醇混合物，廢料的性質(zhì)發(fā)生變化，基本上避免具有大量醇的監(jiān)管和健康問(wèn)題。此外，按照本申請(qǐng)，通過(guò)使用無(wú)毒或低毒性的形成層的試劑，包埋的玻片的預(yù)處理過(guò)程被簡(jiǎn)化，并比傳統(tǒng)的去除法更安全，并保留至少相當(dāng)?shù)男省?br> [0133]如上所述，實(shí)施方式也可以包括任選的漂洗步驟，其中，樣本用漂洗溶液漂洗，例如去離子水或目標(biāo)物修復(fù)溶液。
[0134]如上所述，玻片上的液體，例如溶劑、洗滌溶液、漂洗溶液或目標(biāo)物修復(fù)溶液，可以用不同方式從玻片或支撐物上除去，例如，通過(guò)應(yīng)用氣體流、離心力、引力、毛細(xì)管力引起的流動(dòng)，通過(guò)抽吸的方式或通過(guò)移動(dòng)水平條。
[0135]在一些實(shí)施方式中，當(dāng)玻片或支撐物處于豎直位置時(shí)，樣本暴露于不混溶兩相體統(tǒng)和/或目標(biāo)物修復(fù)溶液。在這樣的豎直玻片位置，樣本也被認(rèn)為處于豎直位置。在豎直玻片上提供脫石蠟(即，在豎直位置的玻片上使用不混溶兩相系統(tǒng))的實(shí)施方式的優(yōu)點(diǎn)是，基本上避免或消除可能發(fā)生在不使用不混溶兩相系統(tǒng)的處理槽中的交叉污染或帶入。
[0136]“交叉污染”或“帶入”指的是，材料被帶入它們不屬于的反應(yīng)混合物中的過(guò)程。這些材料可以是部分的樣本、或試劑。在這種情況下，帶入指的是材料的轉(zhuǎn)移，例如樣本或試齊U，從一個(gè)容器，或從一個(gè)反應(yīng)混合物，到另一個(gè)。帶入在一系列的樣本或檢測(cè)中可以是單向或是雙向的。
[0137]此外，通過(guò)單個(gè)地處理玻片，眾多的處理操作指南可以在許多不同的玻片上平行運(yùn)行。另外，玻片不需要同時(shí)加載到樣本處理裝置例如染色機(jī)中，但是能夠在連續(xù)流動(dòng)過(guò)程中添加和移除，即，可以在染色機(jī)處理其他玻片時(shí)，從染色機(jī)中添加和移除玻片。
[0138]在包括利用不混溶兩相系統(tǒng)的豎式處理玻片的本申請(qǐng)實(shí)施方式中，基本上消除細(xì)胞從一個(gè)玻片帶入另一個(gè)玻片的可能性，因?yàn)闃颖静Ｆ话惚┞队谛迈r過(guò)濾的上層或目標(biāo)物修復(fù)溶液中，并且在使不混溶兩相系統(tǒng)單向地在樣本架中的玻片上通過(guò)的系統(tǒng)中，防止脫石蠟或目標(biāo)物修復(fù)過(guò)程中的由玻片之間細(xì)胞的攜帶而產(chǎn)生的可能的交叉污染。
[0139]利用不混溶兩相系統(tǒng)的豎式處理玻片或支撐物的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，在不同的步驟之間，例如在預(yù)處理步驟與進(jìn)一步樣本處理步驟之間，不需要清洗處理槽。因此，處理速度可以增加，且處理時(shí)間，例如總檢測(cè)時(shí)間(“TAT”)或測(cè)定的操作時(shí)間可以減少。
[0140]利用不混溶兩相系統(tǒng)的提供豎式玻片脫石蠟的實(shí)施方式的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，可以減少所需要的溶劑體積。與使用不含不混溶兩相系統(tǒng)的處理槽的豎式洗滌相比，由于不混溶兩相系統(tǒng)，可以例如使每個(gè)玻片使用更小的體積的溶劑。溶劑的體積可以小于每玻片每溶劑漂洗循環(huán)10毫升。例如，溶劑的體積可以小于每玻片每溶劑漂洗循環(huán)2毫升。在另一個(gè)例子中，溶劑的體積可以小于每玻片每溶劑漂洗循環(huán)300微升。此外，使用帶有不混溶兩相系統(tǒng)的豎式處理時(shí)，只有玻片具有樣本的一側(cè)需要暴露于互不混溶兩相系統(tǒng)(形成層的試劑和載體成分)。
[0141]應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)申請(qǐng)的方法也可以在升高的溫度下進(jìn)行。通常而言，隨著溫度的增力口，溶解力，即上層增溶或溶解包埋介質(zhì)的能力會(huì)增加。通過(guò)將脫蠟步驟期間的溫度提升至環(huán)境溫度以上，脫蠟將更加有效。上層經(jīng)過(guò)固體包埋介質(zhì)的第一滲透步驟可以通過(guò)溫度而提升。溫度升高，可以以不同的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可以在供給兩相系統(tǒng)之前，以及當(dāng)包埋的樣本暴露于兩相系統(tǒng)時(shí)，加熱包埋的樣本；或者在供給液體接觸樣本前加熱供給液。在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施方式中，非溶劑載體成分可以加到預(yù)處理容器中，并在與樣本接觸之前加熱至包埋介質(zhì)的熔點(diǎn)以上的溫度。隨后，在包埋介質(zhì)熔化以后，涼的載體成分加到預(yù)處理槽中。一旦接觸到熔化的包埋介質(zhì)，載體成分冷卻并有效地凝結(jié)包埋介質(zhì)，并在溢出時(shí)帶出預(yù)處理槽。
[0142]在一些實(shí)施方式中，升高的溫度可以在室溫與剛好低于包埋介質(zhì)的熔點(diǎn)之間。升高的溫度可以在25至60攝氏度的范圍內(nèi)。合適的溫度范圍可以是30至50攝氏度，進(jìn)一步在大約40攝氏度。
[0143]Autostainer?系統(tǒng)(LabVision Corporation)是自動(dòng)化的玻片處理系統(tǒng)的實(shí)例。該染色機(jī)與目前可用于例如石蠟包埋切片和冰凍組織切片、細(xì)胞離心涂片、細(xì)胞涂片、細(xì)針吸的染色試劑兼容。染色機(jī)設(shè)計(jì)成使經(jīng)常用在免疫組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)中的手動(dòng)染色方法自動(dòng)化。靈活的編程允許無(wú)限數(shù)量的含多達(dá)35個(gè)步驟的操作指南(包括在不同的處理步驟之間的漂洗和吹氣步驟)和64種不同的試劑。染色運(yùn)行可以處理I至48個(gè)顯微鏡玻片。單獨(dú)的玻片可以編程為，在染色操作指南的任何步驟中接收特定體積的不同試劑，且廢料分隔至危險(xiǎn)和非危險(xiǎn)廢料收集容器中，降低處理成本。染色機(jī)還設(shè)置成，追蹤各個(gè)數(shù)據(jù)。其可以生成病人、試劑和實(shí)時(shí)運(yùn)行的數(shù)據(jù)報(bào)告，以及追蹤試劑的使用以及記錄儀器的維護(hù)。在本文中，術(shù)語(yǔ)“試劑”可以包括化學(xué)或生物材料的任何液體或氣體，可以施加于樣本載體例如玻片，包括，但不限于，水性混合物、生物探針、聚合酶、抗體、消化酶、預(yù)固定劑、后固定齊U、可讀化學(xué)、染料和染液、標(biāo)記物色原、熒光團(tuán)、和溶劑。
[0144]可以在所有玻片上仔細(xì)監(jiān)測(cè)脫石蠟后的任何石蠟痕跡。通過(guò)利用石蠟的雙折射，可以使在正常明視場(chǎng)顯微鏡下難以檢測(cè)的石蠟殘留物可視化。
[0145]在一些實(shí)施方式中，用于處理玻片的方法包括，將一個(gè)或多個(gè)新的玻片引入樣本處理裝置例如染色機(jī)中，獲得一個(gè)或多個(gè)新玻片中至少一個(gè)的玻片識(shí)別信息，使用玻片識(shí)別信息從與染色機(jī)相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得針對(duì)一個(gè)或多個(gè)新玻片中至少一個(gè)的處理操作指南順序，并根據(jù)與針對(duì)一個(gè)或多個(gè)新玻片中至少一個(gè)新玻片的處理操作指南順序相對(duì)應(yīng)的指令表中的指令來(lái)處理新玻片。在一些實(shí)施方式中，在染色機(jī)處理先前放入染色機(jī)的任何舊玻片時(shí)，將一個(gè)或多個(gè)新的玻片引入染色機(jī)。[0146]在一些實(shí)施方式中，通過(guò)使用在至少一個(gè)新玻片上的玻片識(shí)別信息來(lái)檢索含有針對(duì)至少一個(gè)新玻片的處理操作指南順序的單獨(dú)玻片記錄，從而可以從與染色機(jī)相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得針對(duì)至少一個(gè)新玻片的處理操作指南順序。
