白細胞的分類計數(shù)方法、白細胞分類試劑盒及白細胞分類試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供可分類計數(shù)正常白細胞，并且能進行母細胞和非典型淋巴細胞的判別的白細胞的分類計數(shù)方法。白細胞的分類計數(shù)方法包括，將活體樣品，染色核酸的第1試劑，用于使紅細胞溶血，給白細胞的細胞膜造成能透過熒光染料的程度的損傷的陽離子性表面活性劑及非離子性表面活性劑，以及，含有20mM以上50mM以下的濃度的芳香族的有機酸的第2試劑混合而制備測定樣品的步驟；通過給測定樣品照射光取得發(fā)生的散射光信息及熒光信息的步驟；基于取得到的散射光信息及熒光信息，分類活體樣品中的白細胞，區(qū)別檢測母細胞和非典型淋巴細胞的步驟；其中，當?shù)?試劑中的芳香族的有機酸的濃度是20mM以上、不足30mM時，第2試劑的pH是5.5以上6.4以下，當是30mM以上50mM以下時，pH是5.5以上7.0以下。
【專利說明】白細胞的分類計數(shù)方法、白細胞分類試劑盒及白細胞分類試劑
【【技術領域】】
[0001]本發(fā)明涉及分類計數(shù)活體樣品中的白細胞的方法。本發(fā)明還步及用于分類計數(shù)活體樣品中的白細胞的白細胞分類試劑盒及白細胞分類試劑。
【【背景技術】】
[0002]正常的白細胞通常被分類為淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞及嗜堿性粒細胞的5種。在正常的末梢血中，這些的血細胞各自以一定的比例存在。但是，當受試者存在疾病時，特定的血細胞數(shù)增加或減少。所以，在臨床檢查的領域，通過進行白細胞的分類計數(shù)，可得對疾病的診斷極其有用的信息。
[0003]在造血器腫瘤、病毒感染癥等的疾病中，出現(xiàn)在正常的末梢血液中不存在的細胞。例如，在急性的白血病中，在末梢血液中出現(xiàn)作為未成熟的白細胞的“母細胞(成髓細胞:myeloblast、成淋巴細胞:lymphoblast)”。另一方面，在病毒感染癥、藥物過敏等中，由抗原刺激而在末梢血液中出現(xiàn)作為活化的淋巴細胞的〃非典型淋巴細胞(atypicallymphocyte) 〃。從末梢血液中區(qū)別檢測非典型淋巴細胞和母細胞，在進行疾病的篩選或診斷中極其有用。
[0004]近年、市售應用流式細胞術的原理的各種的自動血細胞計數(shù)裝置。由那樣的裝置，可自動進行樣品中的血細胞的分類計數(shù)。另外，用于由自動血細胞計數(shù)裝置的測定的血細胞分類試劑也有市售。使用這樣的試劑用自動血細胞計數(shù)裝置測定待測樣品，在各自散點圖上的指定的區(qū)域出現(xiàn)檢測的各血細胞的信號。
[0005]所述技術中多少知道如上述一樣的血細胞分類試劑。例如，在專利文獻I中記載了可分類計數(shù)異常白細胞和正常白細胞的兩方的方法。在該方法中，使用將特異性地染色RNA的染色液，和含陽離子性表面活性劑及非離子性表面活性劑的溶血劑組合而成的試劑盒。另外，在專利文獻2記載了分類計數(shù)正常白細胞，并且檢測異常白細胞的方法。在該方法中，使用包含含有指定的熒光染料的染色液，和含陽離子性表面活性劑及非離子性表面活性劑的溶血劑的試劑。
[0006]【現(xiàn)有技術文獻】
[0007]【專利文獻】
[0008]專利文獻1:專利第4248017號公報
[0009]專利文獻2:美國專利申請第2009/0023129號
【
【發(fā)明內容】
】
[0010]【發(fā)明要解決的技術課題】
[0011]如上所述，在從受試者得到的待測樣品中，有除了正常白細胞之外，還包含母細胞及非典型淋巴細胞等異常白細胞的情況。
[0012]但是，在使用專利文獻I及專利文獻2的試劑的方法中，作為異常白細胞的母細胞及非典型淋巴細胞的信號均出現(xiàn)在散點圖上的大致相同的區(qū)域，所以有難以區(qū)別檢測母細胞和非典型淋巴細胞的情況。
[0013]本發(fā)明以提供可分類計數(shù)正常白細胞，并且能區(qū)別檢測母細胞和非典型淋巴細胞的白細胞的分類計數(shù)方法作為目的。本發(fā)明另外，以提供可分類計數(shù)正常白細胞，并且能區(qū)別檢測母細胞和非典型淋巴細胞的白細胞分類試劑盒及白細胞分類試劑作為目的。
[0014]【解決課題的技術方案】
[0015]在由使用以往的白細胞分類試劑的流式細胞儀的測定中，母細胞及非典型淋巴細胞的信號在散點圖上出現(xiàn)在出現(xiàn)正常淋巴細胞及正常單核細胞的信號的區(qū)域的近邊或與該區(qū)域重復的區(qū)域。本發(fā)明人考慮了，是否通過將出現(xiàn)正常淋巴細胞的信號的區(qū)域和出現(xiàn)正常單核細胞的信號的區(qū)域隔開，可分離異常白細胞的信號和正常白細胞的信號，從而可提高異常白細胞的檢測靈敏度。
[0016]從而，本發(fā)明人對于能隔開出現(xiàn)正常淋巴細胞的信號的區(qū)域和出現(xiàn)正常單核細胞的信號的區(qū)域的白細胞分類方法進行檢查。結果，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過使芳香族的有機酸的濃度和試劑的PH成為指定的組合，能提高異常白細胞的檢測精度，區(qū)別檢測母細胞和非典型淋巴細胞，從而完成本發(fā)明。[0017]即，本發(fā)明提供白細胞的分類計數(shù)方法，其包括:
[0018]將活體樣品，染色核酸的第I試劑，用于使紅細胞溶血，給白細胞的細胞膜造成能透過上述熒光染料的程度的損傷的陽離子性表面活性劑及非離子性表面活性劑，以及含有20mM以上50mM以下的濃度的芳香族的有機酸的第2試劑混合而制備測定樣品的步驟；
[0019]向制備的測定樣品照射光，取得這時發(fā)生的散射光信息及熒光信息的步驟；及
[0020]基于取得到的散射光信息及熒光信息，將上述活體樣品中的白細胞分類，同時區(qū)別檢測母細胞和非典型淋巴細胞的步驟；
[0021]其中，
[0022]當上述第2試劑中的芳香族的有機酸的濃度是20mM以上、不足30mM時，上述第2試劑的pH是5.5以上6.4以下，
[0023]當上述第2試劑中的芳香族的有機酸的濃度是30mM以上50mM以下時，上述第2試劑的pH是5.5以上7.0以下。
[0024]本發(fā)明另外提供白細胞分類試劑盒，其包含:含有能染色核酸的熒光染料的第I試劑，用于使紅細胞溶血，給白細胞的細胞膜造成能透過上述的熒光染料的程度的損傷的陽離子性表面活性劑及非離子性表面活性劑，以及含有20mM以上50mM以下的濃度的芳香族的有機酸的第2試劑，其中當該第2試劑中的芳香族的有機酸的濃度是20mM以上、不足30mM時，該第2試劑的pH是5.5以上6.4以下，當該第2試劑中的芳香族的有機酸的濃度是30mM以上50mM以下時，該第2試劑的pH是5.5以上7.0以下。
[0025]本發(fā)明再提供白細胞分類試劑，其特征在于為含能染色核酸的熒光染料，陽離子性表面活性劑，非離子性表面活性劑，和芳香族的有機酸的白細胞分類試劑，當試劑中含的芳香族的有機酸的濃度是20mM以上50mM以下，芳香族的有機酸的濃度是20mM以上、不足30mM時，pH是5.5以上6.4以下，當芳香族的有機酸的濃度是30mM以上50mM以下時，pH是5.5以上7.0以下。
[0026]【發(fā)明效果】[0027]由本發(fā)明的白細胞的分類計數(shù)方法、白細胞分類試劑盒及白細胞分類試劑，可分類計數(shù)正常白細胞，并且可區(qū)別檢測母細胞和非典型淋巴細胞。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0028]【圖1】是使用本發(fā)明的白細胞分類試劑盒測定正常的血液待測樣品時的散點圖及其模式圖。