[0147]在一些實(shí)施方式中，根據(jù)與針對(duì)至少一個(gè)新玻片的處理操作指南順序相對(duì)應(yīng)的指令表中的指令來(lái)處理至少一個(gè)新玻片，還包括創(chuàng)建與針對(duì)至少一個(gè)新玻片的處理操作指南順序中單個(gè)處理步驟相對(duì)應(yīng)的染色機(jī)指令列表，并對(duì)至少一個(gè)新玻片按順序執(zhí)行染色機(jī)指令表中的指令處理。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)與針對(duì)一個(gè)或多個(gè)新玻片中至少一個(gè)新玻片的處理操作指南順序相對(duì)應(yīng)的指令表中的指令來(lái)處理新玻片，可以通過(guò)染色機(jī)自發(fā)執(zhí)行。
[0148]在一些實(shí)施方式中，針對(duì)至少一個(gè)新玻片的玻片識(shí)別信息可以通過(guò)讀取含有附著于至少一個(gè)新玻片的編碼玻片識(shí)別信息的標(biāo)簽來(lái)獲得。在一些實(shí)施方式中，玻片識(shí)別可以通過(guò)讀取包含編碼玻片識(shí)別信息的圖標(biāo)(glyph)或條形碼來(lái)獲得。在一些實(shí)施方式中，針對(duì)至少一個(gè)新玻片的玻片識(shí)別信息可以通過(guò)讀取與至少一個(gè)新玻片相關(guān)的無(wú)線電頻率識(shí)別標(biāo)簽來(lái)獲得。
[0149]在一些實(shí)施方式中，與染色機(jī)相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以出于其他目的而進(jìn)行訪問(wèn)，包括玻片預(yù)處理、數(shù)據(jù)錄入、查詢、以及與處理先前放入染色機(jī)的舊玻片同時(shí)發(fā)生的報(bào)告生成。玻片預(yù)處理包括創(chuàng)建或更新與染色機(jī)相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)玻片的玻片記錄，以及生成附加至玻片的含有玻片識(shí)別信息的標(biāo)簽。
[0150]在一些實(shí)施方式中，對(duì)至少一個(gè)新玻片按順序執(zhí)行染色機(jī)指令表中的指令還包括，確定是否已滿足執(zhí)行指令列表中下一指令的先決條件，如果沒(méi)有滿足執(zhí)行指令列表中下一順序指令的先決條件則采取糾正措施，以及在已滿足執(zhí)行該指令的先決條件時(shí)執(zhí)行下一指令。在一些實(shí)施方式中，在已滿足執(zhí)行該指令的先決條件時(shí)執(zhí)行下一指令還包括，對(duì)至少一個(gè)新玻片施用試劑，以及更新與染色機(jī)相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)庫(kù)中的至少一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)記錄來(lái)反映執(zhí)行的完成。在一些實(shí)施方式中，確定是否已滿足執(zhí)行指令列表中下一指令的先決條件還包括，獲得在執(zhí)行下一指令中使用的試劑的信息，以及確定是否有足量的試劑可用。
[0151]在一些實(shí)施方式中，如果沒(méi)有滿足按序執(zhí)行指令列表中下一指令的先決條件則采取糾正措施還包括，警示操作者執(zhí)行下一指令的先決條件未滿足，以及監(jiān)測(cè)未滿足下一指令的先決條件的狀態(tài)變化。
[0152]在一些實(shí)施方式中，更新與染色機(jī)相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)庫(kù)中的至少一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)記錄來(lái)反映執(zhí)行完成還包括，更新選自以下的至少一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)記錄:反映對(duì)至少一個(gè)新玻片采取的行動(dòng)的玻片記錄、反映對(duì)試劑采取的行動(dòng)的試劑記錄、以及反映染色機(jī)采取的行動(dòng)的染色機(jī)記錄。
[0153]本申請(qǐng)的一些實(shí)施方式中還包括，用于在網(wǎng)絡(luò)上對(duì)連接在染色機(jī)網(wǎng)絡(luò)(例如，LAN)中的多個(gè)染色機(jī)中的至少一個(gè)染色機(jī)執(zhí)行操作的方法，包括，與染色機(jī)網(wǎng)絡(luò)中的至少一個(gè)染色機(jī)建立網(wǎng)絡(luò)連接，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)連接將指令發(fā)送到至少一個(gè)染色機(jī)，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)接收與發(fā)送到至少一個(gè)染色機(jī)的指令相對(duì)應(yīng)的響應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，從染色機(jī)網(wǎng)絡(luò)中的設(shè)備開始與至少一個(gè)染色機(jī)建立網(wǎng)絡(luò)連接。
[0154]在一些實(shí)施方式中，與染色機(jī)網(wǎng)絡(luò)中至少一個(gè)染色機(jī)建立網(wǎng)絡(luò)連接，還包括，與染色機(jī)網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的代理建立網(wǎng)絡(luò)連接，其中代理的功能包括傳遞指令至至少一個(gè)染色機(jī)和傳遞來(lái)自至少一個(gè)染色機(jī)的響應(yīng)，以及傳遞查詢至與多個(gè)染色機(jī)相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)庫(kù)并從與多個(gè)染色機(jī)相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)庫(kù)返回響應(yīng)，其中數(shù)據(jù)庫(kù)包括信息，該信息包括染色機(jī)、玻片、耗材以及與多個(gè)染色機(jī)相關(guān)聯(lián)的操作指南的狀態(tài)信息。在一些實(shí)施方式中，代理是還提供用于外部應(yīng)用的限定界面的軟件工具，通過(guò)該界面，可以通過(guò)網(wǎng)絡(luò)連接對(duì)至少一個(gè)染色機(jī)進(jìn)行操作。在一些實(shí)施方式中，外部應(yīng)用是實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)。
[0155]在一些實(shí)施方式中，在網(wǎng)絡(luò)上對(duì)至少一個(gè)染色機(jī)執(zhí)行的操作包括，運(yùn)行診斷測(cè)試和返回診斷信息。在某些實(shí)施方式中，如果診斷信息顯示這些服務(wù)將被執(zhí)行，則該診斷信息用于對(duì)至少一個(gè)染色機(jī)的服務(wù)進(jìn)行自動(dòng)安排。在一些實(shí)施方式中，在網(wǎng)絡(luò)上對(duì)至少一個(gè)染色機(jī)執(zhí)行的操作包括執(zhí)行一種或多種軟件以及固件的更新。
[0156]在一些實(shí)施方式中，在網(wǎng)絡(luò)上對(duì)至少一個(gè)染色機(jī)執(zhí)行的操作包括獲取關(guān)于染色機(jī)耗材使用的信息。在一些實(shí)施方式中，關(guān)于染色機(jī)耗材使用的信息可以包括對(duì)于多個(gè)染色機(jī)的總?cè)旧珯C(jī)耗材使用。在一些實(shí)施方式中，關(guān)于染色機(jī)耗材使用的信息包括試劑的使用信息和生物流體(bulk fluid)的使用信息。在一些實(shí)施方式中，關(guān)于染色機(jī)耗材使用的信息被用于做出訂購(gòu)一種或多種耗材的增加(additional)供給的決定。在一些實(shí)施方式中，訂購(gòu)一種或多種耗材的增加供給可以自動(dòng)進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，訂購(gòu)一種或多種耗材的增加供給基于經(jīng)濟(jì)訂貨批量。在一些實(shí)施方式中，訂購(gòu)一種或多種耗材的增加供給基于針對(duì)由操作染色機(jī)網(wǎng)絡(luò)的實(shí)體所預(yù)定的耗材訂購(gòu)的預(yù)定計(jì)劃。
[0157]在一些實(shí)施方式中，在網(wǎng)絡(luò)上對(duì)至少一個(gè)染色機(jī)執(zhí)行的操作包括監(jiān)測(cè)正在由至少一個(gè)染色機(jī)裝置操作的玻片的狀態(tài)。在一些實(shí)施方式中，在網(wǎng)絡(luò)上對(duì)至少一個(gè)染色機(jī)執(zhí)行的操作包括獲得由至少一個(gè)染色機(jī)操作的任何玻片的完成時(shí)間的實(shí)時(shí)估計(jì)。在一些實(shí)施方式中，完成時(shí)間的實(shí)時(shí)估計(jì)可以反映用戶操作的效果或其他未安排的事件，例如染色機(jī)的試劑瓶的引入或去除，或改變?nèi)旧珯C(jī)中玻片架的優(yōu)先級(jí)，或向染色機(jī)引入新的玻片。
[0158]在一些實(shí)施方式中，在網(wǎng)絡(luò)上對(duì)至少一個(gè)染色機(jī)執(zhí)行的操作包括獲得由至少一個(gè)染色機(jī)操作的玻片上的樣本圖像。在一些實(shí)施方式中，樣本的圖片可以采取適當(dāng)?shù)姆糯蟊堵屎头直媛诗@得。在一些實(shí)施方式中，在網(wǎng)絡(luò)上對(duì)至少一個(gè)染色機(jī)執(zhí)行的操作包括獲得有關(guān)沒(méi)有裝載到染色機(jī)中的玻片的狀態(tài)信息。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)連接與染色機(jī)進(jìn)行交換的所有信息，包括通過(guò)網(wǎng)絡(luò)連接發(fā)送到染色機(jī)的所有指令和通過(guò)網(wǎng)絡(luò)連接接收的所有響應(yīng)，都是加密的。
[0159]本申請(qǐng)的實(shí)施方式還包括，用于使結(jié)合至染色機(jī)的自動(dòng)裝置以一定時(shí)間間隔適應(yīng)性地安排自動(dòng)裝置的任務(wù)的方法。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)處理的操作指南，自動(dòng)裝置使用連接至染色機(jī)的試劑瓶或液體容器中的試劑，來(lái)處理連接至染色機(jī)的玻片。在一些實(shí)施方式中，在以一定時(shí)間間隔適應(yīng)性地安排自動(dòng)裝置任務(wù)的方法中的步驟包括，創(chuàng)建自動(dòng)裝置任務(wù)列表，包括在一定時(shí)間間隔內(nèi)可以執(zhí)行的所有的自動(dòng)裝置任務(wù)，計(jì)算自動(dòng)裝置任務(wù)列表中各個(gè)自動(dòng)裝置任務(wù)的優(yōu)先級(jí)，按照自動(dòng)裝置任務(wù)優(yōu)先級(jí)的降序排列對(duì)自動(dòng)裝置任務(wù)列表進(jìn)行整理，以及從所整理的自動(dòng)裝置任務(wù)列表的頂部開始向自動(dòng)裝置任務(wù)執(zhí)行隊(duì)列中添加自動(dòng)裝置任務(wù)，直至自動(dòng)裝置在一定時(shí)間間隔內(nèi)被完全利用，或自動(dòng)裝置任務(wù)列表已滿。
[0160]在一些實(shí)施方式中，創(chuàng)建自動(dòng)裝置任務(wù)列表還包括向自動(dòng)裝置任務(wù)列表中添加作為同期事件的結(jié)果而產(chǎn)生的自動(dòng)裝置任務(wù)。同期事件包括，向染色機(jī)中引入新的玻片、添加或去除試劑瓶和液體容器、以及改變分配給安放玻片的一個(gè)或多個(gè)玻片架的優(yōu)先級(jí)中的一種或多種。在一些實(shí)施方式中，自動(dòng)裝置可以執(zhí)行很多種類的任務(wù)，包括將自動(dòng)裝置移動(dòng)至染色機(jī)內(nèi)的位置、混合用于玻片的試劑、將試劑從試劑瓶或流體容器施用到玻片上、對(duì)玻片吹氣、將玻片傾斜至水平或垂直位置；以及拍攝玻片的圖像中的一種或多種。在一些實(shí)施方式中，將試劑從試劑瓶或流體容器施用到玻片上還包括在玻片上施用緩沖液、以及在玻片上施用去離子水中的一種或多種。
[0161]在一些實(shí)施方式中，在以一定時(shí)間間隔適應(yīng)性地安排自動(dòng)裝置任務(wù)的方法中的步驟，由染色機(jī)自發(fā)執(zhí)行，其可以對(duì)自動(dòng)裝置及其操作施加控制。在一些實(shí)施方式中，步驟在從染色機(jī)首次接通電源開始的連續(xù)時(shí)間間隔中重復(fù)執(zhí)行。在一些實(shí)施方式中，在運(yùn)行其他染色機(jī)和自動(dòng)裝置任務(wù)的同時(shí)執(zhí)行這些步驟。
[0162]在一些實(shí)施方式中，計(jì)算自動(dòng)裝置任務(wù)列表中各個(gè)自動(dòng)裝置任務(wù)的優(yōu)先級(jí)還包括，基于分配給單個(gè)任務(wù)參數(shù)的子分?jǐn)?shù)的數(shù)學(xué)函數(shù)來(lái)計(jì)算各個(gè)自動(dòng)裝置任務(wù)的分?jǐn)?shù)。在一些實(shí)施方式中，單個(gè)任務(wù)參數(shù)還包括，任務(wù)的最早開始時(shí)間、任務(wù)的最晚開始時(shí)間、執(zhí)行任務(wù)的持續(xù)時(shí)間、自動(dòng)裝置的位置、放置有與任務(wù)相關(guān)的玻片的架子的優(yōu)先級(jí)、針對(duì)自動(dòng)裝置任務(wù)類型的預(yù)定相對(duì)優(yōu)先級(jí)。在一些實(shí)施方式中，自動(dòng)裝置任務(wù)的預(yù)定相對(duì)優(yōu)先級(jí)可以是高或低的預(yù)定相對(duì)優(yōu)先級(jí)。在一些實(shí)施方式中，某些自動(dòng)裝置任務(wù)可以指定為最高優(yōu)先級(jí)，并直接加至自動(dòng)裝置的執(zhí)行隊(duì)列的頂部。
[0163]可以如上所述采用脫石蠟/脫蠟的自動(dòng)化樣本處理裝置的一個(gè)實(shí)例在圖1?3中示例并且在如下詳細(xì)描述。自動(dòng)化樣本處理裝置的可能實(shí)施方式的其他方面和細(xì)節(jié)在如下申請(qǐng)和國(guó)際專利申請(qǐng)中提供，各個(gè)通過(guò)引用的方式全部并入本文:國(guó)際專利申請(qǐng)公開W02004/057307A1、國(guó)際專利申請(qǐng)公開W02004/057308A1、國(guó)際專利申請(qǐng)公開W02004/058950A1、國(guó)際專利申請(qǐng)公開W02004/059287A2、國(guó)際專利申請(qǐng)公開W02004/058404A2、國(guó)際專利申請(qǐng)公開W02004/059284A2、國(guó)際專利申請(qǐng)公開TO2004/059288A2、國(guó)際專利申請(qǐng)公開W02004/059441A2、和國(guó)際專利申請(qǐng)公開W02004/059297A1、臨時(shí)專利申請(qǐng)60/616，444、和美國(guó)專利申請(qǐng)11/177，730、和美國(guó)專利申請(qǐng) US11/229, 098 和 US11/227,270。