[0029]【圖2】是使用實施例2的各試劑測定含形態(tài)異常的淋巴細胞的血液待測樣品時的散點圖。
[0030]【圖3】是使用實施例3的各試劑測定含異常白細胞的血液待測樣品時的散點圖。
[0031]【圖4】是使用實施例3的各試劑測定含異常白細胞的血液待測樣品時的散點圖。
[0032]【圖5】是使用實施例4的各試劑測定含異常白細胞的血液待測樣品時的散點圖。
[0033]【圖6】是使用實施例5的各試劑測定正常的血液待測樣品時的散點圖。
[0034]【實施方式】
[0035]在本發(fā)明的實施方式中，活體樣品只要是含白細胞的體液樣品，就不特別限定。作為活體樣品，可舉出例如，由從哺乳動物、優(yōu)選為人采集的血液、骨髓液、尿、及，成分輸血等采集的樣品等。另外，活體樣品是有含異常白細胞的可能性的樣品也可。在本發(fā)明中，白細胞包括正常的白細胞和異常白細胞。正常的白細胞，通常被分類為淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、及,嗜酸性粒細胞以外的粒細胞、的4種、或者被分類為淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、及，嗜堿性粒細胞的5種。
[0036]在本說明書中，異常白細胞通常是指，末梢血中不存在的白細胞。作為那樣的異常白細胞，可舉出例如，非典型淋巴細胞及母細胞等。非典型淋巴細胞是指，由抗原刺激活化的淋巴細胞，對于刺激反應而形態(tài)發(fā)生變化的細胞。此非典型淋巴細胞在有病毒感染癥、藥物過敏等的疾病的患者的末梢血中出現(xiàn)。母細胞是指，成髓細胞(myeloblast)及成淋巴細胞(Iymphblast)等的未成熟的白細胞。成髓細胞在急性骨髓性白血病的患者的末梢血中出現(xiàn)，成淋巴細胞在急性淋巴性白血病的患者的末梢血中出現(xiàn)。
[0037]接下來，對于在本發(fā)明的白細胞的分類計數(shù)方法中使用的白細胞分類試劑盒進行說明。
[0038]本發(fā)明的白細胞分類試劑盒(以下，有時稱作“試劑盒”。)是含第I試劑和第2試劑的試劑盒。接下來，對于試劑盒的各試劑進行說明。
[0039]【第I試劑】
[0040]本發(fā)明的試劑盒中含的第I試劑含能染色核酸的熒光染料。在本發(fā)明的實施方式中，第I試劑是用于將由后述的第2試劑處理的活體樣品中的有核細胞的核酸熒光染色的試劑。通過將活體樣品用第I試劑處理，將正常白細胞及上述的異常白細胞等的有核酸的血細胞染色。
[0041]在本發(fā)明的實施方式中，熒光染料只要是可染色核酸的染料就不特別限定，可根據從光源照射的光的波長適宜選擇。作為那樣的熒光染料，可舉出例如，碘化丙啶、溴化乙錠、乙唳-吖唳異源二聚體、乙唳二疊氮基、乙唳同源二聚體-1、乙唳同源二聚體-2、乙唳單疊氮基、三亞甲基雙[[3-[[4-[[(3_甲基苯并噻唑-3-鎗)-2-基]亞甲基]-1,4-二氫喹啉]-1-基]丙基]二甲基銨].四碘化物(Τ0Τ0-1)、4-[(3-甲基苯并噻唑-2(3H)_亞基)甲基]-l-[3-(三甲基銨)丙基]喹啉鎗.二碘化物(T0-PR0-1)、N，N，N’，N’ -四甲基-N，N '-雙[3- [4- [3- [ (3-甲基苯并噻唑-3-鎗)_2_基]-2-亞丙烯基]-1，4- 二氫喹啉-1-基]丙基]-1，3-丙烷二銨.四碘化物(Τ0Τ0-3)、2-[3-[[1-[3-(三甲基銨)丙基]-1，4-二氫喹啉]-4_亞基]-1-丙烯基]-3_甲基苯并噻唑-3-鎗.二碘化物(T0-PR0-3)、及，以下的通式(I)所表示的熒光染料等。在它們之中，通式(I)所表示的熒光染料是優(yōu)選的。
[0042]【化I】
[0043]
【權利要求】