[0164]圖1示出用于生物樣本的自動(dòng)化預(yù)處理和加工的預(yù)處理模塊100的分解視圖。如圖1所示，預(yù)處理模塊100包括含有玻片110的玻片架104，玻片110可以含有需要處理的生物樣本112。在一些實(shí)施方式中，玻片110裝載在玻片架104上，使得玻片110可以以豎直位置操作。玻片架104滑入內(nèi)部框架117。在一個(gè)實(shí)施方式中，內(nèi)部框架117可以是開放的而沒(méi)有壁。內(nèi)部框架117的底部任選地具有分散網(wǎng)格114，分散網(wǎng)格114可以在添加液體以進(jìn)行預(yù)處理時(shí)減少渦流或氣泡。架臂105滑入預(yù)處理槽102的架臂導(dǎo)引116，而玻片架104在內(nèi)部框架117中。架臂導(dǎo)引116可以將玻片架引導(dǎo)至預(yù)處理槽102的合適位置。預(yù)處理槽102可以由隨著加熱板107的溫度而變的加熱器導(dǎo)線109來(lái)進(jìn)行溫度控制。加熱板107可以在預(yù)處理槽或容器102的部分或全部壁上。凸緣103可用于安裝預(yù)處理槽或容器102。在一個(gè)實(shí)施方式中，在液體以超出最大量加入預(yù)處理模塊100后，液體可以流入溢出通道113中。溢出通道113朝向溢出排水管111向下傾斜以促使排出液體。
[0165]圖2A示出玻片架204插入預(yù)處理槽202中的預(yù)處理模塊200的正交視圖。圖2B示出玻片架204插入預(yù)處理槽202中的預(yù)處理模塊200的截面視圖。如圖2B所示，在一個(gè)實(shí)施方式中，溢出通道213可以使達(dá)到某一水平的液體從玻片架204的頂部除去。在溢出通道213中的液體將會(huì)收集在溢出排水管211中并可以進(jìn)一步為目標(biāo)物修復(fù)進(jìn)行操作或循環(huán)使用用過(guò)的溶劑。溢出液體可以是溶劑形成層(或第二相層)并可以包含具有目標(biāo)樣本的石蠟。在另一個(gè)實(shí)施方式中，溢出液體可以是已經(jīng)去除第二相層后的第一相液體(載體成分)，并且可以含有具有目標(biāo)樣本的水性溶劑。
[0166]圖3A?3D示出為預(yù)處理模塊300的長(zhǎng)邊示意圖，包含樣本312的玻片310通過(guò)夾子318固定在玻片架304上，玻片架304插入預(yù)處理槽302中，架導(dǎo)引插槽316作為用于合適放置的導(dǎo)引。如圖3A所示，兩相溶劑體系尚未引入預(yù)處理模塊300中。如圖3B所示，薄的第二相層322和較厚的第一相液體320開始引入預(yù)處理槽302。第二相層322是薄層，浮在第一相液體320上。使用任選單向的入口 306來(lái)加入第二相層322，入口 306任選地在預(yù)處理槽302的分散網(wǎng)格314上方。第一相層(載體成分)320使用雙向口 308加入，雙向口 308任選地在預(yù)處理槽302的分散網(wǎng)格314下方。任選的分散網(wǎng)格314可以減少第一相液層(載體成分)320加入預(yù)處理槽302時(shí)的渦流或氣泡。渦流或氣泡的減少使得兩相系統(tǒng)以均一的速率和水平沿樣本向上移動(dòng)。如之前所述，在本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施方式中，第二相層可以包括石蠟相，且第一相液體可以包括水性相。如圖3C所示，增加的第一相層(載體成分)320已通過(guò)雙向口 308加入。第一相層(載體成分)320的加入將薄的第二相層322向上掃向支撐物或玻片310，以與樣本312接觸。如圖3D所示，增加的第一相液體已經(jīng)通過(guò)雙向口 308加入。第一相層(載體成分)320的加入將第二相層322掃向玻片310的頂端，并完成第二相層322與樣本312的接觸。在一個(gè)實(shí)施方式中，第二相層322可以在之后經(jīng)溢出通道(未顯示)除去。然后，第一相液體320可以經(jīng)雙向口 308除去，且玻片310從預(yù)處理模塊300中移除。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在第二相層322已經(jīng)經(jīng)溢出通道(未顯示)除去后，新的第一相層320和第二相層322可以加入，使得新的第二相層322與樣本312接觸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一相層320將通過(guò)雙向口 308除去，以將同一第二相層322向下掃過(guò)玻片310，從而與樣本312再次接觸。第一相層320可以任選地加入或除去，通過(guò)使第二相層322沿玻片310上下移動(dòng)，使得同一第二項(xiàng)層322與樣本312接觸數(shù)次。是否將第二相層322掃過(guò)樣本312 —次或多次可以取決于除其他因素之外的樣本類型。
[0167]圖4不出插入有玻片412的預(yù)處理模塊400的截面不意圖。如圖4所不,第一相層420已經(jīng)通過(guò)雙向口 408加入，且第二相層420已經(jīng)經(jīng)入口 406加入，入口 406任選地在任選的分散網(wǎng)格414上方。預(yù)處理模塊400可以通過(guò)使用在預(yù)處理模塊400兩側(cè)的隨著加熱板407的溫度而變的加熱器電源導(dǎo)線409進(jìn)行溫度控制。如圖4所示，第二相層420在玻片412頂部的樣本412上方，且足夠高以流入溢出通道413。然后，溢出通道413中的液體可以流入溢出排水管411中，從而可以去除液體。在至少一個(gè)實(shí)施方式中，第二相層420可以通過(guò)溢出到溢出通道中來(lái)去除，且第一相液體420可以保留在預(yù)處理模塊400中。
[0168]圖5示出用于溶劑類兩相預(yù)處理方法的方法的流程圖500。如圖5所示，工序以將玻片架插入槽中的步驟504開始502。預(yù)處理方法可以在步驟506至512之間連續(xù)循環(huán)，循環(huán)次數(shù)根據(jù)ISH和IHC而變化。隨著步驟506加入第一相液體后，分散網(wǎng)格可任選地使用，且第一相液體加至分散網(wǎng)格下方。如前所述，第一相層或載體成分可以是例如能夠用于目標(biāo)物修復(fù)的水性相或者是含有洗滌劑的DI水。在步驟506至510中將第二相層掃過(guò)玻片的頂部之后，可以在步驟510與512之間使用溢出通道任選地除去第二相層。在已經(jīng)進(jìn)行預(yù)處理方法并循環(huán)或重復(fù)充足次數(shù)以后，將預(yù)處理槽填充至玻片上方，以在步驟514中經(jīng)溢出通道除去第二相層。在步驟515中，如果需要熱誘導(dǎo)的目標(biāo)物修復(fù)，可以是任選酶封閉的目標(biāo)物修復(fù)液的第一相液體可以加熱至例如約97°C，并以所需的操作指南和時(shí)間間隔進(jìn)行孵育。在步驟516中，玻片從預(yù)處理模塊中移出，在步驟518中，預(yù)處理模塊被清空。在步驟516從預(yù)處理槽移至下一個(gè)站點(diǎn)之前，熱的玻片可以冷卻至一定溫度，以避免樣本在轉(zhuǎn)移過(guò)程中破壞，例如冷卻至用于慢轉(zhuǎn)移的的約45°C，或冷卻至例如用于快速轉(zhuǎn)移的約65°C。
[0169]圖6示出用于液化石蠟兩相預(yù)處理方法的方法流程圖600。如圖6所示，處理過(guò)程以步驟604加入第一相液體開始。之后，在步驟606中將玻片架插入，并加熱預(yù)處理模塊。預(yù)處理模塊的加熱使得可以加熱第一相液體和/或熔化石蠟，石蠟在第一相層的頂部形成第二相層。在一個(gè)實(shí)施方式中，在也可以進(jìn)行目標(biāo)物修復(fù)的步驟608中將第一相液體加熱至97°C。在另一個(gè)實(shí)施方式中，加熱是用來(lái)去除包埋介質(zhì)，例如脫蠟，在步驟608中，將第一相液體或載體成分加熱至約60°C。步驟608和610在圖中示為兩個(gè)獨(dú)立的步驟，然而在一個(gè)實(shí)施方式中，兩個(gè)步驟可以組合。然后，在步驟612中，第一相液體可以添加至超過(guò)溢出水平，通過(guò)溢出到溢出通道中而除去第二相層。在一個(gè)實(shí)施方式中，步驟604至612可以按照需要進(jìn)行重復(fù)，以確保除去石蠟或其他包埋介質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，步驟611可以通過(guò)使用含有任選酶封閉的目標(biāo)物修復(fù)溶液重新填充預(yù)處理槽來(lái)實(shí)現(xiàn)，以進(jìn)行額外的目標(biāo)物修復(fù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，步驟613包括加熱第一相液體至約97°C，并按照所需的操作指南和時(shí)間間隔進(jìn)行孵育，其中第一相液體可以是任選酶封閉的目標(biāo)物修復(fù)溶液。這可以使得完成熱誘導(dǎo)目標(biāo)物修復(fù)和任選酶的封閉。在已經(jīng)進(jìn)行預(yù)處理方法并循環(huán)或重復(fù)所需的次數(shù)后，可以在步驟614中將玻片從預(yù)處理模塊中轉(zhuǎn)移出來(lái)，并在步驟616中將預(yù)處理模塊清空。可以在步驟614中從預(yù)處理槽轉(zhuǎn)移至下一個(gè)站點(diǎn)之前，將熱的玻片冷卻至一定溫度，以避免轉(zhuǎn)移過(guò)程中的樣本破壞，例如冷卻至用于慢轉(zhuǎn)移的約45°C，或冷卻至用于快速轉(zhuǎn)移的約 65。。。
[0170]圖7示出含有烘烤和干燥的預(yù)處理方法流程圖700。如圖7所示，工序以玻片架插入704開始702，并確保安放加熱器來(lái)加熱預(yù)處理槽中的氣體和樣本706。之后，在步驟708中使氣體和樣本加熱指定時(shí)間來(lái)烘烤樣本。樣本可以烘烤來(lái)改善樣本對(duì)玻片的粘附。改善樣本的粘附可以防止在隨后的預(yù)處理步驟中樣本的不時(shí)脫落。之后，分別通過(guò)如之前圖5和6所示的溶劑類兩相預(yù)處理500或基于加熱的兩相石蠟溢出預(yù)處理600來(lái)處理樣本。在樣本處理完成后，在步驟710中，可以將空氣和樣本加熱指定時(shí)間來(lái)干燥樣本或玻片。隨后，在步驟712中將玻片架轉(zhuǎn)移至下一站點(diǎn)。
[0171]圖8示出用于自動(dòng)化預(yù)處理和加工生物樣本的預(yù)處理模塊800的側(cè)視圖，其中玻片架810在模塊800的外部。包含豎直玻片810和樣本812的玻片架810可以插入預(yù)處理模塊800中。預(yù)處理模塊包含與排水管811連接的溢出通道813，以去除預(yù)處理模塊中的液體，還包含與加熱器807連接的加熱器電源導(dǎo)線809，以用于溫度控制。第一相液體(未顯示)通過(guò)雙向口 808加入，第二相層(未顯示)通過(guò)任選的單向入口 806加入。
[0172]圖9示出用于帶烘烤和干燥的預(yù)處理法的預(yù)處理模塊的截面示意圖，展示出氣流924環(huán)繞所插入的玻片910。風(fēng)扇923可以將氣體推動(dòng)至預(yù)處理模塊中，且氣體可以經(jīng)氣體加熱器925加熱。任選加熱的氣體具有圍繞含有樣本912的玻片910的氣流924。氣流924路徑可以將氣體帶向溢出通道913，氣流在溢出通道913處離開預(yù)處理模塊。任選加熱的氣體可以干燥樣本912或玻片910。這可以使玻片910從預(yù)處理模塊中移出時(shí)是干燥的。玻片910和樣本912也可以烘烤以加強(qiáng)樣本912對(duì)玻片910的粘附。預(yù)處理模塊中的烘烤可以通過(guò)加熱器907實(shí)現(xiàn)。
[0173]對(duì)記載實(shí)施方式的多種修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，且本文公開的基本原理可以應(yīng)用于其他實(shí)施方式。所記載的例子僅僅是示例性的，且本文描述的實(shí)施方式并不意在限制本申請(qǐng)。因此，權(quán)利要求將包括與本文描述的原則和特征一致的最寬范圍。所有的專利、專利申請(qǐng)、和其他公開物通過(guò)引用的方式全部并入本文。
[0174]實(shí)施例
[0175]實(shí)施例按照后述的常規(guī)FISH和/或CISH法或常規(guī)IHC法執(zhí)行。對(duì)于參數(shù)的任何具體變化均在實(shí)施例中提及。
[0176]常規(guī)FISH 和 / 或 CISH 法:
[0177]常規(guī)方法可以同時(shí)手動(dòng)執(zhí)行以及在自動(dòng)裝備中執(zhí)行。自動(dòng)裝備的實(shí)例在本申請(qǐng)中說(shuō)明。
[0178]1.脫石蠟-參見實(shí)施例中的測(cè)試條件
[0179]手動(dòng)脫石蠟-將載體成分加到容器中，之后，將溶劑添加到容器中。溶劑將“漂浮”在載體成分的頂部。將玻片或玻片架慢慢地插入容器的分層內(nèi)容物中。以本實(shí)施例所述的次數(shù)，抬高或放低玻片或玻片架。如果需要的話，后續(xù)進(jìn)行再水化。
[0180]自動(dòng)脫石蠟-在自動(dòng)裝備中，將載體成分填充至低于溶劑入口。通過(guò)溶劑入口施加溶劑(澄清劑/脫石蠟劑)。也可以以自動(dòng)的方式向上和向下移動(dòng)玻片或玻片架。
[0181]2.如適當(dāng)?shù)脑?，可以進(jìn)行目標(biāo)物修復(fù)-可以使用傳統(tǒng)的方法，例如將MES緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液加熱至略低于水的沸點(diǎn)(約95?100°C)，且使用高壓力鍋可以得到高于100°C的溫度而不煮沸組織。也可以在80°C下使用硫氰酸鈉進(jìn)行目標(biāo)物修復(fù)。在95°C以上使用預(yù)處理溶液(K5599，Dako) 10分鐘。
[0182]3.胃蛋白酶消化-可以使用傳統(tǒng)方法，例如去除多余的預(yù)處理緩沖液或目標(biāo)物修復(fù)緩沖液，對(duì)樣本施用胃蛋白酶(K5599，Dako)，在37°C下孵育2?6分鐘，如果需要的話用稀釋的FISH洗滌緩沖液(K5599，Dako)進(jìn)行洗滌。
[0183]4.脫水-傳統(tǒng)的方法例如將玻片放置在一系列乙醇溶液(70%、85%、96% )中，每個(gè)溶液約2分鐘。之后空氣干燥?；蛘哂盟嬉掖歼M(jìn)行洗滌并在45°C左右室溫下空氣干燥。
[0184]5.變性和雜交-傳統(tǒng)的方法，例如對(duì)樣本施用探針混合物，用蓋玻片覆蓋樣本并密封邊緣，在適當(dāng)?shù)臏囟认?取決于探針混合物和雜交緩沖液的組成，例如室溫、30 V、37 0C >40 0C >45 0C >50 °C >52 °C >57 °C >60 °C >65 °C、67 °C >70 °C >75 °C >80 °C >82 °C >88 °C >90 °C、92°C、95°C )孵育以進(jìn)行變性和雜交，其中對(duì)于甲酰胺類雜交緩沖液需雜交孵育過(guò)夜，或者對(duì)于IQFISH雜交緩沖液，則孵育雜交一小時(shí)。
[0185]6.嚴(yán)格的洗滌-傳統(tǒng)的方法，例如用嚴(yán)格(Stringency)緩沖液(K5599，Dako)在室溫下洗滌一次，并在65°C下洗滌一次，計(jì)10分鐘，當(dāng)進(jìn)行FISH檢測(cè)時(shí)用洗滌緩沖液(K5599，Dako)洗滌。當(dāng)樣本用于CISH時(shí)，在SK108 (Dako)中操作，且不進(jìn)行6以后的步驟。
[0186]7.脫水-傳統(tǒng)的方法，例如將玻片放置在一系列乙醇溶液(70 %、85 %、96 % )，在各個(gè)溶液中約2分鐘。之后，空氣干燥?；蛘撸盟蚓彌_液替代乙醇進(jìn)行洗滌，并在約45°C室溫下空氣干燥。[0187]8.封片-在封片介質(zhì)中進(jìn)行樣本的封片,貼片介質(zhì)為例如突光封片介質(zhì)(K5599,DakoX
[0188]常規(guī)IHC 法:
[0189]常規(guī)方法可以手動(dòng)進(jìn)行以及在自動(dòng)裝備中進(jìn)行。自動(dòng)裝備的實(shí)例在本申請(qǐng)中示出。
[0190]1.脫石蠟-參見實(shí)施例中的測(cè)試條件。