1.白細胞的分類計數(shù)方法，其包括: 將活體樣品，染色核酸的第I試劑，用于使紅細胞溶血，給白細胞的細胞膜造成能透過上述熒光染料的程度的損傷的陽離子性表面活性劑及非離子性表面活性劑，以及含有20mM以上50mM以下的濃度的芳香族的有機酸的第2試劑混合而制備測定樣品的步驟； 向制備的測定樣品照射光，取得這時發(fā)生的散射光信息及熒光信息的步驟；及基于取得到的散射光信息及熒光信息，將上述活體樣品中的白細胞分類，同時區(qū)別檢測母細胞和非典型淋巴細胞的步驟； 其中， 當上述第2試劑中的芳香族的有機酸的濃度是20mM以上、不足30mM時，上述第2試劑的pH是5.5以上6.4以下， 當上述第2試劑中的芳香族的有機酸的濃度是30mM以上50mM以下時，上述第2試劑的pH是5.5以上7.0以下。
2.權利要求1所述的方法，其中上述芳香族的有機酸是選自下列的至少一種:芳香族羧酸、芳香族磺酸及它們的鹽。
3.權利要求1或2所述的方法，其中上述第2試劑中的芳香族的有機酸的濃度是40mM以上50mM以下。
4.權利要求1或2所述的方法，其中上述第2試劑中的pH是5.5以上6.2以下。
5.權利要求1或2所述的方法，其中上述散射光信息是側方散射光信息。
6.權利要求1或2所述的方法`，其中上述陽離子性表面活性劑是季銨鹽型表面活性劑、或者吡啶鎗鹽型表面活性劑。
7.權利要求1或2所述的方法，其中上述非離子性表面活性劑是以下的通式(VI)所表示的聚氧乙烯系統(tǒng)非離子表面活性劑:
R1-R2-(CH2CH2O)n-H (VI) 式中， R1是碳原子數(shù)8-25的烷基、烯基或炔基； R2是氧原子、-C00-或—.η是10-50的整數(shù)。
8.白細胞分類試劑盒，其含: 含有能染色核酸的熒光染料的第I試劑， 用于使紅細胞溶血，給白細胞的細胞膜造成能透過上述熒光染料的程度的損傷的陽離子性表面活性劑及非離子性表面活性劑，以及 含有20mM以上50mM以下的濃度的芳香族的有機酸的第2試劑， 其中， 當上述第2試劑中的芳香族的有機酸的濃度是20mM以上、不足30mM時，上述第2試劑的pH是5.5以上6.4以下， 當上述第2試劑中的芳香族的有機酸的濃度是30mM以上50mM以下時，上述第2試劑的pH是5.5以上7.0以下。
9.權利要求8所述的試劑盒，其中上述芳香族的有機酸是選自下列的至少一種:芳香族羧酸、芳香族磺酸及它們的鹽。
10.權利要求8或9所述的試劑盒，其中上述第2試劑中的芳香族的有機酸的濃度是40mM以上50mM以下。
11.權利要求8或9所述的試劑盒，其中上述第2試劑中的pH是5.5以上6.2以下。
12.權利要求8或9所述的試劑盒，其中上述陽離子性表面活性劑是季銨鹽型表面活性劑、或者吡啶鎗鹽型表面活性劑。
13.權利要求8或9所述的試劑盒，其中上述非離子性表面活性劑是以下的通式(VI)所表示的聚氧乙烯系統(tǒng)非離子表面活性劑:
R1-R2-(CH2CH2O)n-H (VI) 式中， R1是碳原子數(shù)8~25的烷基、烯基或炔基； R2是氧原子、-C00-或
14.白細胞分類試劑，其特征在于，其是含能染色核酸的熒光染料，陽離子性表面活性劑，非離子性表面活性劑，和芳香族的有機酸的白細胞分類試劑， 上述試劑中含的芳香族的有機酸的濃度是20mM以上50mM以下， 當上述芳香族的有機酸的濃度是20mM以上、不足30mM時，pH是5.5以上6.4以下， 當上述芳香族的有機酸的濃度是30mM以上50mM以下時，pH是5.5以上7.0以下。
【文檔編號】G01N33/49GK103460041SQ201280016125
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年4月18日 優(yōu)先權日:2011年4月28日
【發(fā)明者】大塚佐緒里, 八町和樹, 水上利洋, 小國振一郎 申請人:希森美康株式會社