[0191]手動(dòng)脫石蠟-將載體成分加到容器中，其后將溶劑添加到容器中。溶劑將“漂浮”在載體成分的頂部。將玻片或玻片架慢慢地插入容器中分層的內(nèi)容物中。以本實(shí)施例所述的次數(shù)，抬高或放低玻片或玻片架。后續(xù)進(jìn)行再水化。
[0192]自動(dòng)脫石蠟-在自動(dòng)裝備中，將載體成分填充至低于溶劑入口。通過(guò)溶劑入口施加溶劑(澄清劑/脫蠟劑)。也可以以自動(dòng)方式向上和向下移動(dòng)玻片或玻片架。
[0193]2.如適當(dāng)?shù)脑捒梢赃M(jìn)行目標(biāo)物修復(fù)_
[0194]a)當(dāng)使用溶劑時(shí)，可以應(yīng)用傳統(tǒng)的方法，例如在MES緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液中將樣本加熱至略低于水的沸點(diǎn)(約95?100°C)，且使用高壓力鍋允許高于100°C的溫度而不煮沸組織。一些表位不能耐受目標(biāo)物修復(fù)，通常用蛋白酶K處理來(lái)代替目標(biāo)物修復(fù)步驟
[0195]b)當(dāng)使用3合I時(shí)，遵照S2375 (Dako)的包裝插入物中的程序。
[0196]3.染色可以按照用于FLEX (K8000，Dako)或FLEX+ (K8002，Dako)的操作指南來(lái)進(jìn)行。
[0197]所使用原理的實(shí)例:
[0198]-將目標(biāo)物修復(fù)(TR)緩沖溶液加到槽的底部
[0199]-將溶劑(例如ClearifyT\Histoclear1勵(lì)、Isopar G?)加在TR緩沖液的頂部，即液體位置I (這將形成兩相系統(tǒng))
[0200]-用TR緩沖液填充槽
[0201]-將槽清空至液體位置1，在樣本上留下薄層的溶劑
[0202]-孵育O?3分鐘。某些樣本可能需要加熱(例如加熱至40°C或50°C)
[0203]-用TR緩沖液或水裝滿槽并溢出(溶劑在溢出排水管中流出)
[0204]-在97±2°C下孵育例如10分鐘
[0205]-用DI水冷沖洗至<40°C(如果有任何剩余溶劑的話，剩余溶劑在溢出排水管流出)
[0206]-將玻片轉(zhuǎn)移至染色模塊以進(jìn)行進(jìn)一步的處理:ISH消化、IHC染色、特殊染色和蘇木精染色。
[0207]*n=0?5個(gè)循環(huán),取決于進(jìn)一步的處理。
[0208]實(shí)施例1
[0209]進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)來(lái)再次確認(rèn)，與傳統(tǒng)二甲苯處理相比，手動(dòng)執(zhí)行(用手)的兩相脫石蠟可以與Dako標(biāo)準(zhǔn)甲酰胺HER2FISH pharmDx? —同使用。使用MES緩沖液在微波爐中進(jìn)行目標(biāo)物修復(fù)步驟。
[0210]-向容器中加入DI水
[0211]-在DI水的頂部加入溶劑(HistoclearII? )(形成兩相系統(tǒng))
[0212]-將玻片浸入兩相系統(tǒng)[0213]-從兩相系統(tǒng)中移出玻片
[0214]-孵育2分鐘
[0215]-在洗滌緩沖溶液中洗滌2X3分鐘
[0216]-在微波爐內(nèi)進(jìn)行目標(biāo)物修復(fù)10分鐘
[0217]-繼續(xù)標(biāo)準(zhǔn)程序
[0218]結(jié)論:采用傳統(tǒng)甲酰胺緩沖液的手動(dòng)執(zhí)行的兩相脫石蠟適用于Dako FISH和CISH0 Histoclear的余留物(液滴)以非常高的濃度存在于玻片上(TR步驟前沒(méi)有去除HistoclearX
[0219]實(shí)施例2
[0220]本實(shí)驗(yàn)是為測(cè)試，與傳統(tǒng)二甲苯處理相比，手動(dòng)進(jìn)行(用手)的2相脫石蠟是否可以與HER2IQFISH PharmDx?緩沖液一同使用。目標(biāo)物修復(fù)步驟在微波爐中進(jìn)行。請(qǐng)注意所使用的CISH操作指南對(duì)于組織非?？量獭?br> [0221]-向容器中加入DI水
[0222]-在DI水的頂部加入溶劑(Histoclear)(兩相系統(tǒng))
[0223]-將玻片浸入兩相系統(tǒng)
[0224]-從兩相系統(tǒng)中移出玻片
[0225]-孵育2分鐘
[0226]-在洗滌緩沖溶液中洗滌3X3分鐘
[0227]-在微波爐內(nèi)進(jìn)行目標(biāo)物修復(fù)10分鐘
[0228]-繼續(xù)FISH/CISH 程序
[0229]結(jié)論:使用HER2 IQFISH PharmDx?緩沖液的手動(dòng)執(zhí)行2相脫蠟適用于Dako FISH和CISH。Histoclear II?的剩余物(液滴)以非常高的濃度存在于玻片上(TR步驟前沒(méi)有去除 Histoclear II?)。
[0230]實(shí)施例3
[0231]本實(shí)驗(yàn)是為測(cè)試，與傳統(tǒng)的二甲苯處理相比，自動(dòng)化(圖8?9) 2相脫石蠟是否可以與HER2 IQFISH PharmDx?—同使用。通過(guò)模塊執(zhí)行目標(biāo)物修復(fù)步驟。
[0232]A 版本:
[0233]-將DI水加到槽的底部
[0234]-將溶劑(HistoclearII?)加在DI水的頂部(液體位置1)，2相系統(tǒng)
[0235]-用DI水填充槽
[0236]-將槽清空至液體位置I
[0237]-孵育2分鐘。
[0238]-用DI水裝滿槽并溢出(HistoclearTI?在溢出排水管中流出)
[0239]-將槽清空
[0240]-用MES緩沖液填充槽
[0241]-在97°C下孵育10分鐘
[0242]-用DI水冷沖洗至350C(剩余的Histoclear II?在排水管中流出)
[0243]-將玻片轉(zhuǎn)移至洗滌緩沖液[0244]-繼續(xù)進(jìn)行FISH/CISH程序
[0245]B 版本:
[0246]-將MES緩沖液加到槽的底部
[0247]-將溶劑(HistoclearII? )加在MES緩沖液的頂部(液體位置1)，2相系統(tǒng)
[0248]-用MES緩沖液填充槽
[0249]-將槽清空至液體位置I
[0250]-孵育2分鐘。
[0251]-用MES緩沖液裝滿槽并溢出(Histoclear丨丨漱在溢出排水管中流出)
[0252]-在97±2°C下孵育10分鐘
[0253]-用DI水冷沖洗至約350C(剩余的Histoclear II?在溢出排水管中流出)
[0254]-將玻片轉(zhuǎn)移至洗滌緩沖液
[0255]-將玻片轉(zhuǎn)移至染色模塊以進(jìn)行進(jìn)一步的FISH處理
[0256]結(jié)論:對(duì)于FISH染色而言，使用HER2 IQFISH pharmDx?的自動(dòng)執(zhí)行的2相脫石蠟，與使用傳統(tǒng)二甲苯脫石蠟的那些同樣好，或比那些更好。CISH染色未經(jīng)測(cè)試。沒(méi)有Histoclear II⑧剩余物(液滴)存在于玻片上(通過(guò)模塊在TR步驟前和后去除Histoclear 騰)。
[0257]實(shí)施例4:各種溶劑(FISH和CISH)
[0258]遵照一般的FISH法。具體變化列于表1。
[0259]表1:溶劑類型、載體成分、探針組合物的類型、自動(dòng)/手動(dòng)方法的變化
[0260]
【權(quán)利要求】
1.一種用于從包埋的生物樣本中除去至少一部分包埋介質(zhì)的方法，其包括: 向預(yù)處理容器中放入至少一個(gè)支撐物，所述支撐物在其表面具有包埋的生物樣本， 向所述預(yù)處理容器加入至少一種形成層的試劑，向所述預(yù)處理容器加入載體成分，使形成層的試劑形成在所述載體成分的頂部且其含量為使得至少一種形成層的試劑接觸至少一部分的所述包埋的生物樣本。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在將所述至少一個(gè)支撐物放入所述預(yù)處理容器之后，但在向所述預(yù)處理容器加入在所述載體成分的表面形成層的所述至少一種試劑之前，向所述預(yù)處理容器加入載體成分，并且所述載體成分不接觸所述包埋的生物樣本。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，增加所述載體成分的體積，直至所述至少一種形成層的試劑接觸所述包埋的生物樣本的全部。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，兩相系統(tǒng)在接觸所述生物樣本時(shí)處于勻速運(yùn)動(dòng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，隨著所述兩相系統(tǒng)的體積的增加，所述兩相系統(tǒng)向上移動(dòng)，隨著所述兩相系統(tǒng)的體積的減小，向下運(yùn)動(dòng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括通過(guò)增加所述預(yù)處理容器中所述載體成分的體積直至至少一部分的所述形成層的試劑溢出所述預(yù)處理容器，從而除去至少一部分的所述形成層的試劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和6所述的方法，還包括從所述預(yù)處理容器中除去至少一部分的所述載體成分，使得所述形成層的試劑第二次接觸至少一部分的所述包埋的生物樣本。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~6所述的方法，還包括向所述預(yù)處理容器加入額外載體成分，從而使得所述形成層的試劑第三次接觸至少一部分的所述生物樣本，之后，通過(guò)除去至少一部分的所述載體成分，使得至少一部分的所述形成層的試劑第四次接觸至少一部分的所述包埋的生物樣本。
9.根據(jù)權(quán)利要求1~4所述的方法，其中，所述形成層的試劑的溫度低于包埋材料的熔點(diǎn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1~9所述的方法,其中，所述包埋介質(zhì)選自臘、石臘、paramat、paraplats、peel away石臘、組織冷凍介質(zhì)、人體冷凍凝膠、OCT? (“最佳切割溫度”)包埋化合物、Polyfin?、聚酯蠟及其混合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述包埋介質(zhì)是石蠟。
12.根據(jù)權(quán)利要求1~10所述的方法，其中，形成層的所述試劑包括能夠溶解所述包埋介質(zhì)的溶劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，形成層的所述試劑選自氫化萘、環(huán)烷烴、d-檸檬烯、石蠟烴/異烷烴、石蠟基二醇醚、烷烴及其混合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，形成層的所述試劑選自Formula83TM、Histochoice、AmericIearΛ BioclearΛ CleareneΛ hemo—DE、HistoclearΛ HistoSolve X、Master Clear、Safsolv、Clearify、ClearinglOO、Clear Rite3、Isopar L、Isopar G、IsoparH、Micro-Clear、Micro-Clear-HC、Micro_Clear-R、Paraclear、Safe Clear、Safe Clear I1、Shandon XY> Slide-Brite、Xy-Less> XS-3、Pro-Par>HlStO-Cleal#^ Histo-dear<R Π 和Isopar G0
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，形成層的所述試劑選自Histo-Clear?,Iiislo-CluaiK I! , Clearify 和 Isopar G。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，形成層的所述試劑是Clearify。
17.根據(jù)權(quán)利要求1~16所述的方法，其中，所述載體成分是能夠除去液化的包埋介質(zhì)并與所述形成層的試劑不混溶的水性緩沖溶液。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述載體成分選自Tris緩沖鹽水吐溫20
緩沖液和傳統(tǒng)IHC目標(biāo)物修復(fù)液。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述載體成分是DI水。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述支撐物選自試管、芯片、陣列、盤和玻片。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述支撐物是顯微鏡玻片。
22.—種包埋的生物樣本的預(yù)處理方法，包括利用以下步驟從包埋的生物樣本中去除包埋介質(zhì)以及進(jìn)行加熱的目標(biāo)物修復(fù): 向預(yù)處理容器放入至少一個(gè)支撐物，所述支撐物在其表面具有包埋的生物樣本， 向所述預(yù)處理容器加入載體成分，其中所述載體成分不接觸所述包埋的生物樣本， 向所述預(yù)處理容器加入至少一種在所述載體成分的表面形成層的試劑， 增加所述預(yù)處理容器中所述載體成分的體積，至少增加至使得至少一種形成層的試劑接觸至少一部分的所述包埋的生物樣本， 通過(guò)增加所述預(yù)處理容器中所述載體成分的體積直至至少一部分的所述形成層的試劑溢出所述預(yù)處理容器，從而除去至少一部分的所述形成層的試劑， 從所述預(yù)處理容器中移除所述支撐物， 如果所述載體成分不是目標(biāo)物修復(fù)緩沖溶液，將所述載體成分排出所述預(yù)處理容器，并用目標(biāo)物修復(fù)緩沖溶液填充所述預(yù)處理容器， 將所述目標(biāo)修復(fù)緩沖溶液加熱至所需溫度，其中所述溫度適合于加熱的目標(biāo)物修復(fù)， 將所述支撐物放入所述預(yù)處理容器中， 根據(jù)所需的操作指南，孵育所述生物樣本一段時(shí)間。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的預(yù)處理方法，還包括:在溢出前，從所述預(yù)處理容器中除去至少一部分的所述載體成分，使得試劑層第二次接觸至少一部分的所述包埋的生物樣本。
24.根據(jù)權(quán)利要求22~22所述的方法，還包括:在溢出前，向所述預(yù)處理容器加入額外的載體成分，從而使得所述形成層的試劑第三次接觸至少一部分的生物樣本，之后，通過(guò)除去至少一部分的所述載體成分，使得至少一部分的所述形成層的試劑第四次接觸至少一部分的所述包埋的生物樣本。
25.根據(jù)權(quán)利要求22~24所述的方法,其中，所述包埋介質(zhì)選自臘、石臘、paramat>paraplats、peel away石臘、組織冷凍介質(zhì)、人體冷凍凝膠、OCT? (“最佳切割溫度”)包埋化合物、Polyfin?、聚酯蠟及其混合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述包埋介質(zhì)是石蠟。
27.根據(jù)權(quán)利要求22~25所述的方法，其中，形成層的所述試劑是能夠溶解所述包埋介質(zhì)的溶劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，形成層的所述試劑選自氫化萘、環(huán)烷烴、d-檸檬烯、石蠟烴/異烷烴、石蠟基二醇醚、烷烴及其混合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求27~28所述的方法，其中，形成層的所述試劑選自FormUla83TM、Histochoice、AmericIearΛ BioclearΛ CleareneΛ Hemo—DE、HistoclearΛ HistoSolve X、Master Clear、Safsolv、Clearify、ClearinglOO、Clear Rite3、Isopar L、Isopar G、IsoparH、Micro-Clear、Micro—Clear—HC、Micro—Clear—R、Parac I ear Λ Safe Clear、Safe ClearI1、Shandon XY、Slide-Brite、Xy-Less、XS-3、Pro-Par、FIisU)?CMear.fc > Histo-clearKlI和 Isopar G0
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中，形成層的所述試劑選自Histo-Cleai.、Histo-Cleai.I1、Clearify 和 Isopar G。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，形成層的所述試劑是Clearify。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述載體成分是能夠除去液化的包埋介質(zhì)并且與所述形成層的試劑不混溶的水性緩沖溶液。
33.根據(jù)權(quán)利要求22~24所述的方法，其中，所述載體成分與所述目標(biāo)物修復(fù)緩沖溶液相同。
34.根據(jù)權(quán)利要求22~24所述的方法，其中，所述載體成分與所述目標(biāo)物修復(fù)緩沖溶液不同。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述載體成分選自Tris緩沖鹽水吐溫20
緩沖液和傳統(tǒng)IHC目標(biāo)物修復(fù)液。
36.根據(jù)權(quán)利要求22~34所述的方法，其中，所述載體成分是DI水。
37.根據(jù)權(quán)利要求22~33所述的方法，其中，所述目標(biāo)物修復(fù)緩沖溶液還包括酶封閉。
38.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，將所述目標(biāo)物修復(fù)緩沖溶液加熱到80攝氏度至80攝氏度范圍內(nèi)的溫度。
39.一種包埋的生物樣本的預(yù)處理方法，包括利用以下步驟從包埋的生物樣本中去除包埋介質(zhì)以及進(jìn)行加熱的目標(biāo)物修復(fù): 向預(yù)處理容器放入至少一個(gè)支撐物，所述支撐物在其表面具有包埋的生物樣本， 向所述預(yù)處理容器加入非溶劑試劑成分，其中該成分不接觸所述包埋的生物樣本， 將所述非溶劑試劑成分加熱至在所述包埋介質(zhì)的熔點(diǎn)之上的溫度， 孵育所述生物樣本以足以熔化所述包埋介質(zhì)的一段時(shí)間，使得形成包含熔化的包埋介質(zhì)的第二相， 在所述預(yù)處理中加入載體成分，其中，該載體液的溫度低于試劑層的溫度，從而使得所述包埋介質(zhì)在與所述載體成分接觸時(shí)凝結(jié)，以及 繼續(xù)向所述預(yù)處理容器加入冷的載體成分，直至至少一部分?jǐn)y帶所述包埋介質(zhì)的非溶劑試劑成分溢出所述預(yù)處理容器。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中， 將所述非溶劑試劑成分加熱至高于所述包埋介質(zhì)的熔點(diǎn)的溫度。
41.根據(jù)權(quán)利要求39~40所述的方法，其中， 所述包埋介質(zhì)選自臘、石臘、paramat、paraplats、peel away石臘、組織冷凍介質(zhì)、人體冷凍凝膠、0CT? (“最佳切割溫度”)包埋化合物、Polyfin?、聚酯蠟及其混合物。。
42.根據(jù)權(quán)利要求39~41所述的方法，其中，所述包埋介質(zhì)是石蠟。
43.根據(jù)權(quán)利要求39~42所述的方法，其中所述非溶劑試劑成分選自FormUla83TM、
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述非溶劑試劑成分選自nisU)-(..':lear?、Histo-Clear? I1、Clearify 和 Isopar G。
45.根據(jù)權(quán)利要求43或44所述的方法，其中，所述非溶劑試劑成分是Clearify。
46.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述載體成分是能夠除去液化的包埋介質(zhì)并且與形成層的試劑不混溶的水性緩沖溶液。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述載體成分選自Tris緩沖鹽水吐溫20(“TBST”)、PBS、!fepes、MES緩沖液和傳統(tǒng)IHC目標(biāo)物修復(fù)液。
48.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述載體成分是DI水。
49.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，所述非溶劑試劑層是帶有酶封閉的目標(biāo)物修復(fù)溶液。
50.根據(jù)權(quán)利要求1~37中任一項(xiàng)所述的方法，還包括:在去除所述包埋介質(zhì)后，使用醇或水中的稀釋醇溶液的漂洗步驟。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述稀釋醇是乙醇。
52.根據(jù)權(quán)利要求50或51所述的方法，其中，所述乙醇溶液的濃度是30%乙醇或更低。
53.根據(jù)權(quán)利要求50~51所述的方法，其中，所述乙醇溶液的濃度是20%乙醇或更低。
54.根據(jù)權(quán)利要求1、22或39所述的方法，還包括:對(duì)預(yù)處理的生物樣本的染色。
55.根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，還包括染色后清潔過(guò)程。
56.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中，所述染色后清潔過(guò)程包括，在封片前，使染色的生物樣本或標(biāo)本暴露于能夠除去包埋介質(zhì)的溶劑或能夠除去溶劑殘余物的成分。
57.一種用于包埋的生物樣本的預(yù)處理的方法，包括: 向預(yù)處理容器放入至少一個(gè)支撐物，所述支撐物在其表面具有包埋的生物樣本， 將所述樣本加熱至烘烤溫度，并烘烤樣本以所需的烘烤時(shí)間， 通過(guò)進(jìn)行前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，對(duì)所述包埋的生物樣本進(jìn)行預(yù)處理，以及 將所述預(yù)處理容器加熱至干燥溫度，并干燥所述生物樣本。
58.一種用于包埋的生物樣本的自動(dòng)化預(yù)處理的裝置，所述裝置包含: 支撐支架，以及 預(yù)處理容器，所述預(yù)處理容器包 含溢出通道和溢出排水管、經(jīng)底部向容器提供液體的入口、用于測(cè)量溫度的傳感器。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的裝置，還包含雙向口。
60.根據(jù)權(quán)利要求58~59所述的裝置，還包含用于推動(dòng)空氣進(jìn)入容器的風(fēng)扇。
61.根據(jù)權(quán)利要求59所述的裝置，還包含加熱元件。
62.根據(jù)權(quán)利要求58~61所述的裝置，還包含設(shè)置有分散網(wǎng)格的開放內(nèi)部框架。
63.根據(jù)權(quán)利要求58~62所述的裝置，其中，樣本支架是設(shè)置有架臂的玻片架。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的裝置，其中，所述玻片架放置在所述內(nèi)部框架中，并且所述預(yù)處理容器設(shè)置有架導(dǎo)引，所述架導(dǎo)引引導(dǎo)所述玻片架進(jìn)入所述容器和所述內(nèi)部框架內(nèi)的適當(dāng)位置。
65.根據(jù)權(quán)利要求58~64所述的裝置，還包含水平移動(dòng)條，所述水平移動(dòng)條能夠從所述預(yù)處理容器的頂部除去至少一部分的兩相系統(tǒng)。
【文檔編號(hào)】G01N1/30GK103930761SQ201280010677
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月28日
【發(fā)明者】S·H·馬蒂森, S·尼爾森 申請(qǐng)人:丹麥達(dá)科有限公司